मास Cytometry: दैनिक और एक CyTOF मास cytometer पर ट्यूनिंग रनिंग सेल के नमूने के लिए प्रोटोकॉल

Summary

दैनिक और एक CyTOF जन कोशिकामापी के प्रदर्शन की ट्यूनिंग अनुकूलन के लिए आवश्यक कदम वर्णित हैं. इष्टतम नमूना तैयार करने और प्रवाह की दर पर चर्चा कर रहे हैं

Protocol

सभी सेल के नमूने CyTOF लिए और तय किया जाना चाहिए permeabilized. यह iridium युक्त डीएनए intercalator के अधिक से अधिक प्रविष्टि के लिए सक्षम बनाता है, और भी MilliQ पानी से धो और resuspension कदम दौरान जन cytometer में इंजेक्शन लगाने से पहले सेल तुरंत रोकता है.

1. शुरू मास cytometer

1. CyTOF सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें. साधन सेटअप का चयन करें. कार्ड केज टैब पर, निचले सही कोने में जाने के लिए और हीटर "पर" बटन पर क्लिक करें. हीटर पर कम से कम 15 मिनट वांछित समय से पहले बंद करने के लिए स्प्रे चैम्बर पोशिश के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए 200 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच
2. सफेद नॉर्म परियोजना 3 मिलीलीटर सिरिंज एक ताजा MilliQ पानी से भरा सिरिंज के साथ सिरिंज पंप में बदलें.
3. छिटकानेवाला सफाई. सिरिंज और टयूबिंग का उपयोग करने के लिए दोनों छोटे तरल परिचय बंदरगाह और बड़ा गैस परिचय बंदरगाह के माध्यम से 5% citranox 2-3 बार खींच द्वारा छिटकानेवाला Backflush. MilliQ पानी टी के साथ backflushing दोहराएँओ अवशिष्ट citranox हटा.
4. पुष्टि करते हैं कि CyTOF के सामने पैनल पर रोशनी चित्रा 1 में के रूप में जलाया जाता है.

चित्रा 1. CyTOF पैनल रोशनी startup करने के लिए पहले.

5. Argon गैस टैंक वाल्व खोलें. इस पर बारी मोर्चे पर "ARGON" प्रकाश का कारण होना चाहिए.
6. गैस इनलेट मेक - अप के लिए छिटकानेवाला संलग्न. खोलना गैस टयूबिंग संबंधक मेक - अप और काला रबर O-अंगूठी और सफेद शंक्वाकार प्लास्टिक टुकड़ा निकाल. छिटकानेवाला के गैस परिचय बंदरगाह स्टेम पर व्यापक "अंगुली" नोट. जगह गैस परिचय बंदरगाह पर संबंधक. गैस बंदरगाह के अंत पर काले O-अंगूठी प्लेस, और बंदरगाह स्टेम के व्यापक हिस्से पिछले O-अंगूठी बल. संकीर्ण अंत के साथ शीर्ष पर सफेद शंक्वाकार प्लास्टिक के टुकड़े ने बताया, और गैस मेकअप टयूबिंग पर पेंच रखें.
7. साधन सेटअप विंडो के RFG नियंत्रक टैब पर, "प्रारंभ प्लाज्मा" दबाएँ. चूंकि छिटकानेवाला पहले से ही डाला जाता है, प्रेस "ठीक है". सॉफ्टवेयर chiller पर बारी, गैस का प्रवाह शुरू हो जाएगा, और एक प्लाज्मा आग लगना. डिटेक्टर वोल्टेज रैंप जाएगा. वहाँ एक पॉप - अप खिड़की कह "प्लाज्मा क्रम शुरू हुआ सफलतापूर्वक समाप्त हो गया है" जब समाप्त हो जाएगा, प्रेस "ठीक है". नई रोशनी पर सामने पैनल में होना चाहिए (2 चित्रा >).

चित्रा 2 CyTOF पैनल रोशनी के बाद प्लाज्मा प्रज्वलित और शुरू हुआ सफलतापूर्वक पूरा.

9. सिरिंज पंप पर बदल रहे हैं. सही ऊपरी कोने में, हरे रंग की "खेल" बटन प्रेस सिरिंज पंप शुरू और टयूबिंग के माध्यम से तरल बह रहा है और छिटकानेवाला के बाहर छिड़काव शुरू. डिफ़ॉल्ट सिरिंज सेटिंग्स पानी के 3 मिलीलीटर के लिए कर रहे हैं. नमूना पाश के माध्यम से बह रही हो नमूना के लिए आदेश में, सिरिंज पंप को समय - समय पर जब यह पानी से बाहर चलाता है परिवर्तित किया जाना चाहिए. स्क्रीन के शीर्ष पर, वहाँ एक संकेत है कितना तरल बाहर सिरिंज पंप के प्रवाहित होती है काउंटर है. सिरिंज पंप बंद हो जाएगा जब इस काउंटर "3.000" या गोताख़ोर सिरिंज के अंत तक पहुँच हिट. जब सिरिंज refilling, आप "रोक" के बजाय नीले "ठहराव" काउंटर रीसेट बटन हिट होगा.

ई "> 2 मास cytometer दैनिक अंशांकन

1. जन cytometer लगभग 20 मिनट की जरूरत अंशांकन से पहले एक गर्म, स्थिर प्लाज्मा को प्राप्त होगा. उच्च मूल्य के 3% के तहत संकेत, ट्यूनिंग चरणों का उद्देश्य Tm169 या Tb159 के वांछित संकेत को अधिकतम करने के लिए है जबकि "Gd155" (La139 + O16 ऑक्साइड) रखने के लिए है. अधिग्रहण सेटिंग्स डाटा अधिग्रहण सेटिंग्स विंडो खोलने के लिए बटन पर क्लिक करें. Analytes टैब में, आवधिक तालिका आइसोटोप चयन पैनल को खोलने के क्लिक करें. DVS विज्ञान ट्यूनिंग मैनुअल में सूचीबद्ध समाधान में आइसोटोप का चयन करें, तो क्लिक करें "सहेजें".
2. बटन पढ़ना पढ़ना खिड़की प्रति मास (तों) को खोलने के प्रति आइसोटोप क्लिक करें. एक नया नंबर दर्ज करने और दबाव "प्रवेश" "दालों गिनती, और rescale y-अक्ष का चयन करें.
3. एक हरे रंग की ट्यूनिंग समाधान के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज नॉर्म परियोजना भरें. नमूना बंदरगाह चयनकर्ता बंद करने के लिए "लोड", ट्यूनिंग समाधान के 450 μl इंजेक्षन, तो "इंजेक्षन" चयनकर्ता बारी. डाटा Acquisit मास अंशांकन टैब में आयन सेटिंग्स विंडो, प्रेस करने के लिए निगरानी के लिए है जो जनता द्वारा बह रही हैं "भागो". विंडो के बाईं ओर कम द्रव्यमान है, जबकि सही पक्ष उच्च द्रव्यमान है. नोट: वहाँ पहले से ही TOF 9400-9800 क्षेत्र में संकेत, argon गैस में क्सीनन आइसोटोप (3 चित्रा) की वजह से हो जाएगा. रुको जब तक ट्यूनिंग समाधान आइसोटोप इस प्रदर्शन में धारियाँ (चित्रा 4) के रूप में प्रदर्शित होने शुरू.

चित्रा 3. मास अंशांकन टैब विंडो, विभिन्न आइसोटोप के लिए पृष्ठभूमि के स्तर को दिखाने के बाद धोने के समाधान और पानी से कुल्ला. argon गैस में क्सीनन आइसोटोप 9400-9800 TOF आसपास के क्षेत्र में मेल खाती है, और हमेशा मौजूद होना चाहिए. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 4 जनसंचार अंशांकन टैब विंडो, DVS ट्यूनिंग समाधान में विभिन्न आइसोटोप के लिए खड़ी धारियाँ दिखा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

4. खिड़की पढ़ना प्रति मास (तों) को वापस जाओ और ऊपरी बाएँ कोने में हरी "प्ले" बटन दबाएँ. 2.1 चरण में चयनित प्रत्येक आइसोटोप एक अलग रंग लाइन के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. डिफ़ॉल्ट x-अक्ष सेकंड में, "समय" है. विभिन्न आइसोटोप के स्तर की निगरानी जब तक वे स्थिर रहे हैं.
5. वर्तमान की ट्यूनिंग. डाटा अधिग्रहण सेटिंग्स विंडो के पैरामीटर टैब पर, ड्रॉप - डाउन मेनू से "वर्तमान" का चयन करें. 0 =, खत्म = 10, कदम मान = 0.5, व्यवस्थित समय = 200 शुरू करने के लिए, और प्रेस "बचाने के लिए". पढ़ना खिड़की और हिट खेलने प्रति मास (तों) पर क्लिक करें. x-अक्ष अब "वर्तमान" है. नोट जहां आइसोटोप (5 चित्रा) शिखर और आर के संकेत ECORD. साधन सेटअप विंडो के डैक चैनल सेटअप टैब के अंतर्गत, "वर्तमान" के लिए नीचे स्क्रॉल और इस नए मान दर्ज करें. प्रेस "वास्तविक वर्तमान मूल्य सेट", फिर "बचाने के लिए".

चित्रा 5 वर्तमान ट्यूनिंग प्रोफाइल.

6. गैस मेकअप की ट्यूनिंग. ड्रॉप - डाउन मेनू में बदलें "गैस मेकअप." चलो = 0.55 अंत में, 0.95 =, कदम मूल्य = 0.05, व्यवस्थित समय = 200 शुरू. बचाने के दबाएं. पढ़ना खिड़की और हिट खेलने प्रति मास (तों) पर लौटें. x-अक्ष अब "गैस मेकअप" प्रवाह की दर है. रिकॉर्ड जहां आइसोटोप चोटी के संकेत है. अंत के पास "Gd155" संकेत (6 चित्रा) में तेजी से वृद्धि को ध्यान से देखें. डैक चैनल सेटअप टैब पर लौटें, "गैस" स्क्रॉल, और इस नए मान दर्ज हैं. प्रेस "वास्तविक वर्तमान मूल्य सेट", फिर "बचाने के लिए".

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चित्रा 6 मेकअप गैस ट्यूनिंग प्रोफाइल.

7. रिकॉर्डिंग के अनुपात आइसोटोप बनाम ऑक्साइड वांछित. एक दूसरे ट्यूनिंग समाधान के 450 μl इंजेक्शन. पैरामीटर टैब पर, ड्रॉप डाउन मेनू से "समय" का चयन करें, = 0, अंत = 10 = 1 कदम मूल्य शुरू, 200 = समय निपटाने. बचाने के लिए. "" दबाएं खिड़की पढ़ना प्रति मास में "खेल" (ते) मारो. बाद लाइनों (7 चित्रा) स्थिर है, कर्सर का उपयोग करने के लिए Tm169 या Tb159 (उच्च मूल्य) के लिए ऊपरी बाएँ बक्से में मूल्य पढ़ा और भी "Gd155" मूल्य (<उच्च मूल्य के 3%). इन मूल्यों को भी भविष्य में संदर्भ के लिए एक ट्यूनिंग फ़ाइल में सहेजा जा सकता है.

7 चित्रा ट्यूनिंग समाधान संकेत तीव्रता के वर्तमान और मेकअप गैस अनुकूलन के बाद मापन.

8. सैम की सफाईमिसाल पाश. नमूना पाश के माध्यम से 3 MilliQ पानी की मिलीलीटर सुई, DVS धो समाधान के 500 μl द्वारा पीछा किया. मास अंशांकन टैब में "रन" दबाकर सफाई की प्रगति की निगरानी. धो जब तक धारियाँ (4 चित्रा) की तीव्रता में कमी, फिर नीचे जब तक MilliQ पानी और मॉनिटर 3 मिलीलीटर द्वारा पृष्ठभूमि स्तर (3 चित्रा) का पालन करने के लिए शुरू होता है.

3. रनिंग नमूने

1. अधिग्रहण विंडो खोलें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स: = मक्खी पर विश्लेषण करो, सिग्नल = दोहरी दोहरी गणना अंशांकन = डेटा का विश्लेषण. शोर में कमी का चयन किया जाता है. इनमें से कोई भी अगर वांछित बदला जा सकता है. फ़ाइल नाम दर्ज करें. सभी फ़ाइलें ई :/ / ड्राइव करने के लिए बचाया जाना चाहिए.
2. अधिग्रहण में देरी की स्थापना. बारे में 30 सेकंड के सेल नमूना पाश और छिटकानेवाला के बीच टयूबिंग की लंबाई के कारण दर्ज की घटनाओं में कुछ देरी हो जाएगा. इसलिए, "अधिग्रहण देरी की कुल राशि और" वेक्षक सेंटकरने की क्षमता देरी "कम से कम 30 सेकंड वेक्षक स्थिरता देरी कम से कम 20 सेकंड होना चाहिए. चाहिए.
3. डेटा संग्रह के समय सेट. "अधिग्रहण समय" सेकेंड की संख्या आप अपने नमूना चलाने चाहते है. पूरे 450 μl नमूना पाश भरना 600 सेकंड को पूरा करने की आवश्यकता होगी. यह सुझाव दिया है कि सेकंड 50-100 चलाते समय के अंत करने के लिए जोड़ा जा सकता है कम से कम करने के लिए नमूना ले जाने वाला.
4. नमूना के Resuspension. मशीन में लवण की निर्माण को कम करने के लिए, यह कि MilliQ पानी में कम से कम दो washes किया जा सेल धुंधला हो जाना के अंत में सुझाव दिया है, MilliQ पानी में एक अंतिम resuspension द्वारा पीछा किया. MilliQ पानी की मात्रा सेल resuspend गोली कोशिकाओं आप के साथ शुरू और पूरे धुंधला हो जाना प्रक्रिया के बाद सेल वसूली की संख्या के आधार पर अलग अलग होंगे. एक अच्छी शुरुआत जगह 10 (शुरू) ⁶ कोशिकाओं / एमएल है. Resuspension के बाद, एक सेल झरनी के माध्यम से फिल्टर समुच्चय को दूर करने के लिए.
5. शुरू नमूना चलाने. वर्तमान नमूने के लिए एक नया फ़ाइल नाम दर्ज करें. नमूना पाश वाल्व स्विच "लोड", नमूना इंजेक्षन, वापस स्विच करने के लिए "इंजेक्षन", तो हिट अधिग्रहण विंडो में "भागो".
6. सेल की घटनाओं का पंजीयन. कोशिकाओं प्रत्येक ऊर्ध्वाधर चैनल / आइसोटोप मार्कर (8 चित्रा) में निशान की क्षैतिज संग्रह के रूप में स्नैपशॉट विंडो में प्रतिनिधित्व किया जाएगा. जबकि जन cytometer 1000 कोशिकाओं / सेक रजिस्टर कर सकते हैं, सेल घटनाओं के बीच बेहतर संकल्प आमतौर पर 300-500 कोशिकाओं / सेकंड में प्राप्त की है. ~ 1 / सेल स्क्रीन ताज़ा के एक औसत से मेल खाती है. यह 30 सेकंड के लिए लेने से पहले सेल घटना काउंटर चढ़ाई करने के लिए शुरू हो सकता है. यह "पर मक्खी" डाटा प्रोसेसिंग के कारण है, कोई सेल घटना की जानकारी खो दिया है.

8 चित्रा नमूना दौरान अधिग्रहण खिड़की चल रहा है, तीन अलग सेल की घटनाओं के साथ जुड़े तत्वों के लिए इसी स्थलों में से एक क्षैतिज पंक्तियों दिखा.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

7. सेल की घटनाओं की गुणवत्ता. सूचना किसी भी प्रत्येक आइसोटोप चैनल, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल घटना दर में streaking पृष्ठभूमि. जन cytometer पृष्ठभूमि ऊपर संकेत में एक निश्चित वृद्धि के रूप में सेल घटना ", तो मुफ्त धातु या एंटीबॉडी" सेल घटना "गिनती बदल सकते हैं अनबाउंड से पृष्ठभूमि संकेत पहचानता है. इसके अतिरिक्त, इस पर भी एक उच्च एकाग्रता कोशिकाओं चलाने नक़ल घटनाओं की बढ़ती संख्या के कारण हो सकता है. पृष्ठभूमि अतिरिक्त washes या अधिक से अधिक सेल कमजोर पड़ने के द्वारा कम किया जा सकता है. दोहरी अधिक सेल कमजोर पड़ने से बढ़ चलाने के समय की कीमत पर, कम से कम किया जा सकता है.
8. नमूना डेटा अधिग्रहण फिनिशिंग. जब अधिग्रहण समय पर पहुँच गया है, डेटा संग्रह खत्म हो जाएगा. वहाँ एक पॉप अप विंडो से पहले देरी के साथ एक सा हो जाएगा एक "ठीक" बटन प्रकट होता है, फिर से, यह "पर फ्लाई" डाटा प्रोसेसिंग के कारण है. नमूना अधिग्रहण भी premat रोका जा सकता हैurely "बंद करो" बटन मार. इस मामले में, सभी सेल पहले से ही पंजीकृत घटनाओं और गिना जाएगा आउटपुट फाइल में संसाधित.
9. प्रत्येक नमूने के बीच MilliQ पानी की कम से कम 500 μl इंजेक्शन भी नमूना carryover को कम करने में मदद करता है.

4. मशीन का उपयोग करने के बाद सफाई

1. समाधान धो लें. अंतिम नमूना के बाद चलाने के लिए और पानी के साथ प्लावित नमूना पाश, नमूना पाश में धो समाधान के 450 μl इंजेक्षन. मॉनिटर 2.8 चरण में डाटा अधिग्रहण सेटिंग्स विंडो (9 चित्रा) मास अंशांकन टैब में मुक्त धातु की रिहाई. जब मुक्त धातु संकेत करने के लिए कम करने के लिए शुरू होता है, 3 MilliQ पानी की मिलीलीटर के साथ फ्लश की निगरानी और जब तक पृष्ठभूमि स्तर हासिल कर रहे हैं.

चित्रा DVS धो समाधान के साथ सफाई के बाद रन के दौरान 9. मास अंशांकन टैब खिड़की,. TOF 9800-11000 क्षेत्र में खड़ी धारियाँ एंटीबॉडी लेबल मशीन के बाहर साफ किया जा रहा है आइसोटोप हैं. 11500 TOF के आसपास खड़ी धारियाँ दो Ir intercalator आइसोटोप के अनुरूप बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

5. नीचे बंद मशीन

1. साधन सेटअप विंडो के RFG नियंत्रक टैब में, चुनें "प्लाज्मा बंद करो". जब प्रक्रिया पूरा हो गया है, वहाँ एक पॉप अप आप पूछ के लिए छिटकानेवाला हटाने खिड़की होगा. "ठीक है" दबाएँ. कार्ड केज टैब में बंद हीटर बारी. Argon आपूर्ति पर वाल्व बंद करें.
2. छिटकानेवाला का निकालना. ध्यान से पीछे की ओर खींच कर स्प्रे चैम्बर से छिटकानेवाला निकालें. खोलना चरण 1.6 से नमूना परिचय टयूबिंग और अलग जगह. खोलना गैस बनाने शुरुआत करने के लिए थोड़ा ढीला कनेक्शन है, तो छिटकानेवाला हटा. एक साथ खराब कर दिया फिटिंग छोड़कर एल की संभावना कम हो जाएगाosing काले O-अंगूठी रबर और सफेद शंक्वाकार प्लास्टिक टुकड़ा.
3. छिटकानेवाला सफाई. 5% और 1.3 चरण में सिरिंज टयूबिंग उपयोग कर citranox साथ छिटकानेवाला के दोनों बंदरगाहों Backflush. स्टोर, अगले उपयोग तक 5% citranox में कवर.

Representative Results

ऊपर प्रोटोकॉल के बाद चार बातों को पूरा करना चाहिए. सबसे पहले, वार्म अप जन cytometer के लिए पर्याप्त समय की अनुमति एक गर्म, स्थिर इष्टतम संकेत और न्यूनतम ऑक्साइड गठन के लिए आवश्यक प्लाज्मा का उत्पादन होगा. दूसरा, है MilliQ पानी और DVS धो समाधान (9 चित्रा) साथ जन कोशिकामापी के पर्याप्त धोने टयूबिंग और मशीन के अन्य भागों के लिए धातु सोखना के स्तर को कम करने में मदद, नमूना अधिग्रहण के दौरान पृष्ठभूमि कम (8 चित्रा) में मदद करेगा. यह भी किसी भी कोशिकाओं है कि मशीन में फंस सकता है और जिससे कम से कम नमूना से नमूना carryover हटाने में मदद मिलेगी. तीसरा, जबकि ऑक्साइड गठन पूरी तरह से रोका नहीं जा सकता है, जन cytometer (5-7 आंकड़े) की उचित ट्यूनिंग वांछित जन एम अनुकूलन कुल संकेत मदद, जबकि ऑक्साइड जन एम 16 पृष्ठभूमि को कम करेगा. जैसा कि चित्र में 10 में देखा है, अनुचित ट्यूनिंग (मैजंटा) काफी ऑक्साइड गठन की वृद्धि हुई16 एम ठीक tuned नमूना (गहरे नीले रंग) की तुलना में. यह थोड़ा एम में वांछित संकेत कम करने का प्रभाव पड़ता है, और 16 एम में काफी अवांछित पृष्ठभूमि हस्तक्षेप बढ़ रही है.

अंत में, buffers में और अंततः MilliQ पानी में नमूने की पर्याप्त धोने / धातु एंटीबॉडी पृष्ठभूमि संकेत स्वीकार्य स्तर तक कम करना चाहिए. MilliQ पानी washes और resuspension क्रम के कई घंटे के पाठ्यक्रम में स्थिर वर्तमान सेटिंग्स को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं. MilliQ पानी में नमूना के समुचित कमजोर पड़ने के लिए एक दैनिक नमूना के आधार पर निर्धारित किया है. हालांकि, ~ 10 (शुरू) ⁶ कोशिकाओं / एमएल गिराए के लिए एक अच्छी जगह से शुरू है. एक सेट का पहला नमूना के आधार पर है, बाद के नमूने के लिए अधिक से अधिक या कम कमजोर पड़ने समायोजित किया जा सकता है. उचित धोने और उचित कमजोर पड़ने न्यूनतम पृष्ठभूमि और कोशिकाओं का सबसे बड़ा संकल्प को सुनिश्चित करने के लिए, जबकि गति के लिए की जरूरत (8 चित्रा) संतुलन जाएगा.

10 चित्रा उचित ट्यूनिंग की इच्छित संकेत है, और विभिन्न धातुओं के बीच lanthanide ऑक्साइड के गठन में अंतर पर प्रभाव. Polystyrene La139 प्राकृतिक बहुतायत Pr141, Tb159, Tm169, और Lu175 DVS विज्ञान से युक्त मोती सेल अधिग्रहण मोड में चला गया. मोतियों की अलग नमूने संकेत मेकअप गैस प्रवाह की दर (चित्रा 6 के साथ तुलना) पर चलाए जा रहे थे. मैक लिए FlowJo v9.4.9 का उपयोग करते हुए, टूटे हुए मोतियों से मलबे से बाहर gating सहित डेटा का विश्लेषण किया गया. ठीक से tuned नमूना 0.74 एल / मिनट पर था. यह कम प्रवाह दरों पर की तुलना में उच्च संकेत तीव्रता, और "एम" "एम 16" अनुचित तरीके से tuned संकेत से जनता पर ऑक्साइड कम संकेत के साथ धातु जनता उच्च संकेत "एम" La139 द्रव्यमान और Tm169 ए सिग्नल था. ध्यान दें कि La139 संकेत तीव्रता मेकअप गैस प्रवाह की दर से Tm169 से अधिक प्रभावित है, "एम 16" ऑक्साइड जन में बी सिग्नल.155 और 185, La139 O16 और Tm169 + + O16 आक्साइड के लिए इसी, क्रमशः ते. वहाँ कोई वास्तविक "Gd155" या "Re185 मोती में मौजूद है. Gd155 "चैनल में ऑक्साइड संकेत विशेष रूप से मजबूत है, La139 ऑक्सीकरण हो जाता है आसानी से किया जा रहा है कारण है. यह एक एक ऑक्साइड के उच्चतम स्तर के मुठभेड़ की उम्मीद कर सकते हैं सी. "एम" और "एम 16" मेकअप गैस प्रवाह दर के एक समारोह के रूप में संकेत तीव्रता के ग्राफ का प्रतिनिधित्व करता है. भरा माउस को आइकनों बड़े पैमाने पर 'एम' का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि खुले माउस को आइकनों जन "एम 16" का प्रतिनिधित्व करते हैं. लाइनों के रंग संबंधित बड़े पैमाने पर 'एम' के अनुरूप. सूचना है कि La139 और Pr141 अत्यधिक मेकअप गैस प्रवाह की दर से प्रभावित कर रहे हैं, यहां तक कि एक बिंदु है जहां अधिक मास "एम 16" ऑक्साइड "एम" के द्रव्यमान से मौजूद है तक पहुँचने. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

पिछले कुछ दशकों के लिए, प्रतिदीप्ति प्रवाह cytometry एकल कक्षों का विश्लेषण करने के लिए एक workhorse विधि किया गया है दोनों सतह अभिव्यक्ति के मामले में और कार्यात्मक assays में. हालांकि, फ्लोरोसेंट रंजक वर्णक्रमीय ओवरलैप के मुद्दों पर एक साथ मार्करों की संख्या सीमित है. जबकि 12 से अधिक एक साथ मार्कर का उपयोग कर प्रयोगों की सूचना दी गई है, मुआवजे की राशि आवश्यक यह तकनीकी रूप से कठिन बनाता है.

Fluorophores के बजाय, जन cytometry DVS साइंसेज द्वारा बीड़ा उठाया एंटीबॉडी के लिए लेबल के रूप में धातुओं के लिए chelating साइटों के साथ पॉलिमर का उपयोग करता है ^1-3 धातुओं की शुद्धता और आईसीपी एमएस की सामूहिक संकल्प के कारण, वहाँ प्रभावी ढंग से नहीं "वर्णक्रमीय ओवरलैप है." इस्तेमाल तत्वों की सबसे biologically प्रासंगिक नहीं हैं, वहाँ भी थोड़ा पृष्ठभूमि के कारण है "autofluoresence." इन तथ्यों को एक ही प्रयोग के भीतर 30 से अधिक युगपत मार्करों के उपयोग की अनुमति ^6,7 वहाँ भी एक व्यापक उप है.एक ठेठ प्रतिदीप्ति प्रयोग में से आईसीपी एमएस में संकेत में namic रेंज.

हालांकि, बड़े पैमाने पर cytometry सीमाएँ हैं. यह एक विनाशकारी तकनीक: कोशिकाओं छँटाई और अधिक प्रयोग के लिए बरामद नहीं किया जा सकते हैं. जन cytometer धातुओं की उपस्थिति के लिए एक सख्त आवश्यकता है: अगर एक धातु मौजूद नहीं है, एक सेल को पता नहीं होगा. यह धातु chelating डीएनए intercalators के उपयोग करने के लिए प्रतिशत के माता पिता के सही आंकड़े को सुनिश्चित करने के लिए, के रूप में सभी कोशिकाओं की परवाह किए बिना कि क्या किसी भी एंटीबॉडी जांच बाँध पता लगाया जाएगा के लिए प्राथमिक कारण ^3,6-7 अंत में, वर्तमान सेल संचरण क्षमता है. मशीन की ~ 25% है एक फ्लोरोसेंट प्रवाह cytometer के लिए> 90% की दक्षता की तुलना में. इसलिए, एक बड़ा कोशिकाओं के शुरू संख्या अक्सर दुर्लभ सेल आबादी के लिए विशेष रूप से आवश्यक है. हालांकि, यह आम तौर पर तथ्य यह है कि एक एकल जन कोशिकामापी नमूना अक्सर कई फ्लोरोसेंट नमूनों की जगह से बाहर संतुलित है. अंत में, अधिकतम सेल acquisition दर बहुत मानक ~ 1000 कोशिकाओं / सेकंड में फ्लोरोसेंट प्रवाह cytometers की तुलना में धीमी है, इष्टतम दर अक्सर है कि आधे. इसलिए, प्रत्येक नमूने को चलाने के लिए लंबे समय लेता है.

कई कागजात हाल ही में सेल के नमूने विभिन्न प्रकार के धुंधला पर प्रकाशित किया गया है ^3,5-7 इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए चल नमूने के लिए एक जन CyTOF ^टीएम cytometer के समुचित उपयोग पर जानकारी प्रदान करना है. छिटकानेवाला के साथ backflushing और 5% citranox में भंडारण के द्वारा रखरखाव निर्माण सेल मलबे और धातुओं के कम से कम, जिससे मोज़री की संभावना को कम करने. मशीन के रखरखाव अनुकूलतम प्रदर्शन के लिए दो भागों में है. पहले कम से कम एक दैनिक आधार पर मशीन के उचित ट्यूनिंग (वर्तमान, गैस मेकअप) उचित माप सुनिश्चित करने में मदद करता है. दूसरा, प्रत्येक नमूने के बीच और MilliQ के अंत में धो समाधान के साथ पानी के साथ पर्याप्त धोने रन दूर निर्मित कार्बनिक और अकार्बनिक मलबे सामान्य और carryover में पृष्ठभूमि को कम करने में मदद मिलेगीनमूने के बीच. अंत में, नमूना तैयार करने की गुणवत्ता डाटा अधिग्रहण की गुणवत्ता पर काफी प्रभाव पड़ता है. बफर में और अंततः MilliQ पानी में एकाधिक washes किसी भी intercalators या nonspecific एंटीबॉडी बंधनकारी से धातु पृष्ठभूमि को दूर करने में मदद करते हैं. सेल नमूना के समुचित कमजोर पड़ने में मदद करेगा सेल घटनाओं के बीच इष्टतम संकल्प संतुलन जबकि नमूना प्रति कुल चलाते समय कम से कम. उचित कमजोर पड़ने भी छिटकानेवाला में एक रोकना पैदा की संभावना को कम करने में मदद करता है.

आम समस्याओं के निवारण

1. मशीन शुरू के दौरान पिछले कदम "RFG तैयार नहीं मिलता है"

साधन सेट अप विंडो के कार्ड केज टैब के अंतर्गत, RFG तहत "रीसेट" दबाएँ. मशीन शुरू करने का प्रयास करें. यदि यह समस्या हल नहीं होती है, सॉफ्टवेयर बंद करते हैं, तो फिर से खोलना, "रीसेट" फिर प्रेस, और शुरू करने के लिए करने का प्रयास. अगर यह अभी भी समस्या हल नहीं होती है, मशीन के बाईं वापस कोने पर RFG जनरेटर ब्रेकर स्विच की जाँच करें. यदि फिसल गया,"पर", हिट "रीसेट" reposition, और शुरू करने की कोशिश है. अगर यह अभी भी समस्या हल नहीं होती, DVS संपर्क करें.

2. मशीन के नीचे बन्द हो जाता है, जबकि चल रहा है

1. Argon आपूर्ति की जाँच करें. यदि argon मशीन तक पहुँचने दबाव 40 साई के आसपास नीचे हो जाता है, सॉफ्टवेयर एक स्वत: बंद कार्यान्वित.
2. RFG 100W त्रुटि पार हो गई. यह तब होता है जब प्लाज्मा के लिए बिजली की मांग 1300 से बाहर चला जाता है + / - 100W, खिड़की और सॉफ्टवेयर एक स्वत: बंद कार्यान्वित. यह आमतौर पर छिटकानेवाला से असमान स्प्रे है, विशेष रूप से बड़ी बूंदों के कारण होता है. यह जरूरत से ज्यादा प्लाज्मा होता है, के लिए प्लाज्मा को बनाए रखने के लिए अधिक ऊर्जा की आवश्यकता होती है. यह अत्यधिक सिरिंज पंप के बदलने के दौरान सिरिंज सिरिंज टयूबिंग संलग्न किया बल की वजह से हो सकता है. यह बूंदों के एक बड़े स्प्रे का कारण बनता है, प्लाज्मा ठंडा. यदि यह मामला है, बस मशीन को पुनः आरंभ.

यह भी बड़ी बूंदों कि करने के लिए शुरू करने के लिए कारण हो सकता हैफार्म जब छिटकानेवाला को रोकना शुरू होता है. यदि यह त्रुटि बारंबार, सफाई के लिए छिटकानेवाला को दूर करने के लिए, एक साफ छिटकानेवाला डालने और पुनः आरंभ.

बहुत कम बार, नमूना पाश और छिटकानेवाला के बीच पतली नमूना टयूबिंग रोकना कर सकते हैं. यह अनियमित रूप से तरल के कम प्रवाह की दर जब टयूबिंग छिटकानेवाला से निकाल दिया जाता है द्वारा निदान किया जा सकता है. यदि यह मामला है, प्रभावित टयूबिंग और ताजा टयूबिंग के साथ बनाया जा फिटिंग हटाने, और एक नया छिटकानेवाला फिटिंग और टयूबिंग किट के साथ बदलें.

3. जबकि सेल नमूना अधिग्रहण (8 चित्रा) के दौरान दिखाई नहीं आइसोटोप धारियाँ (या सेल घटनाओं), या मास अंशांकन टैब खिड़की (3 आंकड़े, 4, 9) देख

1. सिरिंज पंप की जाँच करें. यह अक्सर सिरिंज पंप सिरिंज के बदलते दौरान "खेल" हिट भूल के कारण होता है. यह भी अगर "ठहराव", के बजाय "रोक", सिरिंज परिवर्तन के दौरान मारा है हो सकता है. मात्रा काउंटर "रोकें" सिरिंज पंप पर नहीं रीसेट करता है, और यह मात्रा 3.000 एमएल को तिरस्कृत पर रोक, कि क्या तरल अवशेषों की परवाह करेंगे. अंत में, सिरिंज पानी के बाहर चलाने के लिए हो सकता है.
2. नमूना वाल्व की जाँच करें. "लोड" पर जबकि नमूना लोड करने के लिए सुनिश्चित करें, और तब नमूना रन शुरू करने से पहले सिर्फ "सुई" स्विच.
3. समाप्त या पीढ़ी नमूना जलमिश्रित. आप अपने नमूने के सभी चला सकते हैं, अधिग्रहण के समय की गणना की जांच (3.3 चरण देखें). वैकल्पिक रूप से, आप कमजोर पड़ने कारक miscalculated हो सकता है, और / या अधिक कक्षों से नमूना प्रसंस्करण के दौरान उम्मीद खो दिया है.
4. छिटकानेवाला भरा. यह आमतौर पर एक RFG त्रुटि (अंक 2b देखें) से पहले है, लेकिन एक रोकना notiecably एक बंद के कारण सेल संचरण क्षमता कम कर सकते हैं पहले.

मुद्दे 3c और 3 डी भी यूरोपीय संघ युक्त polystyrene अंशांकन मोती का एक नमूना चल रहा द्वारा जाँच की जा सकती है. वे लगभग 1 मिलियन / एमएल (नमूना ड्राइंग से पहले अच्छी तरह से भंवर!) की आपूर्ति कर रहे हैं. इसलिए, 450 μL नमूना पाश भरने एपी देना होगाproximately 450.000 मोती. CyTOF ^टीएम सेल संचरण क्षमता मशीन पर निर्भर है, लेकिन लगभग 15-30% है. इसलिए, 67,500-135,000 मनका घटनाओं है कि इंजेक्शन से उम्मीद होगी. कि नीचे नंबर टयूबिंग या छिटकानेवाला में रोकना के साथ संगत कर रहे हैं.

सेल / मनका संचरण क्षमता कभी कभी परीक्षण के लिए, किसी भी लंबी अवधि के रुझान नोट करने के लिए कुछ है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity