Summary
Способе выделения пузырьков субмитохондриальных обогащенный F1FO АТФ-синтазы комплексов из мозга крысы описано. Эти пузырьки позволяют изучение активности АТФазы F1FO комплекса и его модуляции с использованием техники записи патч зажима.
Abstract
Митохондрии участвуют во многих важных клеточных функций, включая метаболизм, выживание 1, развитие и, кальциевой сигнализации 2. Два из наиболее важных функций митохондрий связаны с эффективного производства АТФ, энергия валюты из клетки, по окислительного фосфорилирования, и посредством сигналов запрограммированной клеточной смерти 3.
Фермент в первую очередь отвечает за производство АТФ F1FO-АТФ-синтазы, которая также называется АТФ-синтазы 4-5. В последние годы, роль митохондрий в апоптозе и некротической гибели клеток получила значительное внимание. В апоптоза, BCL-2 семьи белки, такие как Bax введите митохондриальные наружной мембраны, олигомеризоваться и проницаемыми внешнюю мембрану, высвобождая проапоптотические факторов в цитозоль 6. В классическом некротической гибели клеток, такие как отходы ишемии или эксайтотоксичностью в нейронах, крупе, плохо регулируется увеличение матрицы кальций способствует открытию внутреннего пор мембраны, митохондриальных пор переход проницаемости или МРТР. Это деполяризует внутренней мембраны и вызывает осмотические сдвиги, способствующие разрыву внешней мембраны, выпуск проапоптотические факторы и метаболические дисфункции. Многие белки, включая Bcl-XL 7 F1FO взаимодействовать с АТФ-синтазы, модулирующей функции его. Bcl-X L непосредственно взаимодействует с бета-субъединицы АТФ-синтазы F1FO, и это взаимодействие уменьшается утечка проводимость в F1FOATPasecomplex, увеличение чистой переноса Н + на F1FO в течение F1FO АТФазы 8 и тем самым увеличивая митохондриальной эффективности. Для изучения активности и модуляция АТФ-синтазы, мы изолированы от грызунов мозговых пузырей субмитохондриальных (SMVs), содержащий F1FO АТФазы. SMVs сохранить структурную и функциональную целостность F1FO АТФазы, как показано на Alavian соавт. Здесь мы описываем способчто мы успешно используется для изоляции SMVs из мозга крысы, и мы разграничить технику патч зажим для анализа активности канала (ионная проводимость утечки) из SMVs.
Protocol
1. Мозг митохондриальной Изоляция (адаптировано из Браун MR и др.. 9)
- Жертвоприношение крысы с использованием методов одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC).
- Отрежьте голову животного путем обезглавливания, порезать кожу и выставить черепа.
- Откройте череп мягко путем разрезания ножницами или костными кусачками. Удалить мозга.
- Пропустить через мясорубку мелко мозг без мозжечка в Изоляции Buffer (см. таблицу 1) и передать его на 5 мл стекло / тефлоновый гомогенизатор (см. список оборудования).
- Гомогенизируют ткани мягко 10 раз (без пузырьков), примерно 5 мин.
- Центрифуга образца при 1500 х г в течение 10 мин при 4 ° С в настольная центрифуга.
- Сохранить супернатант (митохондриальная и синаптосомах) и отказаться от осадка (ядерных материалов и остатков клеток). Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С в настольная центрифуга.
- ОтбрасыватьНадосадочную жидкость и повторно приостанавливать осадок в 500 мкл буфера изоляции. Нарушить синаптосомах с сосудом разрушения клеток (см. список оборудования). Применяют давление 1200 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 минут с последующим быстрым декомпрессии.
- Слой смеси на Фиколл градиентов (см. таблицу 2), место в SW-50,1 ротора и центрифуге при 126500 × г в течение 20 мин при 4 ° С в ультрацентрифуге (см. список оборудования). Гранулы очищенных митохондрий, слой между различными плотности Ficoll является бесперебойное синаптосомах.
- Вымойте гранул путем центрифугирования в Изоляции буфера при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С в настольная центрифуга.
2. Субмитохондриальных пузырьки (SMV) Изоляция (адаптировано из Chan и соавт. 10)
- Повторное приостановить митохондрий в 200 мкл буфера Выделение смешивали с равным объемом 1% дигитонина и позволяют сидеть на льду в течение 15 мин.
- Добавить еще Изоляция БуффER и центрифуге при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С в настольная центрифуга. Сделайте это в два раза.
- Повторное приостановить осадок в 200 мкл буфера для изоляции и добавить 2 мкл 10% Lubrol PX (C12E9). Перемешать и дать сидеть на льду в течение 15 мин.
- Слой смеси на Выделение буфера, место в SW-50,1 ротора и центрифугируют при 182000 × г при 4 ° С в течение 1 часа.
- Вымойте конечный осадок путем центрифугирования в настольные центрифуги в Изоляции буфера при 16000 × г в течение 10 мин при 4 ° C.
3. Электрофизиологические записи
- Типичная установка электрофизиологии включает в себя усилитель, компьютер компьютер, оснащенный Digidata 1440A аналого-цифровой преобразователь интерфейса в сочетании с pClamp10.0 программное обеспечение, манипуляторы, микроскоп, стол виброизоляции, клетки Фарадея.
- Боросиликатного стекла капиллярные трубки вставляются в Flaming / коричневый микропипетки съемник Модель P-87. Пипетки съемник Программа оптимизирована длягенерировать пипетки с сопротивлением от 80 до 100 МОм.
- SMVs помещают в физиологический внутриклеточный раствор (добавляют АТФ в соответствующее время в процессе записи) (табл. 3). Пипетки патч зажим заполнены тем же раствором (без АТФ). Записи выполняются путем формирования гига-ом уплотнение на SMVs при комнатной температуре. Пузырьки визуализируются фазово-контрастной микроскопии с Nikon или инвертированный микроскоп Zeiss.
- Мембранный потенциал поддерживается при напряжении в диапазоне от -100 мВ до +100 мВ в течение периода 10 секунд. Записи фильтруют при 5 кГц при помощи схему усилителя. Уровень паразитных электрических или неспецифический шум меньше 1 мкА являются желательными для успешной записи.
- Данные анализируют с Clampfit 10,0 программного обеспечения, например, чтобы определить частоту и амплитуду одного события канала. Напряжение зависимость определяется путем построения нынешние отношения напряжения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первым шагом нашего протокола позволяет изолировать очищенной митохондрии, как показано методом вестерн-блоттинга на рисунке 1. На фиг.2 показан пример полученного из головного мозга субмитохондриальных записи патч везикул. Использование наизнанку патч конфигурации мы демонстрируем активности канала модулируется АТФ. Управления (CTL) записи (слева) показывает несколько проводимости активности канала с пиковой проводимости 600 мкСм в среднем. , который был немедленно снизилась после добавления 1 мМ АТФ в ванну. Общий эффект АТФ является уменьшение проводимости SMVs патчей в зависимости от концентрации. Для измерения эффективности F1FO АТФазы после выделения, мы измерили движение ионов Н + в SMVs в ответ на гидролиза АТФ, как показано на рисунке 3, измерения уменьшения интенсивности флуоресценции SMV-H + исключен показатель ACMA. АТФ-зависимых ион Н + секвестр в SMVs усиливается после добавленияition АТФ. Этот анализ может быть использован для измерения эффективности поглощения ион H +. Менее эффективный SMVs будет накапливаться ионы Н + медленнее или меньше пикового значения. Например ионов Н + поглощение ослабляется добавлением Bcl-X L и ингибиторы FCCP (Alavian соавт., 2011).
| Конечная концентрация | |
| Сахарозы | 250 мм |
| Hepes | 20 мм |
| ЭДТА | 1 мкм |
| BSA | 0,5% |
Таблица 1. Выделение буфера.
| Фиколл | 22 мл 20%> |
| Сахарозы | 12 мл 1 М |
| ЭДТА | 18,75 мкл 0,1 М |
| Трис-HCl | 375 мкл 1 М (рН 7,4) |
| Верхний слой 7,5% Фиколл | |
| Фиколл складе | 10 мл |
| Выделение буфера | 6 мл |
| Нижний слой 10% Ficoll | |
| Фиколл складе | 15,5 мл |
| Выделение буфера | 2,5 мл |
Таблица 2. Фиколл Stock.
| KCl | 120 мМ |
| NaCl | 8 мМ |
| ЭГТА | 0,5 мМ |
| Hepes | 10 мМ |
| рН | 7,3 |
Таблица 3. Внутренняя Солуции.
Рисунок 1. Представитель иммуноблот лизат очищали от цитозоле и митохондриях. Верхняя панель показывает результат иммуноблоттинга с использованием антител против белка цитозольного фермента. Нижняя панель показывает результат иммуноблоттинга с использованием антител против митохондриального мембранного белка CoxIV Innner.
Рисунок 2. Два представителя патч зажим записи до и после добавления 1 мМ АТФ. Холдинг потенциал +70 мВ. Пунктирная линия представляет 0 Па. Каждая трасса записывается в течение 10 сек и 10 сек между трассами.
Рисунок 3. Пример следы изменений интенсивности флуоресценции отИндикатор АСМА с течением времени в присутствии SMVs и в отсутствие (черные следы) и в присутствии (красная линия) АТФ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные здесь способы включить выделение чистой митохондрий в конце стадии 1 и субмитохондриальных везикулы (SMVs) после шага 2 от всего головного мозга без различия клетки phenotypes.SMVspurified этим методом, по существу свободный от загрязнения другими субклеточные органеллы, как показано На рисунке 1 и нашей предыдущей работе (Alavian К.Н. и соавт. 8) и сохраняют свою структурную и функциональную целостность перед замораживанием. После замораживания и оттаивания, изолированными митохондриями или SMVs используются для записи и биохимических анализов, но не для дыхательных исследований.
Этот способ более того может быть использован для выделения митохондрий из печени с использованием тех же этапов. Поскольку митохондрии и SMVs имеют тенденцию к образованию кластеров при посеве в камере электрофизиологические записи, внимание должно быть уделено загрузки образца как чрезмерное слипания или чрезмерного разбавления может уменьшить возможти формирования уплотнения. Кроме того, внимание должно быть уделено в некоторые технические детали, прежде чем начать изоляции. Очень важно использовать чистые инструменты и держать их на льду. Все процедуры должны выполняться на льду и все центрифуги установить до 4 ° С. Подготовка градиента Фиколл правильно имеет решающее значение для успешного эксперимента. Создание идеального разделения между двумя концентрациями Фиколл повышает чистоту субклеточных фракций.
Ограничением этой методики продиктовано окончательное количество белков, которые могут быть малыми, если выборка из конкретного региона мозга требуются, например, митохондрии из черной субстанции Парс компактов или полосатое тело. Объединение образцов из нескольких животных может быть необходимо повысить общее количество белка собран.
Митохондрии или SMVs которые делили на аликвоты по 1 мг / мл и хранили при -80 ° C и они устойчивы к записи течение нескольких месяцев, однако, это preferablе, не повторно заморозить образцы митохондриальной после оттаивания. Пузырьки очищают этого метода полезно изучить АТФ-синтазы, используя различные подходы, такие как записи патч зажим, биохимических методов и других функциональных исследований. С помощью этого препарата можно проанализировать воздействие наркотиков или небольших молекул на F1FO АТФазы и структуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
