Summary
En kvantitativ metode til analyse af kromosomreplikation timing er beskrevet. Fremgangsmåden anvender BrdU-inkorporering i kombination med fluorescerende
Abstract
Mammalian DNA-replikation initierer flere steder langs kromosomer på forskellige tidspunkter i løbet af S-fasen, efter en tidsmæssig replikation program. Specifikationen af replikation timing menes at være en dynamisk proces, reguleret af vævsspecifikke og udviklingsmæssige signaler, som reagerer på epigenetiske modifikationer. Men de mekanismer, der regulerer, hvor og hvornår DNA-replikation starter langs kromosomerne stadig dårligt forstået. Homologe kromosomer normalt replikere synkront, men der er markante undtagelser fra denne regel. For eksempel en af de to X-kromosomer hos kvindelige pattedyrceller bliver forsinket replikerende gennem en proces, der kaldes X-inaktivering 1. Sammen med denne forsinkelse i replikation timing, skønnes at være 2-3 timer, bliver størstedelen af gener transkriptionelt tavs på én X-kromosom. Desuden regulerer en diskret cis-virkende locus, kendt som X-inaktivering er dette X inaktiveringsproces, herunder the induktion af forsinket replikation timing på hele inaktive X-kromosom. Desuden udsættes visse kromosomomlejringer fundet i cancerceller og i celler for ioniserende stråling vise en væsentlig forsinkelse i replikation timingen af> 3 timer, der påvirker hele kromosom 2,3. Seneste arbejde fra vores laboratorium viser, at afbrydelse af diskrete cis-agerende autosomal loci resulterer i et meget sent replikerende fænotype, der påvirker hele kromosom 4. Yderligere 'kromosom engineering "undersøgelser viser, at visse kromosomomlejringer påvirker mange forskellige kromosomer resultat i denne unormale replikations-timing fænotype, hvilket tyder på, at alle pattedyrs-kromosomer indeholder diskrete cis-virkende loci, der styrer korrekt replikation timingen af individuelle chromosomer 5.
Her præsenteres en metode til kvantitativ analyse af kromosomreplikation timing kombineret med fluorescerende in situ hybridisering. DetteFremgangsmåden muliggør en direkte sammenligning af replikation timing mellem homologe kromosomer i samme celle, og blev tilpasset fra 6. Derudover muliggør denne fremgangsmåde til utvetydig identifikation af kromosomale omlejringer, der korrelerer med ændringer i replikation timing, der påvirker hele kromosomet. Denne metode har fordele i forhold til nyligt udviklede high throughput mikro-array eller sekventering protokoller, der ikke kan skelne mellem homologe alleler stede på omarrangeret og un-omarrangeret kromosomer. Endvidere, fordi den her beskrevne fremgangsmåde evalueres enkelte celler kan detektere ændringer i kromosomreplikation timing for kromosomale omlejringer, der er til stede i kun en fraktion af cellerne i en population.
Protocol
1. BrdU Indbygning (Terminal Mærkning)
- Plade celler til omkring 70% konfluens i en 150 mm vævskulturskål 24 timer inden tilsætningen af BrdU.
- Erstatte medierne med frisk komplet medium indeholdende 20 ug / ml BrdU (Sigma) ved passende tidspunkter før høst. Hvor længe celler dyrkes i medier med BrdU vil variere med celletypen og arter, typisk G2 fase varer mellem 2 og 5 timer (figur 1).
2. Kromosom Høst af enkeltlagskulturer cellekulturer
- Fjern kulturmedium fra pladen og opsamles 10 ml i et 15 ml konisk centrifugerør. Skille resterende medie.
- Skyl celler en gang med 10 ml Versine [eller HBSS (Sigma)].
- Der tilsættes 5 ml 0,25% trypsin i Versine (eller HBSS) til pladen. Inkuber ved stuetemperatur, indtil cellerne er frigjort fra pladen.
- Tilføj trypsineres cellesuspension til rør indeholdende 10 ml medium fra trin 2.1. </ Li>
- Centrifuger ved 400 x g i 10 minutter for at pelletere cellerne. Aspirer supernatanten, hvilket efterlader 0,5 ml medium plus cellepelleten.
- Resuspender cellerne grundigt ved pipettering med en Pasteur-pipette.
- Tilsæt 3 dråber hypotonisk opløsning (0,075 M KCI (Sigma) opvarmet til 37 ° C), bland cellesuspensionen med en Pasteur-pipette. Tilsæt 0,5 ml hypotonisk opløsning og blandes igen med en Pasteur-pipette. Bring volumen hypotonisk opløsning til 5 ml og bland igen. Inkuber ved 37 ° C i 20-45 min, afhængig af celletypen.
- Centrifuger ved 400 x g i 10 minutter. Aspirer supernatanten, hvilket efterlader 0,5 ml medium plus cellepelleten.
- Resuspender cellepelleten ved forsigtigt at svippe røret. De osmotisk hævede celler vil være skrøbelig på dette punkt, så man skal passe på ikke at forstyrre de cytoplasmiske membraner.
- Tilsæt 3 dråber Carnoy fikseringsreagens (1:3 Iseddike: Methanol) og blandes ved forsigtigt at pipettere med en Pasteur pipette. Tilsæt 0,5 ml fiksativ og blandes ved forsigtigt at pipettere med en Pasteur-pipette. Bringe mængden af fiksativ til 5 ml og bland igen ved forsigtig pipettering med en Pasteur-pipette. Fikserede celler kan opbevares i mørke ved -20 ° C i flere måneder.
- Centrifuger og aspirere som i trin 2.8.
- Resuspender cellepelleten i frisk fiksativ, beregne mængden af pelleten og add ~ 10x omfanget af Carnoy fikseringsreagens.
- Tilsættes cellesuspensionen dråbevis på våde, iskolde mikroskopobjektglas, holde objektglasset i en ~ 45 ° vinkel og lade cellesuspensionen til at strømme hen over overfladen af præparatglasset. Læg slide fladt på papirservietter og oversvømmelse objektglasset med fiksativ og lad dem lufttørre. Kontrolskyder for tilstedeværelsen af mitotiske spreads under anvendelse af et omvendt mikroskop.
3. RNase-behandling og Ethanol Dehydrering
- Sted 200 gl 10 ug / ml RNase A (Sigma) i 2 x SSC til hver slide, inkuber ved 37 og deg; C i 1 time.
- Wash slides 3 gange med 2 x SSC, pH 7,0 ved stuetemperatur i 3 min hver.
- Dehydratisere slides gennem en EtOH (Sigma) serier (70%, 90% og 100%) ved stuetemperatur i 3 min hver.
- Air tørre dias ved stuetemperatur.
4. Udarbejdelse af Probe Cocktails for BAC Plus Kromosom-specifik Centromer Enumeration Probe (CEP) eller til helt kromosom Paints in situ hybridisering
- For BAC / CEP samtidig hybridisering, forberede to separate sonder cocktails for pre-hybridisering. Vi har fundet, at præ-hybridisering af de BAC og CEP prober separat under forskellige stringenser resulterer i mindre baggrund og større signalintensiteter. Vi har også fundet, at individuelle Fosmids også kan anvendes i stedet for BAC kloner. Den cocktail formulering beskrevet nedenfor repræsenterer mængder for et enkelt dias. Hvis behandling af flere dias ved hjælp af de samme prober blot øge mængden appropr iately.
* BAC DNA-probe cocktail:
11,5 pi hybridiseringsbuffer (50% formamid (Sigma) / 2 x SSC / dextransulfat (Sigma)) 2 ul dH2O
2.5 pi BAC/Cot1 DNA i dH2O (se nedenfor til mærkning protokol) 15 ul totalvolumen
* CEP sonde cocktail:
7 pi CEP hybridiseringsbuffer (65% Formamide/2x SSC / dextransulfat) 2 ul dH2O
1 pi CEP/Cot1 DNA (købt prelabeled med Spectrum Orange/Cy3/Texas Red) 10 gl totalt volumen
* Efter denaturering og præ-hybridisering (trin 5.1) blandes BAC sonde med CEP sonde på en 3:2-forhold 25 gl / dias og bland probe cocktails.
OR
- Portion 20 ul / slide af helt kromosom Paint probe (Cy3/Texas Red) til et rør. Fortsæt til denaturering og præ-hybridiseringstrin.
- Denaturerer probe cocktail (s) ved 75 ° C i 10 minutter. Præ-hybridiseres ved 37 ° C i 30 minutter for at tillade Cot1 DNA til at hybridisere til repetitive sekvenser, og at forhindre efterfølgende hybridisering til metafasekromosomer.
- Denaturere objektglassene i Coplin-skåle i 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 ved 72 ° C i 3 minutter.
- Umiddelbart dehydratisere slides gennem en EtOH-serien (70%, 90% og 100%) i Coplin-skåle ved 4 ° C i 3 min hver.
- Lad objektglassene lufttørre ved stuetemperatur.
- Pre-varme objektglas til 45 ° C på objektglas varmere i de sidste 10 minutter af sonden før hybridzation (trin 5.1). Bland pre-hybridiseret probe cocktails hvis det er nødvendigt, og der tilsættes 25 ul til hvert dias, blidt sted et dækglas på de enkelte dias og tætning langs alle kanter med gummi cement. Inkuber natten over ved 37 ° C i et fugtigt kammer for at forhindre fordampning.
- Skylning af objektglas i Coplin-skåle 3 gange i 50% formamide/2x SSC, pH 7,0, ved 38-40 ° C i 3 min hver. Temperaturen af vaskene kan variere mellem prober. Hvis der er stor baggrundshybridisering man kan hæve temperaturen af vaskene. Omvendt, hvis signalet er svagt, og der er ingen baggrund, så kan du sænke temperaturen af disse vaske.
- Wash slides 1 gang i PN-puffer ved stuetemperatur i 3 minutter, gå videre, og de BrdU detektionstrin.
7. BrdU Detection
- Blok objektglassene med PNM puffer i 10 min (200 ul / slide) ved stuetemperatur i mørke.
- Tøm lysbilleder ved at tænde på kanten på et stykke køkkenrulle. Tilsæt 100 pi anti-BrdU-FITC (50 pg / ml Roche eller Millipore) i PNM puffer i 30 min ved 37 ° C.
- Skylning af objektglas 3 gange i PN-puffer ved stuetemperatur i 3 min hver.
- Drænoverskydende PN buffer på lysbilleder en ad gangen ved at tænde på kanten på et stykke køkkenrulle. Tilsæt 20 gl DAPI / antiblegemiddel montering opløsning (Invitrogen). Dæk dias med et stykke køkkenrulle og tryk ned på dækglasset at tvinge ud luftbobler og overskydende monteringsløsning. Fortsæt til billedanalyse.
8. At tage billeder og kvantificere BrdU Incorporation
- Billeder er taget med et Olympus BX61 fluorescerensmikroskop og Olympus CCD kamera, 100x objektiv, automatisk filter-hjulet og Cytovision software (Applied Imaging). BrdU indfanges ved hjælp af et FITC-filter, kromosom maling (Texas Red, Metasystems eller Cytocell), er BAC s (Cy3) og CEP (Vysis Spectrum Orange) prober indfanget med et Texas Red eller Cy3 filter, DAPI er fanget med et DAPI Filter (se figur 2 og 3).
- Individuelle kromosomer af interesse, identificeres med BAC / CEP eller kromosom-specifikke maling prober (figur 2B og 3B). UdnytteDen Cytovision software, hvert kromosom af interesse er "cut-out" fra metafase spredning som helhed, er en linje trukket gennem det langs længden af kromosomet fra korte arm til lange arm (fig. 2C og 3C). The Cytovision software anvendes til at kvantificere den pixelintensitet profil langs længden af hvert kromosom. The Cytovision software beregner arealet pixels og kvantificerer intensiteten af pixelene repræsenteret ved BrdU eller DAPI signaler på hver isolerede kromosom. Den gennemsnitlige pixelintensitet repræsenteret af hvert kromosom er derefter multipliceret med arealet de pixels til opnåelse af det samlede antal pixels (tabel 1 og figur 4). Desuden giver denne protokol til visualisering af de seneste replikerende områder af kromosomer. Følgelig den stribede mønster af BrdU-inkorporering muliggør påvisning af aktivt replikerende områder af kromosomer, og forskelle i replikation timing mellem Chromosogle par betragtes som forskelle i denne båndmønster (figur 2 og 3). Endelig kan disse forskelle i bindingsmønstre sammenlignes med kendte replikations timing kort for hver kromosom 6,7, hvilket tillader et skøn over replikation tidsforskellen mellem homologe kromosomer eller kromosomarmene 4. For eksempel er de to kromosom 6 i figur 3A viser en forskel i båndmønster på> 2 timer sammenlignet med den normale replikation timingen af kromosom 6 4.
Desuden er en fremgangsmåde svarende til den, der er beskrevet her med held blevet anvendt til undersøgelse af den asynkrone replikation tidsperiode mellem inaktive og aktive X-kromosomer 8,9. De aktive og inaktive X-kromosomer blev identificeret ved hjælp af X-kromosom maling. Billeder blev erhvervet ved hjælp vitser mFISH software (Vysis) og antallet af pixels besat af X-kromosomer og antallet af pixels er besat af fluorescens laBeled BrdU blev derefter beregnet ved hjælp NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).
9. Nick Oversættelse af BAC DNA for fluorescerende mærkning (Vysis)
- Tilføj følgende probe mix til kølet et mikrofugerør:
70 pi (4 ug DNA) i dH2O
10 pi 0,2 mM dUTP-orange eller grønt
20 ul 0,1 mM dTTP
20 pi 10x Nick Translation Buffer
40 ul NT dNTP'er (minus dTTP)
40 ul nick translation enzym
200 pi totalvolumen
Inkuber @ 16 ° CO / N. Stop reaktionen ved opvarmning til 70 ° C i 10 min. Chill på is i 5 min. - Udfælde DNA'et med ethanol ved tilsætning af følgende til den probeblanding:
200 pl probe opløsning
48 gl 3 M NaOAc
160 ul Cot1DNA (0,25 ug / ul)
1200 pi 100% EtOH - Opbevares ved -80 ° C i 10 minutter til O / N.
- Spin in koldt ved 12.000 x g i 20 minutter. Dekanteres off EtOH. Vask 1 gang med 70% EtOH. Spin som før. Dekanteres off EtOH. Lufttørre lige indtil EtOH fordampet. Resuspender i 40 ul dH2O for slutkoncentration på 100 ng / pi BAC DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på replikationen timing analyse for humant kromosom 6 er vist i figur 2. Celler, der indeholder en deletion af ASAR6 gen 4, placeret på 6q16.1, blev udsat for BrdU i 5 timer, høstet til mitotiske celler og behandlet til FISH med en kromosom 6 maling probe (Vysis) og for BrdU-inkorporering. Bemærk, at der er en signifikant forskel i BrdU båndmønster mellem de to 6 s, hvilket er konsistent med en forsinkelse i replikation hvornår> 2 timer for en af kromosom 6 er [se 4 for replikationen timing båndmønster af kromosom 6 før deletionen]. Derudover er der en signifikant forskel i den totale mængde af BrdU-inkorporering (pixels) ved sammenligning med en lignende analyse af DAPI farvning (fig. 2D).
Et andet eksempel på replikationen timing analyse for humant kromosom 6 er vist i figur 3.. Celler indeholdende same deletion af ASAR6 gen 4 vises, hvis figur 2 blev udsat for BrdU i 5 timer, høstet til mitotiske celler og behandlet til FISH med en kromosom 6 CEP probe plus en BAC indeholdende ASAR6 genet og for BrdU-inkorporering. Bemærk, at den slettede kromosom 6 (Δ6) viser mere BrdU-inkorporering og en udvidet båndmønster af BrdU-inkorporering end den ikke-slettede kromosom 6. Mitotiske spreder sig fra 7 forskellige celler blev forarbejdet som i figur 3, og de pixel profiler for både DAPI og BrdU, er vist i tabel 1..
Figur 1. BrdU terminal label ordningen. En typisk S-fase i pattedyrceller last for 8-10 timer, og G2 er typisk 2-5 timer. BrdU sættes til forøgelse tid (grønne pile) til at mærke de sidste dele af kromosomerne for at replikere. The kromosomer i mammale celler replikerer efter et tidsmæssigt program, med tidlig og sen replikation forekommer ved begyndelsen og slutningen af S-fasen (sort linie). Inaktive X-kromosomer er forsinket i replikation timing med størstedelen af DNA-syntese forekom i den anden halvdel af S-fasen (blå linje). Kromosomer med forsinket replikation timing er forsinket i både indledning og afslutning af DNA-syntese, med aktiv replikation fortsatte gennem G2 (rød linje). Asynkrone kulturer høstes til mitotiske celler og behandlet til BrdU inkorporering og FISH.
Figur 2. Asynchronous replikation af humant kromosom 6. Celler indeholdende en manipuleret deletion af ASAR6 gen 4 blev behandlet med BrdU i 5 timer, høstet til mitotiske celler og behandlet til BrdU-inkorporering og FISH under anvendelse af en chrom osome 6 maling som probe. DNA'et blev farvet med DAPI (blå). A) En mitotisk spread indeholdende en typisk "stribet" mønster af BrdU-inkorporering (grøn) er vist. The kromosom 6 maling probe hybridiseret til to kromosom 6 (rød) i denne celle. B) de to kromosom 6 er (i og ii) blev "skåret ud" og vises med de tre fluorescerende mærker opdeles i separate billeder. C) kromosom 6 er blevet analyseret under anvendelse af Cytovision software og signal-intensitetsprofiler for både DAPI (blå) og BrdU (grøn) er vist. Den røde linje viser den anvendte vej, fra kort arm (p) til lange arm (q) til kvantificering af både BrdU og DAPI. Distance refererer til længden af hvert kromosom fra korte arm (p) til lange arm (q) i pixels. D) Kvantificering af det samlede signal for både DAPI og BrdU-fluorescens. De samlede værdier repræsenterer den gennemsnitlige pixelintensitet multipliceret med det område repræsenteret af de pixels.
igur 3 "src =" / files/ftp_upload/4400/4400fig3.jpg "/>
Figur 3. Forsinket replikation af humant kromosom 6, der indeholder en deletion af ASAR6. Celler indeholdende en manipuleret deletion af ASAR6 gen 4 blev behandlet med BrdU i 5 timer, høstet til mitotiske celler og behandlet til BrdU-inkorporering og FISH under anvendelse af en kromosom 6 CEP plus en BAC indeholdende ASAR6-genet som prober. DNA'et blev farvet med DAPI (blå). A) En mitotisk spread indeholdende en typisk "stribet" mønster af BrdU-inkorporering (grøn) er vist. The kromosom 6 CEP probe hybridiserede til to kromosom 6 er (store røde centromere signal), og BAC hybridiserede til et enkelt kromosom 6 (små røde signal på den lange arm) i denne celle. Bemærk forskellen i BrdU båndmønster mellem de to 6 s. B) Den slettede kromosom 6 er repræsenteret ved Δ6 og den ikke-deleterede 6 med 6. De to 6 er blevet "skåret ud" og vises med de tre fluorescerende mærker opdeles i separate billeder. C) THan kromosom 6 er blevet analyseret under anvendelse af Cytovision software og signal-intensitetsprofiler for både DAPI (blå) og BrdU (grøn) er vist. Den røde linje viser den anvendte vej, fra kort arm (p) til lange arm (q) til kvantificering af både BrdU og DAPI. Distance refererer til længden af hvert kromosom fra korte arm (p) til lange arm (q) i pixels. D) Kvantificering af det samlede signal for både DAPI og BrdU-fluorescens. De samlede værdier repræsenterer den gennemsnitlige pixelintensitet multipliceret med det område repræsenteret af de pixels.
Fig. 4. Kvantificering af replikationen tidsforskellen mellem kromosom 6 s. Celler indeholdende en manipuleret deletion af ASAR6 gen 4 blev behandlet med BrdU i 5 timer, høstet til mitotiske celler og behandlet til BrdU-inkorporering og FISH under anvendelse af en kromosom 6 CEP probe plus enBAC indeholdende ASAR6 genet som probe. Mitotiske spreads blev forarbejdet som i figur 3 og værdierne for 7 forskellige celler er vist (se tabel 1). A) DAPI-farvning blev kvantificeret, og det totale antal pixler vises for hver celle. Bemærk, at der kun ~ 10-20% forskel mellem kromosomer i samme celle. B) BrdU-inkorporering blev kvantificeret fra de samme kromosomer som panel B ovenfor. Bemærk, at der er> 2 gange forskel i den samlede pixelværdier for den slettede og ikke-udgår kromosom 6 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremstillingen af kromosom spreads er et kritisk skridt for en vellykket replikation-timing assayet beskrevet her. Inddragelsen af et colcemid forbehandling trin forud for hypotonisk behandling kan hjælpe i frekvens og spredning af mitotiske celler. Vi typisk udsætte celler for colcemdi for 1-3 timer før høst, og anvendelse Colcemid i en slutkoncentration på 10 ug / ml. Imidlertid kan medtagelse af et colcemid forbehandlingstrin ændre længden af G2 og derfor kan ændre den åbenbare replikation timing og tilstand af kondensation af kromosomerne 3.
Denne procedure kan anvendes på mange forskellige celletyper og arter ved at variere længden af BrdU inkubation, der afhænger af cellecyklus varighed. For de fleste humane og murine cellelinjer, er G2-fase typisk 3-6 timer, og derfor BrdU behandlinger er typisk i dette område. Et alternativ til BrdU er 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (Edu) og dets efterfølgende påvisning ved hjælp afen fluorescerende azid og "click-kemi" reaktion 10. EDU afsløring ordningen har flere fordele i forhold BrdU afsløring ordningen. For eksempel giver påvisning af Edu ikke kræver prøve fiksering eller DNA denaturering. Således kan brugen af EDU at vurdere replikation timing kombineres med enkle G-banding teknikker i stedet for fisk at identificere de kromosomer af interesse.
Replikationen timing protokollen beskrevet her er specielt designet til assay sen S-fase plus enhver DNA-syntese strækker sig ind G2. Desuden kan DNA-replikation følges gennem S-fasen ved hjælp af denne fremgangsmåde ved at anvende korte (15-30 min) pulser af BrdU efterfulgt af relativt lange chase perioder på 6-10 timer. Dette muliggør visualisering af BrdU-inkorporering i både tidlige og midterste S-fase. For eksempel er visse tumorafledte kromosomomlejringer forsinket i både igangsættelse og gennemførelse af DNA-syntese langs hele længden af kromosomerne 3
En fordel ved denne replikation timing procedure er, at den assays replikation timing i individuelle celler. Derfor har evnen til at detektere forskelle i replikation timing mellem homologe kromosomer der findes på den samme celle. Mens der er andre fremgangsmåder, f.eks. replikation timing in situ-hybridisering (ReTiSH, 11), der har evnen til at detektere forskelle i replikation timing mellem alleler i bestemte loci på homologe kromosomer, kan den her beskrevne procedure detektere forskelle i replikationen timing langs hele længden af kromosomer. Desuden kan denne fremgangsmåde assay forskelle i replikation timingen af kromosomer, der er til stede i kun en brøkdel af celler af en population 3. For eksempel er mange cancercellelinier og primære tumorprøver indeholder kromosomomlejringer der er til stede i mindre end 50% af cellerne. Vi er i øjeblikket ved hjælp af denne procedure til assay kromosomeri primære tumorprøver, og har været i stand til at opdage asynkron replikering mellem kromosomer i flere prøver. Da primære tumorprøver har et begrænset antal mitotiske figurer, omkring en tredjedel af de primære kulturer ikke givet et tilstrækkeligt antal mitotiske spreads.
En anden fordel, at denne fremgangsmåde har over microarray eller sekventering baserede assays er, at individuelle kromosomer analyseres i stedet immunopræcipiterede DNA fra puljer af celler. I immunpræcipitation-assays polymorfier skal identificeres og knyttet til specifikke alleler for at adskille replikationen timing mellem alleler.
Desuden vil der med erkendelsen af, at mange kræftceller indeholder talrige kromosomomlejringer 12, observation, at DNA-replikation stress er forbundet med genomisk ustabilitet i kræftceller 13, mener vi, at denne protokol er et nyttigt og simpelt værktøj feller rutinemæssig analyse af replikations timingen af kromosomer i cancerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Cancer Institute, CA131967.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
| Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
| CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
| LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
| CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
| Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
| Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
| Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
| Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
| IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |
|||
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
- Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
- Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
- Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
- Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
- Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
- Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
- Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
- Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
- Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from: http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman (2006).
- Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).
