Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט Published: December 10, 2012 doi: 10.3791/4400
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University

Summary

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם ניאון

Abstract

שכפול הדנ"א יונקים יוזם באתרים מרובים לאורך הכרומוזומים בזמנים שונים במהלך שלב S, בעקבות תכנית שכפולה של זמן. המפרט של עיתוי שכפול הוא חשב להיות תהליך דינמי מוסדר על ידי רמזי רקמות ספציפיות והתפתחותית המגיבים לשינויי epigenetic. עם זאת, המנגנונים המסדירים היכן ומתי שכפול הדנ"א יוזם יחד הכרומוזומים נשארו הבינו היטב. הומולוגי כרומוזומים בדרך כלל לשכפל סינכרוני, עם זאת יש יוצאים מן הכלל בולט לכלל זה. לדוגמה, בתאי יונקים ממין נקבה אחד משני כרומוזומי X הופך מאוחר משכפל באמצעות תהליך המכונה איון X 1. יחד עם זה עיכוב בעיתוי שכפול, מוערך 2-3 שעות, הרוב המכריע של גנים הופכים השתיק תעתיק על כרומוזום X אחד. בנוסף, מוקד דיסקרטי cis טווח, ידוע כמרכז איון X, מסדיר תהליך איון X זה, לרבות האינדוקצית דואר של עיתוי שכפול מתעכב על כרומוזום X הפעיל כולו. בנוסף, שחלופי כרומוזום מסוימים הנמצאים בתאים סרטניים ותאים שנחשפו לקרינה מייננת להציג עיכוב משמעותי בעיתוי שכפול של> 3 שעות שמשפיעה על כל כרומוזום 2,3. העבודה אחרונה מהמעבדה שלנו מצביעה על שיבוש זה של דיסקרטי cis-מתנהג תוצאת לוקוסים אוטוזומלית בפנוטיפ משכפל מאוחר מאוד המשפיע על 4 כרומוזום השלמים. מחקרים 'הנדסי כרומוזום' נוספת מצביעים על כך ששחלופי כרומוזום מסוימים המשפיעים על תוצאת כרומוזומים שונות רבה בפנוטיפ הנורמלי זה שכפול עיתוי, מצביעים על כך שכל הכרומוזומים היונקים מכילים לוקוסים בדידים cis-הפועלים ששולטים עיתוי שכפול תקין של כרומוזומים בודדים 5.

כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח כמותי של עיתוי שכפול כרומוזום בשילוב עם ניאון כלאה באתר. זהשיטה מאפשרת השוואה ישירה של עיתוי שכפול בין כרומוזומים הומולוגיים באותו התא, והותאמה מ 6. בנוסף, שיטה זו מאפשרת זיהוי חד המשמעי של שחלופי כרומוזומליות הקשורים לשינויים בעיתוי שכפול המשפיעים על כל כרומוזום. לשיטה זו יש יתרונות על פני מערך מייקרו תפוקה גבוה פתח לאחרונה או רצף פרוטוקולים שלא מבחינים בין האללים הומולוגיים להציג מחדש ובבטלו מחדש-כרומוזומים. בנוסף, בגלל השיטה המתוארת כאן מעריכה תאים בודדים, זה יכול לזהות שינויים בעיתוי שכפול כרומוזום בשחלופים בכרומוזומים שנמצאים רק בחלק מהתאים באוכלוסייה.

Protocol

1. התאגדות BrdU (סימון מסוף)

  1. תאי פלייט לכ 70% במפגש 24 שעתי 150 מ"מ רקמת תרבות צלחת לפני התוספת של BrdU.
  2. החלף תקשורת עם תקשורת מלאה טריה המכילה 20 מיקרוגרם / המ"ל BrdU (סיגמא) בנקודתי זמן מתאימות לפני הקציר. אורכם של תאים בתרבית בזמן שתקשורת עם BrdU ישתנה עם סוג תא ומין, בדרך כלל שלב G2 נמשך בין 2 ל 5 שעות (איור 1).

2. קציר כרומוזום תרבויות תאי Monolayer

  1. הסר תקשורת תרבות מהצלחת ולאסוף 10 מ"ל בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. השלך תקשורת נותרת.
  2. יש לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל Versine [או HBSS (סיגמא)].
  3. הוסף מ"ל טריפסין 0.25% 5 בVersine (או HBSS) לצלחת. דגירה בטמפרטורת חדר עד שתאים מנותקים מהצלחת.
  4. הוסף השעית התא trypsinized לצינור המכיל 10 מ"ל של תקשורת מצעד 2.1. </ Li>
  5. צנטריפוגה XG ב 400 למשך 10 דקות לגלולת התאים. לשאוב supernatant, והשאיר 0.5 מ"ל של תקשורת בתוספת התא גלול.
  6. Resuspend תאים ביסודיות על ידי pipetting עם פסטר פיפטה.
  7. הוסף 3 טיפין של תמיסת hypotonic (0.075 M KCl (סיגמא) חמם עד 37 מעלות צלזיוס): מערבב את השעית התא עם פסטר פיפטה. הוסף פתרון hypotonic מ"ל 0.5 ולערבב שוב עם פסטר פיפטה. להביא נפח של פתרון hypotonic עד 5 מ"ל ומערבב שוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-45 דקות, תלוי בסוג התא.
  8. צנטריפוגה XG ב 400 למשך 10 דקות. לשאוב supernatant, והשאיר 0.5 מ"ל של תקשורת בתוספת התא גלול.
  9. Resuspend תא הגלול ידי מצליף את הצינור בעדינות. התאים אוסמוטי הנפוחים יהיו שבירים בנקודה זו, ולכן יש להיזהר שלא לפגוע בקרומי cytoplasmic.
  10. הוסף 3 טיפין (החומצה אצטית קרחונית 01:03: מתנול) של Carnoy מקבעת; לערבב ידי pipetting בעדינות עם פסטר pipettדואר. הוסף מקבע ותמהיל מ"ל 0.5 על ידי pipetting בעדינות עם פסטר פיפטה. הבא נפח מקבע ל5 מ"ל ולערבב שוב על ידי pipetting בעדינות עם פסטר פיפטה. תאים קבועים ניתן לאחסן בחושך ב -20 ° C למשך מספר חודשים.
  11. צנטריפוגה ולשאוב כמו בשלב 2.8.
  12. Resuspend התא גלול ב מקבע טרי; לאמוד את ההיקף של הגלולה ותוספת ~ 10x הנפח מקבע של Carnoy.
  13. הוסף השעית התא נפתח החכמה על שקופיות מיקרוסקופ רטובות, קרות כקרח, להחזיק את השקופית ב~ זווית 45 מעלות ומאפשר השעית התא לזרום על פני השטח של השקופית. הנח את השקף והמבול השטוח על מגבות נייר השקופית עם מקבע ומאפשר לייבוש באוויר. בדקו שקופיות לנוכחות של ממרחי mitotic באמצעות מיקרוסקופ הפוך.

3. טיפול RNase והתייבשות אתנול

  1. 200 μl המקום של 10 מיקרוגרם / מיליליטר RNase (סיגמא) ב2x SSC לכל שקופית; לדגור על 37 ודהז; צלזיוס במשך שעה 1.
  2. שטפים מחליקים 3 פעמים עם 2x SSC, 7.0 pH בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות כל אחד.
  3. מייבש שקופיות באמצעות סדרת EtOH (סיגמא) (70%, 90% ו 100%) בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות כל אחד.
  4. אוויר יבש את השקופיות בטמפרטורת חדר.

4. הכנת קוקטיילים לבדיקת BAC פלוס הפקידה Probe centromere כרומוזום ספציפי (CEP) או לצבעי כרומוזום שלמים כלאה באתר

  1. להכלאת סימולטני BAC / CEP, להכין שני קוקטיילי בדיקה נפרדים עבור מראש הכלאה. אנחנו גילינו שטרום הכלאה-בדיקות BAC וCEP בנפרד במסגרת תוצאות חומרות שונות ברקע פחות ועוצמת אות גדולה יותר. גם אנחנו גילינו שFosmids הבודד יכולה לשמש גם במקום של שיבוטי BAC. ניסוח הקוקטייל יתואר להלן מייצג את הכרכים עבור שקופית אחת. אם עיבוד שקופיות מרובות המשתמשות באותן בדיקות פשוט להגדיל appropr הכרכים iately.

    * קוקטייל בדיקת DNA BAC:

    חיץ ההכלאה μl 11.5 (פוראמיד 50% (סיגמא) / סולפט 2x SSC / dextran (סיגמא)) 2 μl DH 2 O

    2.5 BAC/Cot1 DNA μl בDH 2 O (ראה בהמשך לתיוג פרוטוקול) 15 נפח כולל μl

    * קוקטייל CEP בדיקה:

    חיץ 7 μl CEP הכלאה (65% סולפט Formamide/2x SSC / dextran) 2 μl DH 2 O

    דנ"א 1 μl CEP/Cot1 (נרכש prelabeled עם ספקטרום Orange/Cy3/Texas אדום) 10 נפח כולל μl

    * לאחר denaturing והכלאה מראש (צעד 5.1) תמהיל BAC חללית עם CEP חללית במהירות של 25 קוקטיילי יחס 03:02 μl / שקופיות ותמהיל בדיקה.

    או

  2. Aliquot 20 μl / שקופית של חללית צביעת כרומוזום שלמה (Cy3/Texas האדום) לתוך צינור. המשך אל denaturation וצעד מראש הכלאה.
"> 5. שקופיות וdenaturation Probe וכלאה באתר

  1. לפגל חללית קוקטייל (הים) ב 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. טרום להכליא על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר Cot1 DNA כדי להכליא לרצפים חוזרים ולמנוע הכלאה לאחר metaphase כרומוזומים.
  2. שקופיות לפגל בצנצנות Coplin ב70% Formamide/2x SSC, 7.0 pH ב 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
  3. מייד מייבש שקופיות באמצעות EtOH סדרה (70%, 90% ו 100%) בצנצנות Coplin ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כל אחד.
  4. לאפשר את השקופיות לייבוש באוויר בטמפרטורת חדר.
  5. שקופיות טרום חמות עד 45 מעלות צלזיוס בשקופית חמה עבור 10 הדקות האחרונות של טרום hybridzation (שלב 5.1) הבדיקה. לערבב קוקטיילי בדיקה מראש הכלאה במידת הצורך ולהוסיף 25 ul לכל שקופית, מניח בעדינות coverslip בכל שקופית וחותם לאורך כל הקצוות עם מלט גומי. דגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified כדי למנוע אידוי.

ילדה = "jove_title"> 6. הכלאת הודעת שוטף

  1. שטוף את השקופיות בצנצנות Coplin 3 פעמים ב50% formamide/2x SSC, 7.0 pH ב 38-40 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כל אחד. הטמפרטורה של הכביסות שעשויה להשתנות בין בדיקות. אם יש הכלאת רקע גבוהה אתה יכול להעלות את הטמפרטורה של הכביסות. לעומת זאת, אם האות היא קלושה ואין רקע אז אתה יכול להקטין את הטמפרטורה של שטיפות אלה.
  2. שטפים מחליקים פעם 1 בחיץ PN בטמפרטורת חדר עבור 3 דקות, ולהמשיך לשלב איתור BrdU.

7. BrdU איתור

  1. שקופיות בלוק עם חיץ PNM למשך 10 דקות (200 μl / שקופיות) בטמפרטורת חדר בחושך.
  2. מסנן שקופיות על ידי הפעלת יתרון על מגבת נייר. הוסף 100 μl של אנטי-BrdU FITC (50 מיקרוגרם / מיליליטר רוש או Millipore) בחיץ PNM למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. שטוף את השקופיות 3 פעמים בחיץ PN בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות כל אחד.
  4. נקזחיץ PN עודף על שקופיות אחד בכל פעם על ידי הפעלת יתרון על מגבת נייר. הוסף 20 DAPI μl / הרכבת פתרון antifade (Invitrogen). כסה את השקופית עם מגבת נייר ולחץ כלפי מטה על coverslip כדי לאלץ את בועות אוויר ופתרון הרכבה עודף. המשך לניתוח תמונה.

8. לכידת תמונות וכימותי התאגדות BrdU

  1. תמונות שנתפסו עם מיקרוסקופ אולימפוס BX61 פלורסנט ואולימפוס מצלמת CCD, גלגל לסנן-100x אובייקטיבי, אוטומטי ותוכנת Cytovision (יישומי הדמיה). BrdU הוא נתפס באמצעות מסנן FITC; צבעי כרומוזום (טקסס אדומה, Metasystems או Cytocell), בדיקות CEP (Vysis הספקטרום אורנג') BAC של (Cy3) ונתפסו באמצעות טקסס אדומה או Cy3 מסנן; DAPI הוא נתפס עם DAPI מסנן (ראה איורים 2 ו 3).
  2. כרומוזומים בודדים של עניין מזוהים עם BAC / CEP או בדיקות ספציפיות לכרומוזום צבע (איורים ו2B 3B). ניצולתוכנת Cytovision, כל כרומוזום של ריבית היא "לחתוך החוצה" מהתפשטות metaphase כמכלול, קו נמשכת דרך לאורכו של כרומוזום מזרוע קצרה לזרועו ארוכה (תרשימים ו2C 3C). תוכנת Cytovision משמשת לכימות פרופיל עוצמת פיקסל לאורכו של כל כרומוזום. תוכנת Cytovision מחשבת את השטח שעליו את הפיקסלים ומכמתת את עוצמת פיקסלים המיוצגים על ידי אותות BrdU או DAPI על כרומוזום אחד מבודד. עוצמת פיקסל הממוצעת המיוצגת על ידי כל כרומוזום אז מוכפל בשטח שנכבש על ידי אלה פיקסלים להשיג את המספר הכולל של פיקסלים (טבלה 1 ואיור 4). בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר להדמיה של האזורים משכפלים האחרונים של כרומוזומים. בהתאם לכך, הדפוס התאגד התאגדות BrdU מאפשר זיהוי של אזורים פעילים משכפלים של כרומוזומים, והבדלים בעיתוי שכפול בין chromosזוגות Ome נתפסים כהבדלים בדפוס פסים זה (איורים 2 ו 3). לבסוף, הבדלים אלו בדפוסים מחייבים ניתן להשוות את מפות עיתוי שכפול ידוע לכל כרומוזום 6,7, המאפשר לאומדן פרש העיתוי שהכפול בין כרומוזומים הומולוגיים או זרועות כרומוזום 4. לדוגמה, 2 של כרומוזום 6 באיור 3 א מציגים את הבדל בדפוס פסים> 2 שעות בהשוואה לעיתוי השכפול הנורמלי של כרומוזום 6 4.
    בנוסף, הליך דומה לזה שתואר כאן כבר השתמש בהצלחה ללימודי עיתוי השכפול אסינכרוני בין כרומוזומי X הפעיל ואקטיבי 8,9. את כרומוזומי X הפעיל ולא הפעיל זוהה באמצעות צבעי כרומוזום X. תמונות נרכשו באמצעות שנינויות mFISH תוכנה (Vysis) ומספר הפיקסלים שנכבשו על ידי כרומוזומי X ואת מספר הפיקסלים שנכבשו על ידי fluorescently labeled BrdU היה אז מחושב באמצעות NIH תמונה (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html).

9. ניק תרגום של BAC DNA לניאון תיוג (Vysis)

  1. הוסף את תערובת החללית הבאה לצננתי צינור microfuge:
    70 μl (4-DNA מיקרוגרם) בDH 2 O
    10 μl .2 mM dUTP-כתום או ירוק
    20 μl .1 mM dTTP
    הצפת 20 μl 10x ניק תרגום
    40 NT dNTP של μl (מינוס dTTP)
    אנזים תרגום הכינוי μl 40
    200 נפח כולל μl
    דגירה @ 16 ° CO / נ עצור תגובה על ידי חימום על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צ'יל על קרח למשך 5 דקות.
  2. תזרז את ה-DNA עם אתנול על ידי הוספה הבאה לתמהיל הבדיקה:
    פתרון חללי 200 μl
    48 μl M 3 NaOAc
    160 Cot1DNA μl (0.25 מיקרוגרם / ul)
    1200 100% EtOH μl
  3. חנות ב -80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לO / נ
  4. הספיןn קר ב12000 XG במשך 20 דקות. למזוג את EtOH. שטוף זמן 1 עם EtOH 70%. ספין כמו קודם. למזוג את EtOH. אוויר יבש רק עד מתאדה EtOH. Resuspend ב 40 μl DH 2 O לריכוז סופי של 100 ng / μl של BAC-DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמה לניתוח תזמון השכפול לכרומוזום אנושי 6 מוצגת באיור 2. תאים המכילים מחיקה של ASAR6 הגן 4, הממוקם ב6q16.1, נחשפו לBrdU במשך 5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד לדגים עם בדיקת כרומוזום 6 צבע (Vysis) וכן שילוב BrdU. שים לב שיש הבדל משמעותי בדפוס פסי BrdU בין 6 של שניים, שעולה בקנה אחד עם עיכוב בעיתוי שכפול של> 2 שעות לאחד מכרומוזום 6 של [ראו סעיף 4 לעיתוי שכפול banding דפוס של כרומוזום 6 לפני המחיקה]. בנוסף, יש הבדל משמעותי בסכום הכולל של התאגדות BrdU (פיקסלים) בהשוואה לניתוח דומה של כתמי DAPI (האיור 2D).

דוגמה נוספת לניתוח תזמון השכפול לכרומוזום אנושי 6 מוצגת באיור 3. תאים המכילים את הסםמחיקת דואר של ASAR6 הגן 4 יוצגו אם האיור 2 נחשפו לBrdU במשך 5 שעות, שנקטף לתאי mitotic ומעובד לדגים עם כרומוזום 6 CEP בדיקת תוספת BAC מכיל ASAR6 הגן וכן שילוב BrdU. שים לב שנמחק כרומוזום 6 (Δ6) מציג שילוב יותר BrdU ודפוס banding מורחב יותר התאגדות BrdU מאשר כרומוזום שאינם נמחק-6. ממרחי mitotic מ7 תאים שונים עובדו כבאיור 3 ואת פרופילי פיקסל עבור שניהם DAPI וBrdU מוצגים בטבלת 1.

איור 1
איור 1. ערכת תווית מסוף BrdU. שלב S אופייני בתאים אחרונים עבור 8 עד 10 שעות, וG2 יונקים הוא בדרך כלל 2-5 שעות. BrdU מתווסף להגדלת פרקי הזמן (חצים ירוקים) כדי לתייג את המנות האחרונות של הכרומוזומים לשכפל. ההכרומוזומים בתאי יונקי דואר לשכפל פי תכנית זמנית, במוקדם ומאוחר שכפול מתרחש בתחילה והסיום של שלב S בהתאמה (קו שחור). כרומוזומי X הפעיל מעוכב בעיתוי שכפול ברוב של סינתזת דנ"א המתרחשת במהלך המחצית השנייה של שלב S (קו כחול). הכרומוזומים עם עיתוי שכפול עיכוב מעוכבים בייזום והן השלמת סינתזת דנ"א, עם השכפול פעיל ממשיך דרך G2 (קו אדום). תרבויות אסינכרוני נקצרות לתאי mitotic והמעובד עבור התאגדות ודגי BrdU.

איור 2
איור 2. שכפול אסינכרוני של כרומוזום האנושי 6. תאים המכילים מחיקה מהונדסת של גן ASAR6 4 טופלו בBrdU ל5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד עבור התאגדות ודגי BrdU באמצעות כרום 6 הצבע osome כחללית. ה-DNA הייתה מוכתמת בDAPI (כחול). א) התפשטות המיטוטי המכילה דפוס אופייני "פסים" התאגדות BrdU (ירוק) מוצגת. בדיקת צבע כרומוזום 6 הכלאה 2 של כרומוזום 6 (אדום) בתא זה. B) 2 של כרומוזום 6 (ראשון ושני) היה "לגזור" ומוצג בשלוש תוויות הניאון מופרדים לתמונות שונות. ג) 6 של כרומוזום נותח באמצעות תוכנת Cytovision ואת פרופילי עוצמת האות עבור שניהם DAPI (כחול) וBrdU (ירוק) מוצג. הקו האדום מציין את הנתיב המשמש, מזרוע קצרה (p) לזרוע ארוכה (q) לכימות של שניהם BrdU וDAPI. המרחק מתייחס לאורכו של כל כרומוזום מזרוע קצרה (p) לזרוע ארוכה (q) בפיקסלים. ד) כימות האות הכוללת עבור שניהם DAPI וBrdU פלואורסצנטי. הערכים כלל מייצגים את עוצמת הפיקסל הממוצעת מוכפלת באזור המיוצג על ידי אלה פיקסלים.

igure 3 "src =" / files/ftp_upload/4400/4400fig3.jpg "/>
איור 3. Delayed שכפול של כרומוזום אנושי המכיל 6 מחיקה של ASAR6. תאים המכילים מחיקה מהונדסת של גן ASAR6 4 טופלו בBrdU ל5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד עבור התאגדות ודגי BrdU באמצעות כרומוזום 6 CEP תוספת BAC מכיל ASAR6 הגן כמו בדיקות. ה-DNA הייתה מוכתמת בDAPI (כחול). א) התפשטות המיטוטי המכילה דפוס אופייני "פסים" התאגדות BrdU (ירוק) מוצגת. כרומוזום 6 CEP חללית הכלאה 2 של כרומוזום 6 (אות centromeric אדום גדולה), וBAC הכלאת כרומוזום יחיד 6 (איתות אדומה קטנה על הזרוע הארוכה) בתא זה. שים הלב להיבדל בדפוס פסי BrdU בין 6 של שניים. B) כרומוזום 6 נמחק מיוצג על ידי Δ6 ולא נמחקו-6 על ידי 6. 6 2 שלהם "לגזור" ומוצגים בשלוש תוויות הניאון מופרדים לתמונות שונות. ג) טהוא 6 של כרומוזום נותח באמצעות תוכנת Cytovision ואת פרופילי עוצמת האות עבור שניהם DAPI (כחול) וBrdU (ירוק) מוצג. הקו האדום מציין את הנתיב המשמש, מזרוע קצרה (p) לזרוע ארוכה (q) לכימות של שניהם BrdU וDAPI. המרחק מתייחס לאורכו של כל כרומוזום מזרוע קצרה (p) לזרוע ארוכה (q) בפיקסלים. ד) כימות האות הכוללת עבור שניהם DAPI וBrdU פלואורסצנטי. הערכים כלל מייצגים את עוצמת הפיקסל הממוצעת מוכפלת באזור המיוצג על ידי אלה פיקסלים.

איור 4
איור 4. כימות הבדלי העיתוי בין השכפול של כרומוזום 6. תאים המכילים מחיקה מהונדסת של גן ASAR6 4 טופלו בBrdU ל5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד עבור התאגדות ודגי BrdU באמצעות כרומוזום 6 CEP חללית בתוספתBAC מכיל ASAR6 הגן כחללית. ממרחי mitotic עובדו כבאיור 3 ואת הערכים של 7 תאים שונים מוצגים (ראה טבלה 1). ) המכתים DAPI כומתה ואת המספר הכולל של פיקסלים מוצג לכל תא. שים לב שיש רק 10-20% ~ הבדל בין כרומוזומים בתוך אותו התא. B) התאגדות BrdU כומתה מאותם הכרומוזומים כB לוח שמעל. שים לב שיש> הבדל פי 2 בין ערכי הפיקסלים הכוללים עבור כרומוזום נמחק ולא נמחק-6 של.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנת ממרחי כרומוזום היא שלב קריטי להצלחת בדיקת שכפול עיתוי שתואר כאן. הכללתו של צעד מקדים colcemid לפני טיפול hypotonic עשויה לסייע בתדירות ובהפצה של תאי mitotic. אנחנו בדרך כלל לחשוף תאים לcolcemdi עבור 1-3 שעות לפני הקציר, ולהשתמש colcemid בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. עם זאת, הכללתו של צעד מקדים colcemid רשאי לשנות את אורכו של G2 וכתוצאה מכך עשוי לשנות את התזמון לכאורה שכפול והמצב של עיבוי הכרומוזומים 3.

הליך זה יכול להיות מיושם על סוגים רבים ושונים של תאים ומינים על ידי שינוי האורך של דגירת BrdU, אשר תלוי משך מחזור התא. לשורות תאי אדם ועכבר ביותר, שלב G2 הוא בדרך כלל 3-6 שעות, ולכן טיפולי BrdU הם בדרך כלל בטווח זה. חלופה לBrdU היא 5-ethynyl-2'deoxyuridine (edu) וגילויה לאחר מכן באמצעותיזיד ניאון ", ותגובת לחץ כימיה" 10. ערכת זיהוי החינוכית יש מספר יתרונות על פני ערכת זיהוי BrdU. לדוגמה, זיהוי של edu אינו דורש קיבוע מדגם או denaturation-DNA. לפיכך, השימוש בedu לעיתוי שכפול תחת יכול להיות בשילוב עם טכניקות פשוטות G-התקבצו במקומם של דגים כדי לזהות את הכרומוזומים של עניין.

פרוטוקול עיתוי השכפול המתואר כאן תוכנן במיוחד לשלב assay S מאוחר בתוספת כל סינתזת דנ"א פולשת לתוך G2. בנוסף, שכפול הדנ"א ניתן לפקח בכל שלב S באמצעות הליך זה על ידי שימוש (15-30 דקות) פולסים קצרים של BrdU אחריו מרדף תקופות ארוכות יחסי של 6-10 שעות. זה מאפשר להדמיה של התאגדות BrdU בשניהם מוקדם ו-S-שלב ביניים. לדוגמה, שחלופי כרומוזום מסוימים גידול נגזרו מעוכבים הוא בייזום והביצוע של סינתזת דנ"א לאורך כל אורכו של הכרומוזומים 3

אחד יתרונות של הליך עיתוי השכפול הזה הוא שעיתוי שכפול זה מבחנים בתאים בודדים. לכן, יש לו את היכולת לזהות הבדלים בעיתוי שכפול בין כרומוזומים הומולוגיים כלולים בתוך אותו התא. אמנם יש הליכים אחרים, למשל. עיתוי שכפול כלאה באתר (ReTiSH; 11), שיש לו את היכולת לזהות הבדלים בעיתוי שכפול בין אללים בלוקוסים ספציפיים על כרומוזומים הומולוגיים, התהליך המתואר כאן יכול לזהות הבדלים בעיתוי השכפול לאורך כל אורכו של כרומוזומים. בנוסף, הליך זה יכול assay הבדלים בעיתוי השכפול של כרומוזומים שנמצאים רק בחלק מתאים של אוכלוסייה 3. לדוגמה רבות שורות תאי סרטן ודגימות גידול ראשוניות מכילים שחלופי כרומוזום שנמצאים בפחות מ 50% מתאים. אנחנו משתמשים כרגע בהליך זה כדי כרומוזומים assayבדגימות גידול ראשוניות, והיה מסוגל לזהות שכפול אסינכרוני בין הכרומוזומים בדוגמאות רבות. עם זאת, בהתחשב בכך שדגימות גידול ראשוניות יש מספר מצומצם של דמויות mitotic, כשליש מהתרבויות העיקריות לא הצליח לתת מספרים מספיקים של ממרחי mitotic.

יתרון נוסף שהליך זה יש מעל microarray או רצף מבחנים מבוססים הוא שכרומוזומים בודדים assayed לא דנ"א immunoprecipitated מברכות של תאים. במבחני immunoprecipitation מבוססי פולימורפיזמים חייבים להיות מזוהים וקשור לאללים ספציפיים כדי להבדיל בין עיתוי שכפול אללים.

יתר על כן, עם ההכרה כי רבים תאים סרטניים מכילים שחלופים רבים כרומוזום 12, והתצפית שמתח שכפול הדנ"א קשור לחוסר יציבות גנומית בתאים סרטניים 13, אנו מאמינים כי פרוטוקול זה הוא f כלי שימושית ופשוטהאו הניתוח השגרתי של עיתוי השכפול של הכרומוזומים בתאים סרטניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לסרטן, CA131967.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 μg/μl
Nick Translation Kit Abbott Molecular (Vysis) 07J00-0001
Spectrum Orange dUTP Abbott Molecular (Vysis) 02N33-050
CEP Abbott Molecular (Vysis) Varies
LSI/WCP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 06J67-011
CEP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 07J36-001
Chromosome paints MetaSystems Group D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluorescent Microscope Olympus BX61TRF-1-5
Microscope imaging software system Applied Imaging Cytovision 3.93.1
Digital Camera Olympus UCMAD3

IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES
Formamide Solutions
70% Formamide/2x SSC

35 ml Formamide* (Sigma)
10 ml 10x SSC
5 ml d2H20
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

* It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low.

50% Formamide/2x SSC

25 ml formamide (Sigma)
10 ml 10x SSC
15 ml dH2O
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

20x SSC, 4 L

702 g NaCl (Sigma)
358 g Na Citrate (Sigma)
dH2O to volume

PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)]

Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots).

0.1 M NaH2P04 , 1 L

13.8 g NaH2P04 (Sigma):
dH2O to volume

0.1 M NaH2P04 1 L

14.2 g NaH2P04 (Sigma)
dH2O to volume.

PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40.

PNM 50 ml

1.25 g Non-fat dry milk (Sigma)
25 ml PN buffer (Recipe above)

Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
  3. Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
  4. Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
  5. Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
  6. Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
  7. Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
  8. Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
  9. Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  11. Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
  12. Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from: http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman (2006).
  13. Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).

Tags

גנטיקה גיליון 70 ביוכימיה ביולוגיה מולקולרית ביולוגיה תאית עיתוי שכפול כרומוזום פלורסנט דגים BrdU ציטוגנטיקה שחלופי כרומוזום מיקרוסקופ פלואורסצנטי
עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, L., Thayer, M. Chromosome… More

Smith, L., Thayer, M. Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (70), e4400, doi:10.3791/4400 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter