Summary
一种方法隔离submitochondrial的富集大鼠脑F1FO ATP合酶复合囊泡。这些囊泡允许F1FO ATP酶的活性配合物及其调制使用膜片钳记录技术的研究。
Abstract
线粒体都参与许多重要的细胞功能，包括新陈代谢，生存，发展和钙信号2。的两个最重要的线粒体功能相关的高效生产的ATP，通过氧化磷酸化作用，细胞的能量货币，以及调解的程序性细胞死亡的信号3。
主要负责产生ATP的酶F1FO ATP合成酶，也称为ATP合酶4-5。近年来，线粒体的凋亡细胞和坏死细胞死亡的作用已经受到人们的关注。细胞凋亡，如Bax的BCL-2家族蛋白进入线粒体外膜，低聚和通透的外膜，促凋亡因子释放到细胞质6。在经典的坏死性细胞死亡中，例如，所产生的局部缺血或神经元的兴奋性毒性，LARGE，监管不力，在基体中的钙有助于增加内膜毛孔，线粒体通透性转换孔或mPTP的开放。此去极化内膜，促进外膜破裂，释放促凋亡因子和代谢功能紊乱，导致渗透压的变化。许多蛋白质，包括了Bcl-xL 7与F1FO ATP合成酶，调节其功能。 Bcl-xL的直接交互的F1FO ATP合酶β亚基，这种相互作用降低泄漏电导在F1FOATPasecomplex内的，增加的H +净运输期间F1FO F1FO ATPase活性8，从而增加线粒体效率。要研究ATP合成酶的活性和调制，我们孤立从啮齿动物脑submitochondrial囊泡（SMVS）含有F1FO ATP酶的。 SMVS保留F1FO ATP酶的结构和功能完整性所示在Alavian 等 。在这里，我们描述了一种方法，我们已经成功地用于隔离SMVS大鼠脑和我们划定膜片钳技术分析通道活性（离子泄漏电导）SMVS。
Protocol
1。脑线粒体隔离（ 改编自布朗MR等。9）
- 牺牲大鼠批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的使用方法。
- 切头斩首的动物，切开皮肤，暴露颅骨。
- 轻轻地打开颅骨切割用剪刀或咬骨钳。取出大脑。
- 百果精细小脑脑无隔离缓冲（ 见表1），并将其转移到5毫升的玻璃/聚四氟乙烯匀浆器（设备列表）。
- 轻轻均质组织10次（无气泡），约5分钟。
- 在1500×g离心样品10分钟，在4°C在台式离心机。
- （线粒体和突触体）保存上清，弃沉淀（核材料和细胞碎片）。在16,000×g离心10分钟，在4°C，在台式离心机。
- 丢弃上清，重新悬浮颗粒在500微升的隔离缓冲。破坏与细胞破坏容器（设备列表）突触。施加压力为1,200 psi 10分钟，随后迅速减压。
- 到聚蔗糖梯度层的混合物（ 见表2），SW-50.1转子和离心的地方126,500×g为20分钟，在4°C在超速离心机（设备列表）。沉淀纯化的线粒体中，层之间的不同密度的聚蔗糖是不间断的突触体。
- 洗净颗粒隔离缓冲离心16,000×g为10分钟，在4°C在台式离心机。
2。 Submitochondrial囊泡（SMV）隔离（改编自陈等10）
- 重悬在200μl结合，用等体积的1％毛地黄皂苷的隔离缓冲线粒体允许坐在在冰上放置15分钟。
- 添加更多的隔离浅黄色er和离心机在16000×g为10分钟，在4°C在台式离心机。两次做到这一点。
- 重新悬浮颗粒在200微升隔离缓冲和10％芦布若尔PX（C12E9）加入2μl。混合，并允许坐在冰上15分钟。
- 层混合物加入到隔离缓冲，在SW-50.1转子和离心机在182,000×g在4℃1小时。
- 洗净最终沉淀在台式离心机隔离缓冲16,000×G离心10分钟，在4°C
3。电生理记录
- 一个典型的的电生理钻机包括一个放大器，一个Digidata 1440A的模拟 - 数字转换器接口，在与操纵器软件pClamp10.0，显微镜，振动隔离表，法拉第笼配备一台PC电脑。
- 硼硅玻璃毛细管插入火焰/褐色微管拖轮型号P-87。吸管拉马程序进行了优化，产生与80〜100MΩ的电阻之间的吸液管。
- SMVS被放置在细胞内的生理溶液（在录制过程中在适当的时间被添加ATP）（ 表3）。膜片钳移液器都充满了相同的解决方案（ATP）。的记录，则通过形成千兆欧姆SMVS密封件置于在室温下。尼康或蔡司倒置显微镜相衬显微镜囊泡的可视化。
- 膜电位保持在电压范围从-100 mV +100 mV为10秒的期间。录音被过滤在5 kHz使用放大器电路。杂散电或非特异性噪声小于1 PA水平是可取的成功记录。
- 与的10.0 Clampfit软件例如，以确定的频率和幅度的单信道事件数据进行分析。电压依赖性决定绘制电流电压关系。
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Representative Results
我们的协议的第一步骤中可以分离纯化的线粒体，如在图1中所示的Western印迹。在图2中示出一个脑源性submitochondrial的囊泡补丁记录的一个例子。使用内而外的补丁配置，我们展示了调制由ATP通道的活性。控制（CTL）录音（左）显示多导通道活动的平均电导为600 PS的峰值。立刻被减少后1毫米ATP洗澡。三磷酸腺苷的整体效果是SMVS的补丁以浓度依赖的方式减少的电导。要测量的效率F1FO ATP酶在分离后，我们测量到SMVS H +离子的运动响应ATP水解， 如图3所示，测量排除SMV-H +指示灯ACMA荧光强度减少。 ATP敏感的H +离子螯合添加后提高到SMVS比赛进行的ATP。此法可用于测量的H +离子吸收的效率。效率较低SMVS积累H +离子或较慢的较小峰值。例如，H +离子的固碳衰减此外，Bcl-xL的抑制剂和FCCP（Alavian 等人 ，2011）。
| 终浓度 | |
| 蔗糖 | 250毫米 |
| HEPES | 20毫米 |
| EDTA | 1毫米 |
| BSA | 0.5％ |
表1中。隔离缓冲。
| 聚蔗糖 | 22毫升20％> |
| 蔗糖 | 12毫升1 M |
| EDTA | 18.75微升0.1 M |
| 的Tris-HCl | 375微升1 M（pH值7.4） |
| 顶层聚蔗糖7.5％ | |
| 聚蔗糖股票 | 10毫升 |
| 隔离缓冲 | 6毫升 |
| 底层10％聚蔗糖 | |
| 聚蔗糖股票 | 15.5毫升 |
| 隔离缓冲 | 2.5毫升 |
表2中。聚蔗糖股票。
| 氯化钾 | 120毫米 |
| 氯化钠 | 8毫 |
| EGTA | 0.5毫米 |
| HEPES | 10mM的 |
| pH值 | 7.3 |
表3中。内部解决方案重刑。
图1。代表性的溶胞产物的免疫印迹从胞液和线粒体纯化上面的面板显示了一个使用胞浆蛋白GAPDH抗体的免疫印迹。底部面板中示出了使用对线粒体中肠子膜蛋白CoxIV的抗体，该抗体的免疫印迹。
图2。两个有代表性的膜片钳记录，除了之前和之后的1毫米ATP。保持电位+70 mV的虚线表示0 pA的。每个跟踪记录，持续10秒，并有10秒之间的痕迹。
图3。的荧光强度的变化的实施例的痕迹ACMA指示剂SMVS的存在，随着时间的推移，在没有（黑色线）和存在的ATP（红色曲线）。
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Discussion
描述的方法，本文纯线粒体使隔离结束时，步骤1和步骤的submitochondrial囊泡（SMVS）在步骤2之后从全脑的细胞此方法phenotypes.SMVspurified的没有区别，基本上不含污染的其它亚细胞器所示图1和我们以前的工作（Alavian KN 等 。8），并保留其结构和功能的完整性，在冷冻之前。冻融后，分离线粒体或SMVS用于录音和生化检测，但没有呼吸的研究。
此外，此方法可以用来隔离肝线粒体使用相同的步骤。由于线粒体和SMVS往往镀到电生理记录室时，形成集群，应注意装样，因为过大的结块或过度稀释可能会降低的可能性TY形成密封。此外，应注意的几个技术细节开始前的隔离。这是至关重要的，使用干净的工具，并让他们在冰上。所有程序都必须在冰上进行，所有的离心分离机设置到4℃。正确准备聚蔗糖梯度实验成功的关键。创建一个完美的分离两者之间的聚蔗糖浓度提高亚细胞组分的纯度。
这种技术的一个限制征收最终量的蛋白质，它可以是小的，如果从一个特定的大脑区域是理想的样品例如从黑质致密部或纹状体线粒体。池从一些动物的样品可能是必要的，以提高总收获量的蛋白质。
线粒体或SMVS分装在1毫克/毫升，保存于-80℃，数个月的录音，它们是稳定的，但是，它是preferablE不重新冻结线粒体样本解冻后。通过这种方法纯化的囊泡ATP合酶对学习，使用不同的方法，如膜片钳记录，生化技术和其他功能的研究。有了这个准备，我们可以分析药物或小分子上F1FO ATP酶的活性和结构的影响。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
