Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التوقيت كروموسوم النسخ المتماثل جنبا إلى جنب مع نيون Published: December 10, 2012 doi: 10.3791/4400
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University

Summary

يوصف أسلوب الكمي لتحليل توقيت تكرار كروموسوم. يستخدم الأسلوب BrdU التأسيس بالاشتراك مع الفلورسنت

Abstract

الثدييات تكرار الحمض النووي يبدأ في مواقع متعددة على طول الكروموسومات في أوقات مختلفة خلال المرحلة S، وبعد تكرار برنامج الزمني. ويعتقد مواصفات توقيت النسخ المتماثل لتكون عملية ديناميكية ينظمها العظة الأنسجة الخاصة والتنموية التي تستجيب لتعديلات جينية. ومع ذلك، فإن آليات تنظيم أين ومتى يبدأ على طول تكرار الحمض النووي الكروموسومات لا تزال غير مفهومة تماما. مثلي الكروموسومات تكرار عادة بشكل متزامن، ولكن هناك استثناءات لهذه القاعدة البارزة. على سبيل المثال، في خلايا الثدييات أنثى واحدة من اثنين من الكروموزومات العاشر يصبح تكرار أواخر خلال عملية تعرف باسم تعطيل X 1. جنبا إلى جنب مع هذا التأخير في توقيت النسخ المتماثل، تشير التقديرات إلى أن 2-3 ساعة، تصبح إسكات transcriptionally غالبية الجينات على الكروموسوم X واحد. بالإضافة إلى ذلك، منفصلة رابطة الدول المستقلة موضع المفعول، والمعروفة باسم مركز تعطيل X، ينظم هذه العملية تعطيل X، بما في ذلك الالحث (ه) من توقيت تكرار تأخر على كروموسوم X غير نشط بأكملها. وبالإضافة إلى ذلك، إعادة ترتيب الكروموسومات الموجودة في بعض خلايا السرطان والخلايا في تعرضوا للإشعاع المؤين عرض تأخير كبير في توقيت تكرار> 3 ساعات يؤثر على كروموسوم كامل 2،3. العمل الأخير من المختبر إلى أن تعطل منفصلة رابطة الدول المستقلة المفعول جسمية مواضع نتيجة لتكرار النمط الظاهري في أواخر غاية التي تؤثر على ال 4 كروموسوم كامل. دراسات 'الهندسة كروموسوم' إضافية تشير إلى أن إعادة ترتيب الكروموسومات معينة تؤثر على العديد من الكروموسومات نتيجة مختلفة في هذا النمط الظاهري النسخ المتماثل توقيت غير طبيعية، مما يدل على أن جميع الثدييات تحتوي على الكروموسومات منفصلة رابطة الدول المستقلة المفعول مواضع التي تتحكم السليم توقيت تكرار الكروموسومات الفردية 5.

هنا، نقدم طريقة لتحليل الكمي للتوقيت تكرار كروموسوم جنبا إلى جنب مع الفلورسنت في الموقع التهجين. هذاالأسلوب يسمح للمقارنة مباشرة لتوقيت النسخ المتماثل بين الكروموسومات المتجانسة داخل الخلية نفسها، وجرى تكييف في الفترة من 6. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحديد لا لبس فيه من إعادة ترتيب الكروموسومات التي ترتبط مع التغيرات في توقيت النسخ المتماثل التي تؤثر على كروموسوم كامل. هذا الأسلوب له مزايا أكثر وضعت مؤخرا مجموعة صغيرة عالية الإنتاجية أو التسلسل البروتوكولات التي لا يمكن التمييز بين الأليلات مثلي على تقديم ترتيبها وإعادة ترتيبها من الامم المتحدة والكروموسومات. وبالإضافة إلى ذلك، لأن الأسلوب هو موضح هنا يقيم الخلايا واحدة، فإنه يمكن الكشف عن التغييرات في توقيت تكرار كروموسوم على إعادة ترتيب الكروموسومات الموجودة في جزء فقط من الخلايا في السكان.

Protocol

1. BrdU التأسيس (وسم الطرفية)

  1. الخلايا لوحة لنحو 70٪ التقاء في زراعة الأنسجة 150 مم على مدار 24 ساعة طبق قبل إضافة BrdU.
  2. استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام كاملة جديدة تحتوي على 20 ميكروغرام / مل BrdU (سيغما) في نقاط الوقت المناسب قبل موسم الحصاد. تستزرع من خلايا طول الوقت في وسائل الإعلام مع BrdU سوف تختلف مع نوع من الخلايا والأنواع، وعادة المرحلة G2 تستمر ما بين 2 و 5 ساعة (الشكل 1).

2. حصاد كروموسوم الثقافات خلايا أحادي الطبقة

  1. إزالة وسائل الإعلام من لوحة الثقافة وجمع 10 مل في أنبوب 15 مل المخروطية الطرد المركزي. تجاهل وسائل الإعلام المتبقية.
  2. شطف الخلايا مرة واحدة مع 10 مل Versine [أو HBSS (سيغما)].
  3. إضافة 5 مل التربسين 0.25٪ في Versine (أو HBSS) لوحة. احتضان في درجة حرارة الغرفة حتى يتم فصل الخلايا من اللوحة.
  4. إضافة تعليق trypsinized الخلية إلى أنبوب يحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام من الخطوة 2.1. </ لى>
  5. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة لخلايا بيليه. نضح طاف، وترك 0.5 مل من وسائل الإعلام بالإضافة إلى بيليه الخلية.
  6. إعادة تعليق الخلايا بشكل دقيق من قبل pipetting مع ماصة باستور.
  7. إضافة 3 قطرات من محلول ناقص التوتر (0.075 M بوكل (سيغما) تحسنت إلى 37 ° C)؛ مزيج تعليق الخلية مع ماصة باستور. إضافة 0.5 مل حل ناقص التوتر وتخلط من جديد مع ماصة باستور. تحقيق حجم حل ناقص التوتر إلى 5 مل وتخلط مرة أخرى. احتضان في C ° 37 دقيقة ل20-45، اعتمادا على نوع من الخلايا.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. نضح طاف، وترك 0.5 مل من وسائل الإعلام بالإضافة إلى بيليه الخلية.
  9. إعادة تعليق بيليه الخلية عبها بلطف الأنبوب. سوف تورم الخلايا osmotically يكون هشا في هذه المرحلة، ولذلك يجب الحرص على عدم تعطيل الأغشية السيتوبلازمية.
  10. إضافة 3 قطرات من (حمض الخليك الجليدية 01:03: الميثانول) لCarnoy مثبت؛ مزيج من pipetting بلطف مع pipett باستوره. إضافة 0.5 مل مثبت ومزيج من pipetting بلطف ماصة باستور مع. تحقيق حجم 5 مل مثبت لوتخلط مرة أخرى عن طريق pipetting بلطف ماصة باستور مع. ويمكن تخزين الخلايا الثابتة في الظلام في -20 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
  11. الطرد المركزي ونضح كما في الخطوة 2.8.
  12. إعادة تعليق بيليه خلية في مثبت العذبة؛ تقدير حجم بيليه وإضافة 10X ~ حجم مثبت في Carnoy.
  13. إضافة تعليق الخلية قطرة من الحكمة على الرطب، والشرائح المجهر الجليد الباردة؛ الاستمرار على الشريحة بزاوية ° 45 ~ والسماح للتعليق الخلية في التدفق على سطح الشريحة. وضع شريحة مسطحة على مناشف ورقية والفيضانات الشريحة مع تثبيتي، وتسمح للهواء الجاف. تحقق الشرائح وجود فروق الإنقسامية باستخدام مجهر مقلوب.

3. ريبونوكلياز العلاج والجفاف الإيثانول

  1. مكان 200 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A (سيغما) في SSC 2X إلى كل شريحة، واحتضان عند 37 ديز؛ مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. غسيل 3 مرات مع الشرائح SSC 2X، 7.0 درجة الحموضة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لكل منهما.
  3. يذوى الشرائح من خلال سلسلة (سيغما) EtOH (70٪، 90٪ و 100٪) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لكل منهما.
  4. الهواء الجاف الشرائح في درجة حرارة الغرفة.

4. إعداد الكوكتيلات دقق في BAC زائد كروموسوم معين السنترومير دقق تعداد (CEP) أو للدهانات كروموسوم كامل في الموقع التهجين

  1. لتهجين BAC / CEP في وقت واحد، وإعداد 2 الكوكتيلات التحقيق منفصلة عن التهجين مسبقة. لقد وجدنا أن ما قبل التهجين والتحقيقات BAC CEP بشكل منفصل تحت stringencies نتائج مختلفة في أقل الخلفية وشدة أكبر الإشارة. كما وجدنا أنه يمكن أيضا أن تستخدم Fosmids الفردية بدلا من استنساخ BAC. صياغة كوكتيل موضح أدناه يمثل حجم لشريحة واحدة. إذا تجهيز عدة شرائح باستخدام نفس تحقيقات ببساطة زيادة حجم appropr iately.

    * BAC كوكتيل DNA التحقيق:

    11،5 العازلة التهجين ميكرولتر (50٪ الفورماميد (سيغما) / 2X SSC / دكستران كبريتات (سيجما)) 2 ميكرولتر DH 2 O

    2،5 ميكرولتر BAC/Cot1 DNA في DH 2 O (انظر أدناه لوصفها بروتوكول) 15 إجمالي حجم ميكرولتر

    * كوكتيل CEP التحقيق:

    7 التهجين العازلة ميكرولتر CEP (65٪ Formamide/2x SSC / دكستران كبريتات) 2 ميكرولتر DH 2 O

    1 ميكرولتر الحمض النووي CEP/Cot1 (شراؤها prelabeled مع الطيف الأحمر Orange/Cy3/Texas) 10 إجمالي حجم ميكرولتر

    * بعد تغيير طبيعة وقبل التهجين (الخطوة 5.1) مزيج BAC التحقيق مع التحقيق CEP في 03:02 نسبة 25 الكوكتيلات التحقيق ميكرولتر / الشرائح والمزيج.

    OR

  2. قسامة 20 ميكرولتر / الشريحة من الجامعة كروموسوم التحقيق الدهانات (Cy3/Texas الأحمر) في أنبوب. انتقل إلى الخطوة تمسخ وقبل التهجين.
"> 5. الشرائح وتمسخ ودقق في الموقع التهجين

  1. تفسد التحقيق كوكتيل (ق) في 75 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في C ° 37 قبل هجن مقابل 30 دقيقة للسماح للDNA Cot1 لهجن لتسلسل المتكررة ومنع التهجين بعد الطورية الكروموسومات.
  2. الشرائح تفسد في الجرار Coplin في SSC Formamide/2x 70٪، درجة الحموضة 7.0 عند 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  3. يذوى على الفور من خلال سلسلة الشرائح EtOH (70٪، 90٪ و 100٪) في الجرار Coplin عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لكل منهما.
  4. تسمح الشرائح للهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة.
  5. قبل الدافئة الشرائح إلى 45 ° C على الشريحة الأكثر دفئا ل10 دقيقة الأخيرة من التحقيق قبل hybridzation (الخطوة 5.1). مزيج الكوكتيلات التحقيق قبل المهجنة إذا لزم الأمر وإضافة 25 ماي إلى كل شريحة، وضع بلطف ساترة على كل شريحة وختم على طول الحواف مع الاسمنت والمطاط. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في غرفة مرطب لمنع التبخر.

معشوقة = "jove_title"> 6. التهجين آخر يغسل

  1. غسل الشرائح في الجرار Coplin 3 مرات في SSC formamide/2x 50٪، ودرجة الحموضة 7.0 في C ° 38-40 دقيقة لمدة 3 لكل منهما. قد درجة حرارة تتراوح بين تحقيقات يغسل. إذا كان هناك ارتفاع التهجين الخلفية يمكنك زيادة درجة حرارة يغسل. على العكس، إذا كانت الإشارة ضعيفة وليس هناك خلفية ثم يمكنك تقليل درجة حرارة هذه يغسل.
  2. غسل الشرائح العازلة 1 مرة في PN في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق، وانتقل إلى الخطوة الكشف BrdU.

7. كشف BrdU

  1. الشرائح العازلة مع كتلة PNM لمدة 10 دقيقة (200 ميكرولتر / الشرائح) في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  2. استنزاف الشرائح عن طريق تشغيل ميزة على منشفة ورقية. إضافة 100 ميكرولتر من مكافحة BrdU-FITC (50 ميكروغرام / مل أو ميليبور روش) في المخزن المؤقت PNM لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. يغسل 3 مرات في الشرائح العازلة PN في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لكل منهما.
  4. استنزافPN الزائدة عازلة على الشرائح في وقت واحد عن طريق تشغيل ميزة على منشفة ورقية. إضافة 20 ميكرولتر دابي / antifade تصاعد الحل (إينفيتروجن). تغطية الشريحة مع منشفة ورقية ثم اضغط لأسفل على ساترة لطرد فقاعات الهواء ويزيد تصاعد الحل. انتقل إلى تحليل الصور.

8. التقاط الصور وقياس BrdU التأسيس

  1. يتم التقاط الصور مع مجهر BX61 أوليمبوس الكاميرا أوليمبوس ونيون CCD، آلية موضوعية 100X عجلة تصفية وCytovision البرمجيات التطبيقية (التصوير). يتم التقاط BrdU باستخدام عامل تصفية FITC؛ الدهانات كروموسوم (تكساس الأحمر، Metasystems أو Cytocell)، يتم التقاطها في BAC (Cy3) وتحقيقات CEP (Vysis الطيف أورانج) باستخدام الأحمر تكساس أو تصفية Cy3؛ يتم التقاط دابي مع تصفية دابي (انظر أرقام 2 و 3).
  2. يتم تحديد الكروموسومات الفردية في المصالح مع BAC / CEP أو تحقيقات كروموسوم معين الطلاء (أرقام 2B 3B و). استخدامالبرنامج Cytovision، كل كروموسوم من الفائدة هو "خفض التدريجي" من انتشار الطورية ككل، يتم رسم خط من خلال على طول الكروموسوم من الذراع القصير الذراع الطويلة ل(أرقام 2C و 3C). ويستخدم البرنامج Cytovision لقياس كثافة بكسل الملف على طول كل كروموسوم. البرنامج Cytovision بحساب المساحة التي شغلتها بكسل والكمي لشدة البيكسلات ممثلة إشارات BrdU أو دابي على كل كروموسوم معزولة. ثم يتم ضرب كثافة بكسل متوسط ​​يمثله كل كروموسوم من المنطقة التي تحتلها تلك بكسل للحصول على العدد الإجمالي للبكسل (الجدول 1 والشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا البروتوكول لتصور المناطق أحدث تكرار الكروموسومات. وفقا لذلك، فإن نمط النطاقات التأسيس BrdU يسمح للكشف عن مناطق من الكروموسومات تكرار بنشاط، والاختلاف في توقيت النسخ المتماثل بين CHROMOSوينظر أزواج OME عن الاختلافات في هذا النمط النطاقات (أرقام 2 و 3). وأخيرا، يمكن مقارنة هذه الاختلافات في أنماط ملزمة ليعرف خرائط توقيت النسخ المتماثل لكل كروموسوم 6،7، والذي يسمح لتقدير تكرار الفرق بين التوقيت الكروموزومات المتماثلة أو الأسلحة الكروموسوم 4. على سبيل المثال، كروموسوم 2 6 'في الشكل 3A عرض الفرق في النطاقات نمط ساعة 2> بالمقارنة مع توقيت النسخ المتماثل العادي من كروموسوم 6 4.
    وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء مماثل لتلك الموصوفة هنا استخدمت بنجاح لدراسة توقيت متزامن النسخ المتماثل بين الكروموسومات X غير نشط وفعال 8،9. تم التعرف على الكروموسومات X النشطة وغير النشطة باستخدام الدهانات كروموسوم X. تم الحصول عليها باستخدام الصور المزح mFISH البرمجيات (Vysis) وعدد بكسل التي تحتلها الكروموسومات X وعدد وحدات البكسل التي تحتلها لا fluorescentlyثم تم حساب beled BrdU باستخدام صورة NIH ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. نيك ترجمة DNA BAC لوصفها نيون (Vysis)

  1. إضافة مزيج التحقيق التالي لبرود أنبوب microfuge:
    70 ميكرولتر (4 ميكروغرام DNA) في DH 2 O
    0.2 ملي مول 10 ميكرولتر dUTP-البرتقالي أو الأخضر
    0.1 ملي مول 20 ميكرولتر dTTP
    20 ميكرولتر العازلة 10X ترجمة نيك
    40 ميكرولتر NT dNTP ل(ناقص dTTP)
    40 ميكرولتر ترجمة نيك انزيم
    200 إجمالي حجم ميكرولتر
    احتضان @ 16 ° CO / N. وقف رد الفعل عن طريق التسخين في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. البرد على الجليد لمدة 5 دقائق.
  2. ترسيب DNA مع الإيثانول عن طريق إضافة ما يلي إلى هذا المزيج التحقيق:
    200 ميكرولتر حل التحقيق
    48 ميكرولتر 3 M NaOAc
    160 ميكرولتر Cot1DNA (.25 ميكروغرام / UL)
    1200 ميكرولتر EtOH 100٪
  3. المحل في -80 ° C لمدة 10 دقيقة لO / N.
  4. تدور طن الباردة في 12000 x ج لمدة 20 دقيقة. صب قبالة EtOH. غسل 1 مرة مع EtOH 70٪. تدور كما كان من قبل. صب قبالة EtOH. الهواء الجاف فقط حتى يتبخر EtOH. resuspend في 40 ميكرولتر O 2 درهم للتركيز النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي BAC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد مثال على تكرار تحليل توقيت الكروموسوم البشري 6 في الشكل 2. تعرضت الخلايا التي تحتوي على الجين حذف ASAR6 4، يقع في 6q16.1، لBrdU لمدة 5 ساعة، تحصد للخلايا الإنقسامية وتجهيزها للأسماك مع الطلاء التحقيق كروموسوم 6 (Vysis) وBrdU التأسيس. نلاحظ أن هناك فرقا كبيرا في نمط BrdU النطاقات بين في 6 اثنين، وهو ما يتسق مع تأخير في توقيت تكرار ساعة 2> لأحد في 6 كروموسوم [انظر (4) لتوقيت تكرار النطاقات نمط الصبغي 6 قبل حذف]. وبالإضافة إلى ذلك، هناك فرق كبير في المبلغ الإجمالي التأسيس BrdU (بكسل) بالمقارنة مع تحليل مماثل للتلوين دابي (الشكل 2D).

ويرد مثال آخر على تكرار تحليل توقيت الكروموسوم البشري 6 في الشكل 3. الخلايا التي تحتوي على سامحذف البريد من الجين ASAR6 4 يظهر في حالة تعرضت لBrdU الشكل 2 لمدة 5 ساعة، تحصد للخلايا الإنقسامية وتجهيزها للأسماك مع التحقيق الذي تجريه كروموسوم CEP 6 زائد على BAC تحتوي على الجين ASAR6 وBrdU التأسيس. لاحظ أن حذف كروموسوم 6 (Δ6) يعرض أكثر BrdU التأسيس ونمط أكثر النطاقات الممتدة من التأسيس BrdU من كروموسوم غير حذف 6. تم تجهيز ينتشر الإنقسامية من 7 خلايا مختلفة في الشكل (3) وتظهر ملامح بكسل لكل من دابي وBrdU في الجدول 1.

الشكل 1
الشكل 1. تسمية محطة BrdU المخطط. A S المرحلة النموذجية في خلايا الثدييات مشاركة لمدة 8 إلى 10 ساعة، وG2 هو عادة 2-5 ساعة. يضاف BrdU لزيادة فترات زمنية (الأسهم الخضراء) لتسمية الأجزاء الأخيرة من الكروموسومات لتكرار. الالكروموسومات في خلايا الثدييات ه تكرار وفق برنامج زمني، مع النسخ المتماثل المبكرة والمتأخرة التي تحدث في بداية ونهاية المرحلة S على التوالي (خط أسود). يتم تأخير الكروموسومات X نشط في توقيت النسخ المتماثل مع غالبية توليف الحمض النووي التي حدثت خلال النصف الثاني من المرحلة S (الخط الأزرق). يتم تأخير الكروموسومات مع توقيت تكرار تأخر في كل بدء والانتهاء من تركيب الدنا، مع النسخ المتماثل المستمر من خلال G2 نشطة (خط أحمر). ويتم حصاد الثقافات غير متزامن للخلايا الإنقسامية وتجهيزها لإدراجها BrdU والأسماك.

الشكل 2
الشكل 2. النسخ المتزامنة من كروموسوم الإنسان 6. تم علاج الخلايا التي تحتوي على حذف هندسيا من الجين ASAR6 4 مع BrdU لمدة 5 ساعة، تحصد للخلايا الإنقسامية وتجهيزها لإدراجها BrdU والأسماك باستخدام معدن الكروم 6 osome الطلاء والتحقيق. كانت ملطخة الحمض النووي مع دابي (الأزرق). A) ويرد انتشار الإنقسامية تحتوي على "النطاقات" نموذجية نمط التأسيس BrdU (الخضراء). تهجين التحقيق كروموسوم الطلاء 6 إلى 2 في 6 كروموسوم (الحمراء) في هذه الخلية. B) واثنان من الكروموسوم "قطع" 6 في (الأول والثاني) وعرض مع التسميات 3 الفلورسنت فصل في صور مختلفة. C) وقد تم تحليل الصبغي 6 وباستخدام برنامج Cytovision وملامح كثافة إشارة لكل من دابي (الأزرق) وBrdU (الخضراء) وأظهرت. الخط الأحمر يشير إلى المسار المستخدم، الذراع القصير من (ع) إلى الذراع الطويلة (ف) لتحديد مقدار كل من BrdU ودابي. ويشير إلى المسافة طول كل كروموسوم من الذراع القصير (ع) إلى الذراع الطويلة (س) في بكسل. D) التحديد الكمي للإشارة إجمالي لدابي ومضان BrdU. تمثل مجموع القيم كثافة بكسل متوسط ​​مضروبا في المنطقة التي يمثلها هؤلاء بكسل.

igure 3 "SRC =" / files/ftp_upload/4400/4400fig3.jpg "/>
الشكل 3. تأخر تكرار كروموسوم الإنسان 6 تحتوي على حذف ASAR6. تم علاج الخلايا التي تحتوي على حذف هندسيا من الجين ASAR6 4 مع BrdU لمدة 5 ساعة، تحصد للخلايا الإنقسامية وتجهيزها لإدراجها BrdU والأسماك باستخدام الصبغي 6 CEP بالإضافة إلى BAC تحتوي على الجين ASAR6 كما تحقيقات. كانت ملطخة الحمض النووي مع دابي (الأزرق). A) ويرد انتشار الإنقسامية تحتوي على "النطاقات" نموذجية نمط التأسيس BrdU (الخضراء). المهجنة في الصبغي 6 CEP التحقيق إلى اثنين في 6 كروموسوم (كبير إشارة حمراء القسيم المركزي)، وتهجين BAC إلى كروموسوم واحد 6 (إشارة حمراء صغيرة على الذراع الطويلة) في هذه الخلية. لاحظ الفرق في نمط BrdU النطاقات بين في 6 اثنين. B) ويمثل الكروموسوم 6 من حذف Δ6 و6 غير حذف بنسبة 6. و"قطع" ال 6 اثنين الخاص وعرض مع التسميات 3 الفلورسنت فصل في صور مختلفة. C) Tانه تم تحليل الصبغي 6 وباستخدام برنامج Cytovision وملامح كثافة إشارة لكل من دابي (الأزرق) وBrdU (الخضراء) وأظهرت. الخط الأحمر يشير إلى المسار المستخدم، الذراع القصير من (ع) إلى الذراع الطويلة (ف) لتحديد مقدار كل من BrdU ودابي. ويشير إلى المسافة طول كل كروموسوم من الذراع القصير (ع) إلى الذراع الطويلة (س) في بكسل. D) التحديد الكمي للإشارة إجمالي لدابي ومضان BrdU. تمثل مجموع القيم كثافة بكسل متوسط ​​مضروبا في المنطقة التي يمثلها هؤلاء بكسل.

الشكل 4
الشكل 4. الكمي لتكرار الفرق بين التوقيت في 6 كروموسوم. تم علاج الخلايا التي تحتوي على حذف هندسيا من الجين ASAR6 4 مع BrdU لمدة 5 ساعة، تحصد للخلايا الإنقسامية وتجهيزها لإدراجها BrdU والأسماك باستخدام الصبغي 6 CEP بالإضافة إلى التحقيقBAC تحتوي على الجين ASAR6 والتحقيق. تم تجهيز ينتشر الإنقسامية كما في الشكل (3) ويتم عرض القيم لمدة 7 خلايا مختلفة (انظر الجدول 1). A) وكميا وتلطيخ دابي ويتم عرض العدد الإجمالي للبكسل لكل خلية. ملاحظة أنه لا يوجد سوى ~ الفرق بين 10-20٪ الكروموسومات داخل الخلية نفسها. B) وكميا إدماج BrdU من الكروموسومات بنفس B وحة أعلاه. لاحظ أن هناك> 2 أضعاف الفرق بين القيم الإجمالية للبكسل في 6 الكروموسوم حذف وغير حذف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إعداد ينتشر الكروموسومات هي خطوة حاسمة لفحص النسخ المتماثل توقيت الناجحة الموصوفة هنا. قد إدراج خطوة المعالجة colcemid قبل العلاج ناقص التوتر مساعدة في تواتر ونشر الخلايا التفتلي. علينا أن نفضح عادة الخلايا لcolcemdi للموارد البشرية 1-3 قبل الحصاد، واستخدام colcemid عند تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. ومع ذلك، قد إدراج خطوة المعالجة colcemid تغيير طول G2 وبالتالي قد يغير توقيت تكرار واضح وحالة من التكثيف من الكروموسومات 3.

ويمكن تطبيق هذا الإجراء إلى العديد من أنواع مختلفة من الخلايا والأنواع من خلال تغيير طول الحضانة BrdU، الذي يعتمد على دورة الخلية مدة. لمعظم خطوط الخلايا البشرية والفأرة، والمرحلة G2 هو عادة 3-6 ساعة، وبالتالي، وعادة ما تكون العلاجات BrdU في هذا النطاق. بديل لBrdU هو 5-إيثينيل-2'deoxyuridine (EDU) وكشف لاحقا باستخداموأزيد الفلورسنت و "الكيمياء فوق" رد فعل 10. الكشف عن مخطط EDU ديها العديد من المزايا أكثر من نظام الكشف BrdU. على سبيل المثال، كشف EDU لا يتطلب التثبيت أو تمسخ عينة DNA. وبالتالي، يمكن الجمع بين استخدام EDU لتوقيت النسخ المتماثل مع تقويم تقنيات G-النطاقات بسيطة بدلا من FISH لتحديد الكروموسومات في المصالح.

وهو مصمم خصيصا للبروتوكول توقيت تكرار وصف هنا لمرحلة الفحص أواخر S بالإضافة إلى أي توليف الحمض النووي تمتد إلى G2. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن رصد تكرار الحمض النووي في جميع أنحاء المرحلة S باستخدام هذا الإجراء باستخدام قصيرة (15-30 دقيقة) من البقول BrdU تليها فترات طويلة نسبيا مطاردة من 6-10 ساعة. وهذا يسمح لتصور التأسيس BrdU في كل من أوائل ومنتصف S-المرحلة. على سبيل المثال، يتم تأخير بعض الورم إعادة ترتيب الكروموسومات مشتق في بدء كل والانتهاء من تركيب DNA على طول الكروموسومات من 3

ومن مزايا هذا الإجراء النسخ المتماثل هو أن توقيت توقيت تكرار ذلك في المقايسات الخلايا الفردية. ولذلك، فإنه لديه القدرة على كشف الفروق في التوقيت النسخ المتماثل بين الكروموزومات المتماثلة الواردة في نفس الخلية. في حين أن هناك إجراءات أخرى، على سبيل المثال. توقيت النسخ المتماثل في الموقع التهجين (ReTiSH؛ 11)، التي لديها القدرة على الكشف عن الاختلافات في توقيت النسخ المتماثل بين الأليلات في مواضع محددة في الكروموسومات المتماثلة، ويمكن للإجراءات المنصوص هنا كشف الفروق في توقيت النسخ المتماثل على طول الكروموسومات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن هذا الإجراء فحص الاختلافات في توقيت تكرار الكروموسومات الموجودة في جزء فقط من الخلايا للسكان 3. على سبيل المثال العديد من خطوط الخلايا السرطانية وعينات الورم الرئيسي تحتوي على كروموسوم إعادة ترتيب الموجودة في أقل من 50٪ من الخلايا. نحن نستخدم حاليا هذا الإجراء لفحص الكروموسوماتفي عينات الورم الرئيسي، وكانت قادرة على الكشف عن النسخ المتزامنة بين الكروموسومات في عينات متعددة. ومع ذلك، بالنظر إلى أن عينات الورم الرئيسي لديها عدد محدود من الشخصيات الإنقسامية، حوالي ثلث الثقافات الأولية فشلت في تقديم أعداد كافية من انتشار الإنقسامية.

وهناك ميزة أخرى أن هذا الإجراء أكثر من ميكروأري أو التسلسل المقايسات القائمة هي أن يعاير الكروموسومات الفردية بدلا من DNA immunoprecipitated من برك من الخلايا. يجب في المقايسات مناعي القائم على تحديد الأشكال المتعددة وربطها الأليلات محددة من أجل التمييز بين توقيت تكرار الأليلات.

وعلاوة على ذلك، مع الاعتراف بأن العديد من الخلايا السرطانية تحتوي على كروموسوم إعادة ترتيب العديد من 12، وملاحظة أن يرتبط DNA النسخ المتماثل مع التأكيد على عدم الاستقرار الجيني في خلايا السرطان 13، ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول هو أداة مفيدة و وبسيطةأو التحليل الروتيني للتوقيت تكرار الكروموسومات في الخلايا السرطانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للسرطان، CA131967.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 μg/μl
Nick Translation Kit Abbott Molecular (Vysis) 07J00-0001
Spectrum Orange dUTP Abbott Molecular (Vysis) 02N33-050
CEP Abbott Molecular (Vysis) Varies
LSI/WCP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 06J67-011
CEP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 07J36-001
Chromosome paints MetaSystems Group D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluorescent Microscope Olympus BX61TRF-1-5
Microscope imaging software system Applied Imaging Cytovision 3.93.1
Digital Camera Olympus UCMAD3

IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES
Formamide Solutions
70% Formamide/2x SSC

35 ml Formamide* (Sigma)
10 ml 10x SSC
5 ml d2H20
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

* It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low.

50% Formamide/2x SSC

25 ml formamide (Sigma)
10 ml 10x SSC
15 ml dH2O
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

20x SSC, 4 L

702 g NaCl (Sigma)
358 g Na Citrate (Sigma)
dH2O to volume

PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)]

Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots).

0.1 M NaH2P04 , 1 L

13.8 g NaH2P04 (Sigma):
dH2O to volume

0.1 M NaH2P04 1 L

14.2 g NaH2P04 (Sigma)
dH2O to volume.

PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40.

PNM 50 ml

1.25 g Non-fat dry milk (Sigma)
25 ml PN buffer (Recipe above)

Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
  3. Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
  4. Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
  5. Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
  6. Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
  7. Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
  8. Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
  9. Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  11. Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
  12. Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from: http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman (2006).
  13. Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).

Tags

علم الوراثة، العدد 70، الكيمياء الحيوية، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الخلوي، كروموسوم توقيت النسخ المتماثل، فلوري
التوقيت كروموسوم النسخ المتماثل جنبا إلى جنب مع نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, L., Thayer, M. Chromosome… More

Smith, L., Thayer, M. Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (70), e4400, doi:10.3791/4400 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter