Summary
En kvantitativ metod för analys av kromosom-replikering timing beskrivs. Metoden utnyttjar BrdU-inkorporering i kombination med fluorescerande
Abstract
Däggdjurs-DNA-replikation initieras vid flera ställen längs kromosomer vid olika tidpunkter under S-fasen, efter en tidsmässig replikering program. Specifikationen av replikering timing tros vara en dynamisk process regleras av vävnads-specifika och utvecklande ledtrådar som är lyhörda för epigenetiska modifieringar. Dock fortfarande de mekanismer som reglerar var och när DNA-replikation initierar längs kromosomer dåligt kända. Homologa kromosomer replikeras oftast synkront, men det finns viktiga undantag från denna regel. Till exempel i kvinnliga däggdjursceller en av de två X-kromosomer blir sen replikera genom en process som kallas X inaktivering 1. Tillsammans med denna fördröjning i replikering timing, uppskattas till 2-3 timmar, blir majoriteten av gener transkriptionellt tystas på en X-kromosom. Dessutom reglerar en diskret cis-verkande lokuset, känd som X inaktivering centrum, denna inaktivering X, inbegripet the induktion av fördröjd replikering timing på hela inaktiva X-kromosomen. Dessutom har vissa kromosom omdisponeringar som finns i cancerceller och celler som exponeras för joniserande strålning visa en signifikant fördröjning i replikering tidpunkten för> 3 timmar som påverkar hela kromosom 2,3. Senaste arbete från vår labb visar att avbrott i diskreta cis-agerande autosomalt loci resulterar i en extremt sent replikera fenotyp som påverkar hela kromosom 4. Ytterligare "kromosom tekniska" studier visar att vissa kromosom omflyttningar påverkar många olika kromosomer resulterar i denna onormala replikering-timing fenotyp, vilket tyder på att alla däggdjur kromosomer innehåller diskreta cis-verkande loci som styr korrekt replikering tidpunkten för enskilda kromosomer 5.
Här presenterar vi en metod för kvantitativ analys av kromosom-replikering timing kombinerat med fluorescent in situ hybridisering. Dettametod möjliggör en direkt jämförelse av replikering timing mellan homologa kromosomer inom samma cell, och anpassades från 6. Dessutom tillåter denna metod för otvetydig identifiering av kromosomala rearrangemang som korrelerar med förändringar i replikering timing som påverkar hela kromosomen. Denna metod har fördelar jämfört med nyutvecklade hög genomströmning mikro-array eller sekvensering protokoll som inte kan skilja mellan homologa alleler som finns på omarrangerade och un-ordnas kromosomer. Dessutom, eftersom den här beskrivna metoden utvärderar enskilda celler, kan man upptäcka förändringar i kromosom-replikering timing på kromosomala rearrangemang som är närvarande i endast en bråkdel av cellerna i en population.
Protocol
1. BrdU Införlivande (Terminal Märkning)
- Plate celler till cirka 70% konfluens i en 150 mm vävnadsodlingsskål 24 h före tillsatsen av BrdU.
- Ersätt media med färskt komplett medium innehållande 20 pg / ml BrdU (Sigma) vid lämpliga tidpunkter före skörd. Den tid celler odlas i medium med BrdU varierar med celltyp och art, typiskt G2-fasen varar mellan 2 och 5 timmar (figur 1).
2. Kromosom Skörd av monolager Cells kulturer
- Avlägsna odlingsmedier från plattan och samla 10 ml i ett 15 ml koniskt centrifugrör. Kasta kvarvarande material.
- Skölj cellerna en gång med 10 ml Versine [eller HBSS (Sigma)].
- 5 ml 0,25% trypsin i Versine (eller HBSS) till plattan. Inkubera vid rumstemperatur tills cellerna lösgörs från plattan.
- Lägg trypsinerade cellsuspension till röret innehållande 10 ml medium från steg 2,1. </ Li>
- Centrifugera vid 400 xg under 10 min för att pelletera cellerna. Sug supernatanten, vilket 0,5 ml medium plus cellpelleten.
- Resuspendera celler noggrant genom pipettering med en Pasteur-pipett.
- Tillsätt 3 droppar av hypoton lösning (0,075 M KCl (Sigma) värmd till 37 ° C), blanda cellsuspensionen med en Pasteur-pipett. Tillsätt 0,5 ml hypoton lösning och blanda igen med en Pasteur-pipett. Bringa volymen av hypoton lösning till 5 ml och blanda igen. Inkubera vid 37 ° C under 20-45 minuter, beroende på celltyp.
- Centrifugera vid 400 xg under 10 minuter. Sug supernatanten, vilket 0,5 ml medium plus cellpelleten.
- Resuspendera cellpelleten genom att försiktigt vicka röret. De osmotiskt svullna celler kommer att vara bräcklig på denna punkt, så försiktighet bör iakttas för att inte störa cytoplasmiska membranen.
- Tillsätt 3 droppar Carnoys fixativ (1:3 koncentrerad ättiksyra: metanol), blanda genom att försiktigt pipettera med en Pasteur pipette. Tillsätt 0,5 ml fixativ och blanda genom att försiktigt pipettera med en Pasteur-pipett. Bringa volymen av fixativ till 5 ml och blanda igen genom att försiktigt pipettera med en Pasteur-pipett. Fixerade celler kan lagras i mörker vid -20 ° C under flera månader.
- Centrifugera och aspirera såsom i steg 2,8.
- Resuspendera cellpelleten i färskt fixativ, uppskatta volymen på pelleten och tillsätt ~ 10x volymen Carnoys fixativ.
- Lägg cellsuspensionen droppvis på våta, iskalla objektglas, håll bilden på en ~ 45 ° vinkel och låt cellsuspensionen att flöda över ytan av bilden. Lägg bilden platt på pappershanddukar och översvämning bilden med fixermedel och låt lufttorka. Kontrollera objektglasen för förekomst av mitotiska bredbara användning av ett inverterat mikroskop.
3. RNas Behandling och etanol Dehydrering
- Placera 200 pl av 10 pg / ml RNas A (Sigma) i 2x SSC till varje objektglas, inkubera vid 37 & deg, C under 1 timme.
- Tvätta objektglasen 3 ggr med 2 x SSC, pH 7,0 vid rumstemperatur under 3 min vardera.
- Dehydratisera objektglasen genom en EtOH (Sigma) serier (70%, 90% och 100%) vid rumstemperatur under 3 min vardera.
- Lufttorka glasen vid rumstemperatur.
4. Beredning av Probe Cocktails för BAC Plus kromosom-specifika Centromer uppräkning Probe (CEP) eller för hel kromosom Färger in situ hybridisering
- För BAC / CEP samtidig hybridisering, förbereda två separata probe drinkar för pre-hybridisering. Vi har funnit att pre-hybridisering av BAC och CEP sonder separat under olika stringenser resulterar i mindre bakgrund och större intensitet signal. Vi har också funnit att enskilda Fosmids även kan användas i stället för BAC-kloner. Cocktail formulering som beskrivs nedan representerar volymerna för en enda bild. Om bearbetningen flera bilder med samma sonderna helt enkelt öka volymerna appropr iately.
* BAC DNA-prob cocktail:
11,5 pl hybridiseringsbuffert (50% formamid (Sigma) / 2 x SSC / dextransulfat (Sigma)) 2 pl dH 2 O
2,5 pl BAC/Cot1 DNA i dH 2 O (se nedan för märkning protokoll) 15 pl total volym
* CEP sond cocktail:
7 ul CEP hybridiseringsbuffert (65% Formamide/2x SSC / dextransulfat) 2 pl dH 2 O
1 pl CEP/Cot1 DNA (köpt prelabeled med Spectrum Orange/Cy3/Texas Röd) 10 pl total volym
* Efter denaturering och pre-hybridisering (steg 5,1) blanda BAC sond med CEP sond vid en 3:2 ratio 25 il / bild och blanda sond cocktails.
ELLER
- Alikvotera 20 pl / bilden i hel kromosom Paint sond (Cy3/Texas röd) till ett rör. Fortsätt till denaturering och pre-hybridiseringssteget.
- Denaturera sonden cocktail (er) vid 75 ° C under 10 minuter. Pre-hybridiserar vid 37 ° C under 30 minuter för att tillåta COT1-DNA att hybridisera till upprepade sekvenser och för att förhindra efterföljande hybridisering till metafaskromosomer.
- Denaturera objektglasen i Coplin-kärl i 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 vid 72 ° C under 3 minuter.
- Omedelbart torka objektglasen genom en serie EtOH (70%, 90% och 100%) i Coplin-kärl vid 4 ° C under 3 min vardera.
- Låt bilderna lufttorka i rumstemperatur.
- Pre-varma bilder till 45 ° C på bild varmare under de senaste 10 minuter av sonden före hybridisering (steg 5,1). Blanda i förväg hybridiserad sond drinkar om det behövs och tillsätt 25 ul till varje bild, försiktigt placera ett täckglas på varje bild och tätning längs alla kanter med gummi cement. Inkubera över natten vid 37 ° C i en fuktad kammare för att förhindra avdunstning.
- Tvätta objektglasen i Coplin burkar 3 gånger i 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 vid 38-40 ° C i 3 min vardera. Temperaturen hos tvättningarna kan variera mellan prober. Om det är hög bakgrund hybridisering kan öka temperaturen av tvättarna. Omvänt, om signalen är svag och det finns ingen bakgrund då man kan minska temperaturen hos dessa tvättar.
- Tvätta objektglasen 1 gång i PN-buffert vid rumstemperatur i 3 min, och gå vidare till BrdU detektionssteget.
7. BrdU Detection
- Block objektglasen med PNM buffert under 10 min (200 ul / objektglas) vid rumstemperatur i mörker.
- Tappa bilder genom att slå på kanten på en pappershandduk. Tillsätt 100 | il av anti-BrdU-FITC (50 pg / ml Roche eller Millipore) i PNM-buffert under 30 min vid 37 ° C.
- Tvätta objektglasen 3 gånger i PN-buffert vid rumstemperatur under 3 min vardera.
- Drainöverskott PN buffert på diabilder i taget genom att slå på kanten på en pappershandduk. Tillsätt 20 | il DAPI / antifad montering lösning (Invitrogen). Täck bilden med en pappershandduk och tryck ner på täckglaset för att tvinga ut luftbubblor och överskott monteringslösning. Gå vidare till bildanalys.
8. Fånga bilder och kvantifiera BrdU Inkorporering
- Bilderna tagna med en Olympus BX61 fluorescensmikroskop och Olympus CCD-kamera, 100x objektiv, automatisk filter-hjulet och Cytovision programvara (Applied Imaging). BrdU fångas med hjälp av en FITC-filter, kromosom färger (Texas Red, Metasystems eller Cytocell) är BAC: s (Cy3) och CEP (Vysis Spectrum Orange) sonder tagits med en Texas Red eller Cy3 filter, DAPI fångas med en DAPI Filter (se Figurerna 2 och 3).
- Enskilda kromosomer av intresse identifieras med BAC / CEP eller kromosom-specifika prober färg (fig. 2B och 3B). Användaden Cytovision mjukvaran, varje kromosom av intresse är "cut-out" från metafas spridning som en helhet, är en linje dragen genom längs kromosomen från korta armen till lång arm (figurerna 2C och 3C). Den Cytovision programvara används för att kvantifiera pixelintensiteten profilen längs längden av varje kromosom. Den Cytovision Programvaran beräknar arean som upptas av pixlar och kvantifierar intensiteten av pixlarna som representeras av BrdU eller DAPI signaler på varje isolerad kromosom. Den genomsnittliga pixelintensiteten representeras av varje kromosom multipliceras sedan med det område som upptas av dessa bildpunkter att få det totala antalet pixlar (tabell 1 och figur 4). Dessutom tillåter detta protokoll för visualisering av de senaste replikerande regioner kromosomer. Därför gör den bandade mönster BrdU inkorporering för detektion av aktivt replikerande regioner av kromosomer, och skillnader i replikering timing mellan kromolitografierågra paren ses som skillnader i denna bandmönster (fig. 2 och 3). Slutligen kan dessa skillnader i bindande mönster jämföras med kända kartor replikering timing för varje kromosom 6,7, vilket möjliggör en uppskattning av replikering timing mellan homologa kromosomer eller armar kromosom 4. Till exempel är de två kromosom 6 i fig 3A visar en skillnad i bandmönster av> 2 timmar jämfört med den normala replikeringen tidpunkten för kromosom 6 4.
Dessutom har ett liknande förfarande som det som beskrivs här framgångsrikt använts för att studera den asynkrona replikering timingen mellan de inaktiva och aktiva X-kromosomer 8,9. De aktiva och inaktiva X-kromosomer identifierades med X-kromosom färger. Bilder förvärvades med ironier mFISH programvara (Vysis) och antalet pixlar som upptas av X-kromosomer och antalet pixlar som upptas av fluorescerande labeled BrdU sedan beräknas med NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).
9. Nick Översättning av BAC-DNA för fluorescensmärkning (Vysis)
- Lägg till följande sondblandning till kylda en mikrofugrör:
70 pl (4 pg DNA) i dH 2 O
10 pl 0,2 mM dUTP-orange eller grön
20 il .1 mm dTTP
20 pl 10x nicktranslation buffert
40 ul NT dNTP (minus dTTP)
40 pl nicktranslation enzym
200 | il total volym
Inkubera @ 16 ° CO / N. Stoppa reaktionen genom upphettning vid 70 ° C under 10 minuter. Kyla på is under 5 minuter. - Fälla ut DNA med etanol genom att lägga till följande i sondblandning:
200 pl problösning
48 ul 3 M NaOAc
160 pl Cot1DNA (.25 ng / ul)
1.200 il 100% EtOH - Lagra vid -80 ° C under 10 min till O / N.
- Snurra jagn kallt vid 12.000 xg under 20 minuter. Dekantera av EtOH. Tvätta 1 gång med 70% EtOH. Snurra som förut. Dekantera av EtOH. Lufttorka bara tills EtOH avdunstar. Återsuspendera i 40 pl dH 2 O för slutlig koncentration av 100 ng / pl av BAC-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på replikering timing analys för human kromosom 6 visas i figur 2. Celler som innehåller en deletion av ASAR6 genen 4, som ligger vid 6q16.1, utsattes för BrdU under 5 timmar, skördas för mitotiska celler och bearbetas för fisk med en kromosom 6 färg sond (Vysis) och för BrdU inkorporering. Observera att det finns en signifikant skillnad i BrdU bandmönster mellan de två 6 s, vilket är förenligt med en fördröjning i replikation tidpunkten för> 2 h för en av kromosom 6 s [se 4 för replikering timingen bandmönster av kromosom 6 före borttagningen]. Dessutom, finns det en signifikant skillnad i den totala mängden BrdU-inkorporering (pixlar) jämfört med en liknande analys av DAPI-färgning (figur 2D).
Ett annat exempel på replikering timing analys för human kromosom 6 visas i figur 3. Celler som innehåller same radering av ASAR6 genen 4 visas om figur 2 utsattes för BrdU under 5 timmar, skördas för mitotiska celler och bearbetas för fisk med en kromosom 6 CEP sond plus en BAC innehåller ASAR6 genen och för BrdU inkorporering. Notera att den borttagna kromosom 6 (Δ6) visar mer BrdU-inkorporering och en mer utsträckt bandmönster av BrdU-inkorporering än den icke-raderade kromosom 6. Mitotiska sprids från 7 olika celler bearbetades såsom i figur 3 och de pixel profilerna för både DAPI och BrdU visas i tabell 1.
Figur 1. BrdU terminal miljömärke. En typisk S-fasen i däggdjursceller senaste under 8 till 10 h, och G2 är typiskt 2 till 5 timmar. BrdU tillsattes för ökande tidsperioder (gröna pilar) för att märka de sista delarna av kromosomer att replikera. The kromosomer i däggdjursceller replikera enligt en tidsmässig program med tidig och sen replikation uppträder vid början och slutet av S-fasen respektive (svart linje). Inaktiva X-kromosomer är försenade i replikering timing med majoriteten av DNA-syntes sker under andra halvan av S-fas (blå linje). Kromosomer med fördröjd replikering timing fördröjs både initiering och färdigställande av DNA-syntes, med aktiv replikation fortsätter genom G2 (röd linje). Asynkrona kulturer skördas för mitotiska celler och bearbetas för BrdU inkorporering och fisk.
Figur 2. Asynkron replikering av human kromosom 6. Celler som innehåller en konstruerad radering av ASAR6 genen 4 behandlades med BrdU för 5 timmar, skördas för mitotiska celler och bearbetas för BrdU inkorporering och FISH med en krom osome 6 färg som sond. DNA: t färgades med DAPI (blå). A) En mitotiska sprids med en typisk "bandad" mönster av BrdU inkorporering (grön) visas. Kromosom 6 färg sond hybridiserades till två kromosom 6 s (röd) i denna cell. B) De två kromosom 6 s (i och ii) var "skars ut" och visas med de tre fluorescerande markörer separerade i distinkta bilder. C) kromosom 6 har analyserades med hjälp av Cytovision programvara och signalen profilerna intensitet för både DAPI (blå) och BrdU (grön) visas. Den röda linjen visar den bana som användes, från korta armen (p) till lång arm (q) för kvantifiering av både BrdU och DAPI. Det Avstånd hänvisar till längden på varje kromosom från korta armen (p) lång arm (q) i pixlar. D) Kvantifiering av den totala signalen för både DAPI och BrdU fluorescens. De totala värdena representerar den genomsnittliga pixelintensiteten multiplicerat med det område som dessa pixlar.
igure 3 "src =" / files/ftp_upload/4400/4400fig3.jpg "/>
Figur 3. Fördröjd replikering av människans kromosom 6 som innehåller en borttagning av ASAR6. Celler som innehåller en konstruerad radering av ASAR6 genen 4 behandlades med BrdU för 5 timmar, skördas för mitotiska celler och bearbetas för BrdU inkorporering och FISH med en kromosom 6 CEP plus en BAC innehåller ASAR6 genen som sönder. DNA: t färgades med DAPI (blå). A) En mitotiska sprids med en typisk "bandad" mönster av BrdU inkorporering (grön) visas. Kromosom 6 CEP sond hybridiserades till två kromosom 6 s (stora röda centromerisk signal), och BAC hybridiserade till en enda kromosom 6 (liten röd signal på den långa armen) i denna cell. Notera skillnaden i BrdU bandmönster mellan de två 6-talet. B) utgår kromosom 6 representeras av Δ6 och den icke-deleterade 6 med 6. De två 6-talet var "skära ut" och visas med de tre fluorescerande markörer separerade i distinkta bilder. C) THan kromosom 6 har analyserades med hjälp av Cytovision programvara och signalen profilerna intensitet för både DAPI (blå) och BrdU (grön) visas. Den röda linjen visar den bana som användes, från korta armen (p) till lång arm (q) för kvantifiering av både BrdU och DAPI. Det Avstånd hänvisar till längden på varje kromosom från korta armen (p) lång arm (q) i pixlar. D) Kvantifiering av den totala signalen för både DAPI och BrdU fluorescens. De totala värdena representerar den genomsnittliga pixelintensiteten multiplicerat med det område som dessa pixlar.
Figur 4. Kvantifiering av replikering tidskillnad mellan kromosom 6 är. Celler som innehåller en konstruerad radering av ASAR6 genen 4 behandlades med BrdU för 5 timmar, skördas för mitotiska celler och bearbetas för BrdU inkorporering och FISH med en kromosom 6 CEP sond plus enBAC innehåller ASAR6 genen som sond. Mitotiska bredbara bearbetades såsom i fig 3 och värdena för 7 olika celler visas (se tabell 1). A) DAPI-färgning kvantifierades och det totala antalet pixlar visas för varje cell. Observera att det endast ~ 10-20% skillnad mellan kromosomer inom samma cell. B) BrdU-inkorporering kvantifierades från samma kromosomer som panel B ovan. Observera att det finns> 2 faldig skillnad mellan de totala pixelvärden för den borttagna och icke-raderade kromosom 6 är.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beredningen av kromosom sprider är ett kritiskt steg för att framgångsrikt replikering-timing analys som beskrivits här. Införandet av en Colcemid förbehandlingssteg före hypoton behandling kan hjälpa frekvens och spridning av mitotiska celler. Vi utsätter typiskt celler till colcemdi för 1-3 timmar före skörd och användning Colcemid vid en slutlig koncentration av 10 ng / ml. Emellertid kan införande av ett kolcemid förbehandlingssteg ändra längden på G2 och följaktligen kan förändra den skenbara replikering timing och tillstånd av kondensation av kromosomerna 3.
Detta förfarande kan tillämpas på många olika celltyper och arter genom att variera längden av BrdU inkubation, vilket beror på cellcykeln varaktighet. För de flesta humana och mus-cellinjer, är den G2-fasen typiskt 3-6 h, och därför BrdU behandlingar är typiskt inom detta intervall. Ett alternativ till BrdU är 5-etynyl-2'deoxyuridine (EDU) och dess efterföljande detektion med användning aven fluorescerande azid och "klick kemi" reaktion 10. ENE upptäckt Systemet har flera fördelar jämfört med BrdU upptäckt systemet. Till exempel kräver detektering av Edu inte prov fixering eller DNA denaturering. Således kan användningen av Edu att bedöma replikering timing kombineras med enkla G-ränder tekniker istället för fisk att identifiera kromosomerna av intresse.
Replikering timing beskrivna protokollet här är speciellt utformad för att analysera sen S-fas plus DNA-syntes som sträcker sig in G2. Dessutom kan DNA-replikation kan övervakas under S-fas med detta förfarande genom att använda korta (15-30 minuter) pulser av BrdU följt av relativt långa chase perioder om 6-10 tim. Detta medger visualisering av BrdU-inkorporering i både tidiga och mellersta S-fas. Exempelvis vissa tumör härledda kromosom omlagringar fördröjd i både initieringen och slutförandet av DNA-syntes längs hela längden av kromosomerna 3
En fördel med denna replikering timing förfarande är att det analyser replikering timing i individuella celler. Därför, har den förmågan att detektera skillnader i replikering timing mellan homologa kromosomer som finns i samma cell. Medan det finns andra förfaranden, t ex. replikering timing in situ-hybridisering (ReTiSH, 11), som har förmågan att detektera skillnader i replikering timing mellan alleler vid specifika loci på homologa kromosomer, kan det förfarande som beskrivs här detekterar skillnader i replikering timingen längs hela längden av kromosomer. Dessutom, detta förfarande kan analys skillnader i replikering tidpunkten för kromosomer som är närvarande i endast en bråkdel av cellerna i en population 3. Exempelvis många cancer cellinjer och primära tumörprover innehåller kromosom omlagringar som är närvarande i mindre än 50% av cellerna. Vi använder för närvarande denna procedur för att analysera kromosomeri primära tumörprover, och har kunnat upptäcka asynkron replikering mellan kromosomer i flera prover. Eftersom primära tumörprover har ett begränsat antal mitotiska figurer, ungefär en tredjedel av de primära kulturerna inte ge tillräckligt antal mitotiska uppslag.
En annan fördel att detta förfarande har över microarray eller sekvensering baserade analyser är att enskilda kromosomer analyseras snarare än immunoprecipiterade DNA från pooler av celler. I immunoprecipitation-baserade analyser polymorfismer måste identifieras och kopplas till specifika alleler för att skilja replikering timingen mellan alleler.
Dessutom med insikten att många cancerceller innehåller många kromosom omdisponeringar 12 samt observationer som DNA-replikation stress i samband med genomisk instabilitet i cancerceller 13, tror vi att detta protokoll är ett användbart och enkelt verktyg feller rutinanalys av replikering timingen av kromosomer i cancerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Cancer Institute, CA131967.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
| Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
| CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
| LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
| CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
| Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
| Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
| Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
| Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
| IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |
|||
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
- Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
- Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
- Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
- Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
- Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
- Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
- Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
- Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
- Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from: http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman (2006).
- Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).
