Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

Summary

Os passos necessários para a sintonização diária e optimização do desempenho de um citómetro de massa CyTOF são descritos. Comentários sobre a preparação da amostra ideal e vazão são discutidos

Abstract

Nos últimos anos, a análise rápida de células individuais tem sido normalmente realizadas utilizando a citometria de fluxo por fluorescência e anticorpos marcados. No entanto, a questão da sobreposição espectral de emissões fluoróforo tem limitado o número de sondas simultâneas. Em contraste, o citómetro de nova massa CyTOF por casais DVS Sciences um sistema de introdução de líquido de uma única célula de um ICP-MS. ^Uma vez de fluoróforos, os polímeros de quelação que contenham os isótopos de metal altamente enriquecidas são acopladas a anticorpos ou outras sondas específicas. ^2-5 Devido à pureza do metal e resolução de massa do citómetro de massa, não existe nenhum "sobreposição espectral" de isótopos vizinhos, e, portanto, não há necessidade de matrizes de compensação. Além disso, devido ao uso de metais lantanídeos, não há biológico e, por conseguinte, qualquer equivalente de autofluorescência. Com uma janela de massa estendida massa atómica 103-203, teoricamente até 100 etiquetas podem ser distinguidos simultaneamente. Atualmente, Mais de 35 canais estão disponíveis usando os reagentes quelante disponível a partir de DVS Sciences, permitindo a dissecção sem precedentes do perfil imunológico de amostras. ^6-7

Desvantagens para citometria de massa incluem o requisito estrito para um isótopo de metal separado por sonda (nenhum equivalente de dispersão frontal ou lateral), e o facto de que é uma técnica destrutiva (sem possibilidade de separação de recuperação). A actual configuração do citómetro de massa também tem uma taxa de transmissão de células de apenas ~ 25%, o que requer um maior número de células de entrada.

Desempenho diário ideal do citômetro de massa requer várias etapas. O objectivo básico da optimização é maximizar a intensidade de sinal de medição dos isótopos de metal desejados (M) ao mesmo tempo minimizando a formação de óxidos (M 16), que irá diminuir a intensidade do sinal M e interferir com qualquer sinal desejado em M 16. O primeiro passo é aquecer a máquina para um quente, eu estávelCP plasma foi estabelecida. Segundo, as definições para a taxa atual e make-up de fluxo de gás deve ser otimizada em uma base diária. Durante a recolha de amostra, a taxa máxima de células evento é limitada pela eficiência do detector e a velocidade de processamento de 1000 células / segundo. No entanto, dependendo da qualidade da amostra, uma taxa mais lenta do evento de células (300-500 células / segundo), é usualmente desejável para permitir uma melhor resolução entre os eventos de células e, assim, maximizar singlets intactas sobre doublets e detritos. Por fim, a limpeza adequada da máquina no fim do dia, ajuda a minimizar o sinal de fundo, devido ao metal livre.

Protocol

Todas as amostras de células para a CyTOF devem ser fixadas e permeabilizadas. Isto permite uma maior entrada do intercalador de ADN contendo irídio, e também evita que a lise das células durante a lavagem com água MilliQ e ressuspensão passos imediatamente antes de proceder à injecção no citómetro de massa.

1. Start-up da Citómetro Massa

1. Abra o programa de software CyTOF. Selecione Configuração do instrumento. Na guia do gabinete, ir para o canto inferior direito e clique aquecedor "ON" botão. Ligar o aquecedor, pelo menos, 15 min antes do momento desejado para permitir tempo suficiente para que o manto da câmara de pulverização para alcançar 200 ° C.
2. Substituir o branco Norm Ject-seringa de 3 ml na bomba de seringa, com uma seringa cheia de água fresca MilliQ.
3. Limpeza nebulizador. Backflush o nebulizador usando a seringa eo tubo de puxar 5% citranox 2-3 vezes por meio da porta tanto menor a introdução de líquidos e a porta de maior introdução de gás. Repita retrolavagem com água MilliQ to Remover citranox residual.
4. Verificar para confirmar que as luzes no painel frontal do CyTOF são iluminadas, como na Figura 1.

Figura 1. CyTOF luzes do painel antes de inicialização.

5. Abra argônio válvula do tanque de gás. Isso deve fazer com que o "ARGON" luz na frente para ligar.
6. Fixe o nebulizador para make-up de entrada de gás. Desaparafuse o make-up conector tubulação de gás e remover o preto de borracha o-ring ea peça cônica de plástico branco. Note-se a maior "junta" na haste porta gás introdução do nebulizador. Coloque o conector na porta de introdução de gás. Colocar o anel em O preto sobre a extremidade da porta de gás, e forçar o o-ring passado a parte mais larga da haste da porta. Coloque a peça cónica de plástico branco na parte superior com a parte mais estreita apontou, e parafuso para a tubulação de gás make-up.
7. No separador Controlador RFG da janela Configuração do Instrumento, pressione "Start Plasma". Desde o nebulizador já está inserido, pressione "OK". O software irá ligar o chiller, iniciar o fluxo de gás, e inflamar um plasma. A tensão detector irá aumentar. Haverá uma janela pop-up dizendo "Plasma seqüência de inicialização foi concluído com êxito" quando terminar, pressione "OK". Novas luzes deve ser em no painel frontal (Figura 2 >).

Figura 2. Luzes do painel de plasma CyTOF após inflamado e start-up com êxito.

9. Ligar bomba de seringa. No canto superior direito, pressione o verde "play" para iniciar a bomba de seringa e começar a fluir líquido através do tubo e pulverização fora do nebulizador. As configurações de seringa padrão são de 3 ml de água. Para que amostra a fluindo através do loop de amostra, a bomba de seringa devem ser periodicamente alterada quando ele é executado fora de água. Na parte superior do ecrã, existe um contador que indica a quantidade de líquido fluiu para fora da bomba de seringa. A bomba de seringa parará quando o contador atingir "3,000" ou o êmbolo atinge a extremidade da seringa. Ao recarregar a seringa, você deve clicar em "stop" em vez do azul "pausa" botão para reiniciar o contador.

e "> 2 de Calibração. Diário do Citómetro Massa

1. O citômetro de massa vai precisar de aproximadamente 20 minutos para conseguir um plasma quente e estável antes de calibração. O objectivo dos passos de sintonia é maximizar o sinal desejado do Tm169 ou Tb159, mantendo "Gd155" (óxido; La139 + O16) de sinal inferior a 3% do valor mais elevado. Clique na Aquisição botão Configurações para abrir a janela Configurações de Aquisição de Dados. Na guia Parâmetros, clique na tabela periódica para abrir o painel de seleção de isótopo. Selecione os isótopos na solução de ajuste DVS Ciências listados no manual, em seguida, clique em "salvar".
2. Clique nos Isótopos por leitura botão para abrir a Massa (s) por janela de leitura. Selecione "Pulsos Count", e redimensionar o eixo-y, digitando um novo número e pressionar "enter".
3. Encha uma seringa de 1 ml verde Norm-Ject com solução de sintonia. Rode o selector de porta amostra para "carregar", injetar 450 ml de solução de sintonia, ligue o selector para "injetar". Na guia Calibração de Missa do Acquisit Dados íon janela Configurações, pressione "Executar" para monitorar o que as massas estão fluindo por. O lado esquerdo da janela é menor massa, enquanto que o lado direito é mais elevada em massa. Nota: existirão sinais na região de 9400-9800 TOF, devido aos isótopos de xénon no gás árgon (Figura 3). Espere até que os isótopos de soluções de afinação começam a aparecer como faixas neste display (Figura 4).

Figura 3. Missa janela da guia de calibragem, mostrando os níveis de fundo para vários isótopos após a solução de lavagem e enxágüe. A região em torno TOF 9400-9800 corresponde a isótopos de xenônio no gás argônio, e deve estar sempre presente. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 4. Missa janela da guia de calibração, mostrando faixas verticais de vários isótopos em DVS solução tuning. Clique aqui para ver maior figura .

4. Volte para o Massa (s) por leitura janela e pressione o verde botão "Play" no canto superior esquerdo. Cada isótopo seleccionado no passo 2.1 é representada por uma linha de cor diferente. O padrão eixo x é "Time", em seg. Monitorizar os níveis de isótopos diferentes até que eles são estáveis.
5. Sintonia da corrente. Na guia Parâmetros da janela Configurações de Aquisição de Dados, selecione "corrente" no menu drop-down. Vamos começar = 0, acabamento = 10 valor do passo, = 0,5 tempo, estabelecendo-se = 200, e pressione "salvar". Clique novamente no Massa (s) por janela Leitura e jogo da batida. O eixo x é agora "atual". Notar que os sinais de pico de isótopos (Figura 5), e r ECORD. Na guia Configuração do DAC Canais da janela de configuração do instrumento, desça até "atual" e digite o novo valor. Pressione o botão "Definir valor actual", depois em "salvar".

Figura 5. Perfil ajuste atual.

6. Sintonia do gás tornar-se-. Alterar menu drop-down para "gás Make-up". Vamos começar = 0,55 final, = 0,95 valor do passo, = 0,05, tempo de sedimentação = 200. Pressione salvar. Voltar para a Massa (s) por janela Leitura e jogo da batida. O eixo x é agora "Make-up gás" taxa de fluxo. Gravar em que os sinais de pico de isótopos. Observar o rápido aumento da "Gd155" sinal perto do fim (Figura 6). Voltar para a guia Configuração DAC Canais, desça até "gás Make-up", e digite o novo valor. Pressione o botão "Definir valor actual", depois em "salvar".

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Figura 6. Make-up perfil sintonia gás.

7. Proporção de gravação desejado isótopo óxido vs. Faça uma injeção de 450 segundo ml de solução de sintonia. Na guia Parâmetros, selecione "Time" a partir do menu drop-down, vamos começar = 0 end, = 10, valor do passo = 1, tempo de repouso = 200. Pressione o botão "salvar". Hit "play" em Massa (s) por leitura janela. Após as linhas de ter estabilizado (Figura 7), use o cursor para ler o valor nas caixas superior esquerdo para Tm169 ou Tb159 (maior valor) e também o valor "Gd155" (<3% do valor mais elevado). Estes valores também podem ser salvos em um arquivo de ajuste para referência futura.

Figura 7. Medição de intensidades de ajuste de sinal solução após a otimização de gás atual e Make-up.

8. Limpeza de samloop de PLE. Injectar 3 ml de água MilliQ através do laço de amostra, seguido de 500 ul de solução de lavagem DVS. Monitorar o progresso da limpeza pressionando "corrida" na guia Calibração de Massa. Lavar até que a intensidade das estrias (Figura 4) começa a diminuir, siga por 3 ml de água MilliQ e monitor até que a níveis de fundo (Figura 3).

3. Amostras de funcionamento

1. Abrir a janela de aquisição. Configurações padrão: fazer uma análise = On-The-Fly, o sinal para analisar os dados = Dual, calibração de contagem dupla =. Redução de Ruído é selecionado. Qualquer um destes pode ser alterado, se desejado. Digite o nome do arquivo. Todos os arquivos devem ser salvos no :/ E / unidade.
2. Definir atrasos de aquisição. Haverá um ligeiro atraso no registo de eventos celulares de cerca de 30 segundos, devido ao comprimento do tubo entre o circuito de amostra e do nebulizador. Portanto, a soma total de "atraso Aquisição" e "st Detectoratraso capacidade "deve ser de pelo menos de 30 seg. atraso estabilidade Detector deve ser pelo menos de 20 seg.
3. Definir dados de tempo de coleta. "Tempo de aquisição" é o número de segundos que você deseja executar a sua amostra. Enchendo toda a malha 450 ul de amostra seria necessário para completar 600 sec. Sugere-se que 50-100 seg ser adicionado ao fim do tempo de execução para minimizar amostra carry-over.
4. A ressuspensão das amostras. Para minimizar a acumulação de sais na máquina, sugere-se que, pelo menos, duas lavagens em água MilliQ ser feito no final da coloração das células, seguida por uma re-suspensão final em água MilliQ. O volume de água MilliQ utilizado para ressuspender o sedimento de células variará dependendo do número de células que começaram com a recuperação de células e, após o procedimento de coloração inteiro. Um bom ponto de partida é 10 ⁶ (partida) células / ml. Após ressuspensão, filtrar através de um filtro celular para remover agregados.
5. Inicial da amostra executado. Digite um novo nome para a amostra. Mudar a válvula de loop de amostra para "carregar", injectar a amostra, voltar para "injetar", depois clique em "Run" na janela de Aquisição.
6. Registo de eventos celulares. As células serão representados na janela do instantâneo como coleções horizontais de marcas em cada canal isótopo / marcador vertical (Figura 8). Enquanto o citómetro de massa podem registar-1000 células / s, melhor resolução entre os eventos celulares é geralmente obtida a 300-500 células / seg. Isto corresponde a uma média de ~ 1 atualização celular / tela. Pode levar até 30 seg antes do contador de eventos celular começa a subir. Isto é devido ao "On-the-fly" de processamento de dados, sem informações sobre o evento celular é perdido.

Figura 8. Janela Acquisition amostra durante funcionamento, mostrando as linhas horizontais de pontos correspondentes aos elementos associados com três eventos celulares separados.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.

7. Qualidade de eventos celulares. Notar qualquer fundo faixas em cada canal de isótopos, bem como a taxa do evento de células. O citómetro de massa reconhece um "evento de células", como um certo aumento no sinal acima do fundo, de modo de sinal de fundo a partir de metal livre ou não ligada do anticorpo pode alterar a "célula" evento de contagem. Além disso, as células funcionando em uma concentração demasiado elevada pode provocar um aumento do número de eventos de gibão. O fundo pode ser diminuída por lavagens adicionais ou de diluição maior de células. Dupletos podem ser minimizados através da diluição maior de células, com o custo de maior tempo de execução.
8. Acabamento de aquisição de dados de amostra. Quando o tempo de aquisição tenha sido alcançado, a recolha de dados irá terminar. Haverá um pouco de atraso antes de uma janela pop-up com um botão "OK" aparece, novamente, isso é devido ao "On-the-fly" processamento de dados. Aquisição da amostra também pode ser parado Prematurely por bater o botão "Stop". Neste caso, todos os eventos celulares já registados serão contados e transformados em arquivos de saída.
9. Injecção de pelo menos 500 ul de água MilliQ entre cada uma das amostras também ajuda a minimizar a mistura de amostras.

4. Limpeza da máquina após o uso

1. Lave solução. Após a amostra final é executado eo loop de amostra lavada com água, injetar 450 ml de solução de lavagem para o loop de amostra. Monitorar o lançamento de metal livre na guia Calibração de Massa da janela Configurações de Aquisição de Dados como no Passo 2,8 (Figura 9). Quando o sinal de metal livre começa a diminuir, lave com 3 ml de água MilliQ e monitorar os níveis de fundo até que sejam alcançados.

Figura 9. Missa janela da guia de calibração, durante o pós-run limpeza com solução DVS Wash. As listras verticais em TOF região 9800-11000 são anticorpos rótulo isótopos sendo limpos para fora da máquina. As estrias verticais ao redor TOF 11.500 correspondem aos dois isótopos intercalador IR. Clique aqui para ver maior figura .

5. Desligar a máquina

1. No separador Controlador RFG da janela Configuração do instrumento, selecione "Stop Plasma". Quando o procedimento estiver concluído, haverá uma janela pop-up pedindo que você retire o nebulizador. Pressione o botão "OK". Na aba do gabinete, desligue o aquecedor. Fechar a válvula da fonte de árgon.
2. A remoção do nebulizador. Remover o nebulizador a partir da câmara de pulverização por puxar cuidadosamente para trás. Desaparafuse o tubo de introdução de amostra de 1,6 passo e colocar de lado. Desaparafuse o make-up de conexão introdução de gás para soltar um pouco, em seguida, puxe o nebulizador fora. Deixando o encaixe aparafusada irá reduzir as chances de losing a borracha preta o-ring e peça cónica de plástico branco.
3. Limpeza nebulizador. Backflush ambas as portas do nebulizador com citranox 5% utilizando a seringa e tubo como no Passo 1.3. Loja, coberto, no citranox 5% até a próxima utilização.

Representative Results

Seguindo o protocolo acima deve realizar quatro coisas. Em primeiro lugar, permitindo que o tempo de aquecimento adequado para o citômetro de massa irá produzir um plasma quente e estável necessário para o sinal ótima e formação de óxido mínimo. Lavagem, segundo adequada do citómetro de massa com MilliQ água e solução de lavagem DVS (Figura 9) vai ajudar a reduzir os níveis de metal de adsorção para a tubagem e outras partes da máquina, ajudando a reduzir o fundo durante a aquisição de amostras (Figura 8). Ele também irá ajudar a remover quaisquer células que podem ficar preso na máquina e, assim, minimizar o extravasamento de amostra para amostra. Em terceiro lugar, enquanto que a formação de óxidos não pode ser totalmente evitado tuning, adequada do citómetro de massa (Figuras 5-7) ajudará optimizam o sinal total na massa M desejado, minimizando ao mesmo tempo o fundo em massa de óxido de M 16. Como visto na Figura 10, o ajuste indevido (magenta) aumentou significativamente a formação de óxido naM 16 em comparação com a amostra devidamente afinado (azul escuro). Isto tem o efeito de diminuir ligeiramente o sinal desejado a M, e um aumento significativo na interferência de fundo indesejável M 16.

Finalmente, a lavagem adequada da amostra em tampão e, finalmente, com água MilliQ deve reduzir metal / anticorpo sinal de fundo para um nível aceitável. As lavagens com água MilliQ e ressuspensão são essenciais para a manutenção estável As definições actuais ao longo de várias horas de tempo de execução. Diluição apropriada da amostra em água MilliQ tem de ser determinada numa base de amostra diária. No entanto, a diluição para ~ 10 ⁶ (partida) células / ml é um bom lugar para começar. Com base na primeira amostra de um conjunto, de diluição maior ou menor para as amostras subsequentes podem ser acomodados. Lavagem apropriada e diluição adequada irá assegurar fundo mínimo e a maior resolução de células, enquanto que o equilíbrio da necessidade de velocidade (Figura 8).

Figura 10. Efeito do ajuste adequado do sinal desejado, ea diferença de formação de óxidos de lantanídeos entre metais diferentes. Esferas de poliestireno contendo natural abundância La139, Pr141, Tb159, Tm169 e Lu175 de Ciências DVS foram executados em modo de aquisição da célula. Amostras separadas das esferas foram executados com os indicados make-up taxas de fluxo de gás (comparar com a Figura 6). Os dados foram analisados ​​usando FlowJo v9.4.9 para Mac, incluindo gating fora restos de contas quebradas. A amostra foi devidamente sintonizado a 0,74 L / min. Isto teve maior intensidade de sinal do que a taxas mais baixas e maior fluxo de sinal em "M" massas metálicas com menos sinal nas "M 16" massas de óxido de que o sinal mal sintonizado. A. Sinal de "M" massa La139 e Tm169. Note que La139 intensidade do sinal é afetado mais de Tm169 da Make-up do fluxo de gás. B. sinal na massa de óxido de "M 16"es 155 e 185, correspondendo a La139 + O16 e O16 + Tm169 óxidos, respectivamente. Não há real "Gd155" ou "Re185" presente nos grânulos. O sinal de óxido no "Gd155" canal é particularmente forte, devido à La139 ser facilmente oxidado. Isto representa um dos níveis mais elevados de óxido que se pode esperar encontrar. C. Gráfico de "M" e "M" 16 intensidades de sinal como uma função da Composição do fluxo de gás. Ícones representam cheios de massa "M", enquanto ícones abertos representam massa "M 16". A cor das linhas correspondem ao respectivo massa "M". Observe que La139 e Pr141 são altamente afetados pela Make-up do fluxo de gás, mesmo chegando a um ponto onde mais massa "M 16" óxido está presente do que massa "M". Clique aqui para ver maior figura .

Discussion

Para as últimas décadas, a citometria de fluxo de fluorescência tem sido um método laborioso para a análise de células individuais, quer em termos de expressão de superfície e em ensaios funcionais. No entanto, os problemas de sobreposição espectral dos corantes fluorescentes tem limitado o número de marcadores em simultâneo. Embora experimentos com mais de 12 marcadores simultâneos têm sido relatados, o montante da compensação necessária torna esta tecnicamente difícil.

Em vez de fluoróforos, citometria de massa iniciada por DVS Sciences utiliza polímeros com sítios de quelação de metais como etiquetas para anticorpos ^1-3. Devido à pureza dos metais e a resolução de massa de ICP-MS, não existe efectivamente "sobreposição espectral." Uma vez que a maioria dos elementos utilizados não são biologicamente relevante, também há pouco fundo para provocar "autofluoresence". Estes factos permitem o uso de mais do que 30 marcadores em simultâneo dentro de uma única experiência. ^6,7 Existe também uma maior dyda faixa dinâmica do sinal no ICP-MS do que em uma experiência típica de fluorescência.

No entanto, citometria de massa tem limitações. É uma técnica destrutiva: as células não podem ser recuperados por manipulação e experimentação posterior. O citómetro de massa tem um requisito estrito para a presença de metais: se um metal não está presente, uma célula não será detectado. Esta é a principal razão para a utilização de quelantes de metais intercaladores de ADN para assegurar a correcção por cento de pai-estatísticas, tal como todas as células irão ser detectados independentemente de qualquer ligamento sondas de anticorpo. ^3,6-7 fim, a eficiência de transmissão de corrente da célula da máquina é de ~ 25%, em comparação com um rendimento de> 90% para um citómetro de fluxo de fluorescência. Assim, um maior número de células de partida é muitas vezes necessário, particularmente para populações de células raras. No entanto, esta é normalmente equilibrado pelo facto de que uma amostra de massa citómetro único substitui muitas vezes múltiplas amostras fluorescentes. Finalmente, a célula máximo acervotaxa ition é muito mais lento do que o padrão citómetros de fluxo fluorescente em ~ 1000 células / seg; taxa ideal é muitas vezes a metade. Portanto, cada amostra leva mais tempo para ser executado.

Diversos trabalhos têm sido publicados recentemente sobre a coloração de vários tipos de amostras de células. ^3,5-7 O objetivo deste artigo é fornecer informações sobre o uso adequado de um citômetro de massa CyTOF ^TM para amostras em execução. Manutenção do nebulizador por retrolavagem com e armazenamento em citranox 5% será minimizado acumulação de detritos celulares e de metais, reduzindo assim a probabilidade de entupimento. Manutenção da máquina para um desempenho óptimo tem duas partes. Primeiro, o ajuste adequado (corrente, gás Make-up) da máquina em pelo menos uma base diária ajuda a garantir uma medição correta. Lavagem, segundo adequada com água MilliQ entre cada uma das amostras com uma solução de lavagem e no final da roda de remover built-up detritos orgânicos e inorgânicos vai ajudar a minimizar a formação em geral e carryoverentre as amostras. Finalmente, a qualidade da preparação da amostra tem um grande impacto sobre a qualidade da aquisição de dados. Várias lavagens em tampão e, finalmente, com água MilliQ ajudar a remover qualquer metal a partir do fundo, ou intercaladores de ligação do anticorpo não específico. Diluição apropriada da amostra de células vai ajudar a equilibrar melhor resolução entre os eventos celulares, minimizando o tempo total de funcionamento, por exemplo. Diluição adequada também ajuda a minimizar a probabilidade de causar uma obstrução no nebulizador.

Solução de problemas comuns

1. A máquina não ter passado "RFG Prepare" passo durante a partida

Sob a guia do gabinete do Instrumento de set-up, pressione "Reset" sob RFG. Tente iniciar a máquina. Se isso não resolver o problema, feche o software, reabrir, pressione "Reset" de novo, e tentar começar. Se isso ainda não resolver o problema, verifique o disjuntor RFG gerador no canto traseiro esquerdo da máquina. Se tropeçar,reposicionar para "On", clique em "Reset", e tentar começar. Se isso ainda não resolver o problema, entre em contato DVS.

2. A máquina desliga-se durante a execução

1. Verifique a fonte de argônio. Se a pressão de árgon, atingindo a máquina fica abaixo de cerca de 40 psi, o software executa um desligamento automático.
2. RFG excedido 100W erro. Isso ocorre quando a demanda de energia para o plasma vai fora do 1300 + / - 100W janela, e o software executa um desligamento automático. Isso geralmente é causado por spray desigual do nebulizador, gotas particularmente grandes. Isto arrefece o plasma excessivamente, o que requer mais energia para manter o plasma. Isto pode acontecer devido a uma força excessiva usado para prender o tubo da seringa para a seringa durante a mudança da bomba de seringa. Isto faz com que uma grande quantidade de gotículas de pulverização, arrefecimento do plasma. Se este for o caso, basta reiniciar a máquina.

Isso também pode acontecer devido a grandes gotas que começam aformam-se quando o nebulizador começa a entupir. Se este erro persistir, retire o nebulizador para a limpeza, coloque um nebulizador limpo e reiniciar.

Muito menos frequentemente, o tubo de amostra fina entre o loop de amostra e pode obstruir o nebulizador. Isto pode ser diagnosticada por anormalmente baixa taxa de fluxo de líquido quando o tubo é retirado do nebulizador. Se este for o caso, remova a tubulação afetada e acessórios para ser reconstruído com tubos de fresco, e substituir por um nebulizador acessórios novos e kit de tubulação.

3. Sem estrias de isótopos (ou eventos celulares) visível durante a aquisição de célula de amostra (Figura 8), ou enquanto vê janela da guia de Massa de calibração (Figuras 3, 4, 9)

1. Verifique a bomba de seringa. Isso muitas vezes ocorre devido à esquecendo de clicar em "play" durante a mudança da seringa bomba de seringa. Isso também pode acontecer se "pausa", em vez de "stop", é atingido durante a troca de seringa. "Pausa" não repõe o contador de volume na bomba de seringa, E ele vai parar em 3,000 mL de volume dispensado, independentemente de restos de líquido. Finalmente, a seringa pode ter ficado sem água.
2. Válvula de retenção de amostra. Certifique-se de carregar amostra, enquanto em "Load", e depois mudar para "injetar" antes de iniciar a corrida amostra.
3. Esgotada ou muito, diluir a amostra. Você pode ter corrido tudo da sua amostra, verificar cálculos tempo de aquisição (ver passo 3.3). Alternativamente, você pode ter calculado mal o fator de diluição, e / ou perdidos mais células do que o esperado durante o processamento.
4. Entupidos nebulizador. Isso geralmente é precedido por um erro RFG (ver edição 2b), mas uma obstrução pode notiecably reduzir a eficiência de transmissão de células antes de causar um desligamento.

Questões 3C e 3D também pode ser verificado através da execução de uma amostra da UE contendo esferas de calibração de poliestireno. Eles são fornecidos a cerca de 1 milhão / mL (vórtice bem antes de desenhar amostra!). Portanto, o enchimento do circuito de amostra 450 uL daria apximadamente 450 mil contas. O CyTOF ^TM eficiência de transmissão celular é dependente da máquina, mas cerca de 15-30%. Portanto, os eventos 67,500-135,000 grânulo seria esperado a partir de que a injecção. Números abaixo que são consistentes com uma obstrução no tubo ou nebulizador.

A célula / eficiência de transmissão talão é algo para testar ocasionalmente, para anotar todas as tendências de longo prazo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF mass cytometer	DVS Sciences
Wash solution	DVS Sciences	201071	0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads	DVS Sciences	201073	Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads	DVS Sciences	Not yet commercially-available	Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated)	Fisher Scientific	A467-500	Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml	BD	352235	used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silicone-free, latex-free
MilliQ water			18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	acid detergent
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-high purity