Summary
Um método para isolar vesículas submitocondriais enriquecidas em F1FO ATP sintase a partir de complexos de cérebro de rato é descrito. Essas vesículas permite o estudo da actividade de F1FO complexo ATPase ea sua modulação por meio da técnica de gravação de patch clamp.
Abstract
As mitocôndrias são envolvidos em várias funções celulares importantes incluindo o metabolismo, uma sobrevivência, desenvolvimento e, a sinalização de cálcio 2. Duas das mais importantes funções mitocondriais estão relacionadas com a produção eficiente de ATP, a moeda de energia da célula, pela fosforilação oxidativa, e na mediação de sinais para a morte programada das células 3.
A enzima primariamente responsável pela produção de ATP é a F1FO-ATP sintase, também chamada ATP sintase 4-5. Nos últimos anos, o papel da mitocôndria na morte celular por apoptose e necrose tem recebido uma atenção considerável. Na morte celular por apoptose, Bcl-2, tais como as proteínas da família Bax entrar na membrana mitocondrial externa, e oligomerizar permeabilizar a membrana externa, libertando factores pró-apoptóticos para o citosol 6. Na morte celular necrótica clássico, tal como a produzida por isquemia ou excitotoxicidade em neurónios, um large, aumento pouco regulada em matriz de cálcio contribui para a abertura de um poro da membrana interior, a poro de transição da permeabilidade mitocondrial ou PTPm. Este despolariza a membrana interna e provoca deslocamentos osmóticos, contribuindo para a ruptura da membrana externa, a libertação de factores pró-apoptóticos e disfunção metabólica. Muitas proteínas, incluindo Bcl-xL 7 interagir com F1FO ATP sintase, modulando a sua função. Bcl-xL, interage directamente com a subunidade beta da sintase ATP F1FO, e esta interacção diminui uma condutância de vazamento dentro do F1FOATPasecomplex, aumentando a rede de transporte de H + por F1FO durante F1FO ATPase 8 e aumentando assim a eficiência mitocondrial. Para o estudo da atividade e modulação da ATP sintase, que isolado do cérebro de roedores submitocondriais vesículas (SMVs) contendo F1FO ATPase. Os SMVs manter a integridade estrutural e funcional do F1FO ATPase como mostrado na Alavian et ai. Aqui, nós descrevemos um métodoque temos utilizado com sucesso no isolamento de SMVs de cérebro de rato e delinear a técnica de patch clamp para analisar a actividade de canal (ião vazamento condutância) dos SMVs.
Protocol
1. Cérebro mitocondrial Isolation (Adaptado de Brown MR et al. 9)
- Sacrificar o rato usando métodos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).
- Corte a cabeça do animal por decapitação, cortar a pele e expor o crânio.
- Abra o crânio delicadamente cortando com uma tesoura ou rongeur. Remover o cérebro.
- Picar finamente o cérebro sem cerebelo em tampão de isolamento (ver Tabela 1) e transferi-lo para a 5 ml de vidro / teflon homogeneizador (veja lista de equipamentos).
- Homogeneizar o tecido suavemente 10 vezes (sem bolhas), cerca de 5 min.
- Centrifugar amostra a 1500 × g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada.
- Salve o sobrenadante (mitocondrial e sinaptossomas) e descartar o pellet (material nuclear e de restos celulares). Centrifugar a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada.
- Descartarsobrenadante e re-suspensão da pelota em 500 ul de tampão de isolamento. Disrupt sinaptosomas com uma embarcação rompimento celular (veja lista de equipamentos). Aplicar uma pressão de 1200 psi, durante 10 min, seguido por descompressão rápida.
- Camada a mistura em gradientes de Ficoll (ver Tabela 2), em lugar do rotor SW-50.1 e centrifugar a 126.500 x g durante 20 min a 4 ° C numa ultracentrifugadora (ver lista de equipamento). O sedimento é purificado a mitocôndria, a camada entre as diferentes densidades de Ficoll sinaptossomas é ininterrupto.
- Lavar pelete por centrifugação em tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada.
2. Submitocondriais vesículas (SMV) Isolamento (Adaptado de Chan et al. 10)
- Re-suspender as mitocôndrias em 200 ul de tampão de isolamento combinada com um volume igual de 1% de digitonina e permitir a sentar-se em gelo durante 15 min.
- Adicionar mais isolamento Buffer e centrifugar a 16000 x g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada. Faça isso duas vezes.
- Re-suspender o pellet em 200 mL tampão de isolamento e adicionar 2 mL de 10% Lubrol PX (C12E9). Misture e permitir a sentar-se no gelo durante 15 min.
- Camada de mistura em tampão de isolamento, no lugar do rotor SW-50.1 e centrifugar a 182.000 x g a 4 ° C durante 1 hora.
- Lavagem final dos aglomerados por centrifugação numa centrífuga de mesa superior em tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C.
3. A gravação eletrofisiológico
- Um equipamento típico electrofisiologia inclui um amplificador, um computador PC 1440A equipado com um interface de conversor de analógico para digital Digidata em conjunto com o software pClamp10.0, manipuladores, um microscópio, uma mesa de isolamento de vibrações, gaiola de Faraday.
- Tubos capilares de vidro de borosilicato são inseridos em um Flaming / Brown Micropipeta Puller modelo P-87. Um programa de pipeta-extrator é otimizado paragerar pipetas com resistências entre 80 a 100 mohms.
- SMVs são colocadas numa solução fisiológica intracelular (ATP é adicionado no momento apropriado, durante a gravação) (Tabela 3). Patch clamp pipetas são cheias com a mesma solução (sem ATP). As gravações são feitas através da formação de um selo giga-ohm para SMVs à temperatura ambiente. As vesículas são visualizadas por microscopia de contraste de fase com um microscópio invertido Nikon ou Zeiss.
- O potencial de membrana é mantida a tensões que variam de -100 mV a +100 mV, por períodos de 10 segundos. As gravações são filtradas em 5 kHz utilizando os circuitos de amplificador. Nível de ruído elétrico ou não-específico de rua de menos de 1 pA são desejáveis para a gravação bem sucedida.
- Os dados são analisados com o software Clampfit 10.0, por exemplo, para determinar a frequência e amplitude de eventos de canal único. Dependência de tensão é determinado traçando uma relação de tensão atual.
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Representative Results
O primeiro passo do nosso protocolo permite o isolamento de mitocôndrias purificadas como mostrado por Western blot na figura 1. Na Figura 2 é mostrado um exemplo de uma gravação de remendo vesícula submitocondriais derivado do cérebro. Usando a configuração de patch de dentro para fora, demonstramos a atividade do canal modulado pela ATP. O controle (CTL) de gravação (esquerda) mostra a atividade multi-canal de condutância com uma condutância pico de 600 pS em média. que foi imediatamente reduzida por adição de 1 mM de ATP para o banho. O efeito global do ATP é a diminuição da condutância de manchas SMVs de uma forma dependente da concentração. Para medir a eficiência de F1FO ATPase após isolamento, medimos o movimento de iões de H + na SMVs em resposta a hidrólise de ATP, como mostrado na Figura 3, a medição da diminuição da intensidade da fluorescência da SMV-excluídos H + indicador ACMA. ATP-sensível seqüestro de íons H + em SMVs é reforçada após adicionarition de ATP. Este ensaio pode ser usado para medir a eficácia de sequestração do ião H +. SMVs menos eficiente irá acumular H + ou iões mais lentamente para um valor de pico menor. Por exemplo, H + de sequestração do ião é atenuado pela adição de inibidores da Bcl-xL e FCCP (Alavian et ai., 2011).
| Concentração final | |
| Sacarose | 250 Mm |
| Hepes | 20 Mm |
| EDTA | 1 Mm |
| BSA | 0,5% |
Tabela 1. Tampão de isolamento.
| Ficoll | 22 ml de 20%> |
| Sacarose | 12 ml de 1 M |
| EDTA | 18,75 ul 0,1 M |
| Tris-HCl | 375 ul de 1 M (pH 7,4) |
| Camada superior de 7,5% de Ficoll | |
| Ficoll estoque | 10 ml |
| Tampão de isolamento | 6 ml |
| Camada Inferior a 10% de Ficoll | |
| Ficoll estoque | 15,5 ml |
| Tampão de isolamento | 2,5 ml |
Tabela 2. Ficoll stock.
| KCl | 120 mM |
| NaCl | 8mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| Hepes | 10 mM |
| pH | 7.3 |
Tabela 3. Interno Solução.
Figura 1. Representante de imunotransferência de lisado purificado do citossol e mitocôndrias. O painel superior mostra uma imunotransferência, utilizando um anticorpo contra a proteína citosólica GAPDH. O painel inferior mostra uma imunotransferência, utilizando um anticorpo contra a membrana mitocondrial innner CoxIV proteína.
Figura 2. Dois patch de gravação braçadeira representante antes e após a adição de ATP 1 mM. Potencial de exploração é +70 mV. A linha tracejada representa 0 pA. Cada traço é gravado por 10 segundos e há 10 seg entre os traços.
Figura 3. Exemplo vestígios de mudanças de intensidade de fluorescência deo indicador ACMA ao longo do tempo, na presença de SMVs e na ausência (traço negro) e na presença (traço vermelho) do ATP.
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Discussion
Os métodos aqui descritos permitem o isolamento de mitocôndrias puro no fim da etapa 1 e vesículas (submitocondriais SMVs) após a etapa 2 a partir de cérebro inteiro sem distinção de célula phenotypes.SMVspurified por este método são essencialmente isentos de contaminação por outros organelos subcelulares, como mostrado na A Figura 1 e o nosso trabalho anterior (Alavian KN et al. 8) e mantêm a sua integridade estrutural e funcional antes da congelação. Após congelação e descongelação, mitocôndrias isoladas ou SMVs são utilizados para gravações e ensaios bioquímicos, mas não para os estudos respiratórios.
Este método, além disso podem ser utilizados para isolar as mitocôndrias do fígado utilizando os mesmos passos. Porque as mitocôndrias e SMVs tendem a formar agrupamentos quando semeadas na câmara de gravação eletrofisiológico, deve ser dada atenção ao carregamento da amostra, como uma diluição excessiva aglomeração ou excessiva pode diminuir a possibility de formação de selo. Além disso, deve ser dada atenção a vários detalhes técnicos antes de começar o isolamento. É fundamental usar ferramentas limpas e mantê-los no gelo. Todos os procedimentos devem ser realizados em gelo e todas as centrífugas definido para 4 ° C. Preparando o gradiente de Ficoll corretamente é fundamental para uma experiência bem sucedida. Criando uma separação perfeita entre as duas concentrações de Ficoll aumenta a pureza das fracções subcelulares.
Uma limitação desta técnica é imposta pelo valor final de proteína, que pode ser pequeno, se a amostra a partir de uma região específica do cérebro é desejada, por exemplo mitocôndrias de substantia nigra pars compacta ou corpo estriado. Pool de amostras a partir de vários animais podem ser necessários para aumentar a quantidade total de proteína colhida.
As mitocôndrias ou SMVs são aliquotadas em 1 mg / ml e armazenada a -80 ° C e são estáveis para as gravações para vários meses, no entanto, é preferable para não voltar a congelar a amostra mitocondrial após o descongelamento. Vesículas purificados por este método são úteis para estudar a ATP sintase, utilizando diferentes abordagens, tais como gravação de patch clamp, técnicas bioquímicas e outros estudos funcionais. Com esta preparação pode-se analisar os efeitos dos fármacos ou moléculas pequenas F1FO na actividade e estrutura de ATPase.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
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