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Biology

क्रोमोजोम नकल फ्लोरोसेंट के साथ संयुक्त समय Published: December 10, 2012 doi: 10.3791/4400
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University

Summary

गुणसूत्र प्रतिकृति समय के विश्लेषण के लिए एक मात्रात्मक विधि का वर्णन है. विधि फ्लोरोसेंट के साथ संयोजन में BrdU निगमन का इस्तेमाल

Protocol

1. BrdU निगमन (टर्मिनल लेबल)

  1. बारे में एक 150 मिमी ऊतक संस्कृति डिश 24 BrdU के अलावा पहले घंटा में 70% संगम प्लेट कोशिकाओं.
  2. ताजा पूरा उपयुक्त समय बिंदुओं पर 20 ग्राम / एमएल BrdU (सिग्मा) फसल के लिए पहले वाले मीडिया के साथ मीडिया को बदलें. समय कोशिकाओं की लंबाई BrdU सेल प्रकार और प्रजातियों के साथ भिन्न हो सकते हैं, आम तौर पर G2 चरण 2 और 5 के बीच घंटा (1 चित्रा) रहता है के साथ मीडिया में संवर्धित कर रहे हैं.

2. Monolayer कोशिकाओं संस्कृतियों के क्रोमोजोम हार्वेस्ट

  1. थाली से संस्कृति मीडिया निकालें और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10 मिलीलीटर इकट्ठा. शेष मीडिया त्यागें.
  2. 10 मिलीलीटर वरसाइन [या HbSS (सिग्मा)] के साथ कोशिकाओं को एक बार कुल्ला.
  3. प्लेट वरसाइन (या HbSS) में 5 मिलीलीटर 0.25% trypsin जोड़ें. कमरे के तापमान पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं थाली से अलग कर रहे हैं.
  4. 2.1 कदम से मीडिया के 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूब trypsinized सेल निलंबन जोड़ें </ Li>
  5. गोली कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 400 XG अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate, मीडिया के 0.5 मिलीग्राम से अधिक सेल गोली छोड़ने.
  6. एक पाश्चर विंदुक के साथ pipetting द्वारा कोशिकाओं को अच्छी तरह से Resuspend.
  7. Hypotonic समाधान के 3 बूँदें जोड़ें (.075 एम KCl (सिग्मा) 37 को गरम ° C); सेल निलंबन एक पाश्चर विंदुक के साथ मिश्रण. 0.5 मिलीलीटर hypotonic समाधान जोड़ें और फिर एक पाश्चर विंदुक के साथ मिश्रण. 5 मिलीग्राम hypotonic समाधान की मात्रा लाओ और एक बार फिर मिश्रण. 20-45 मिनट, कोशिका प्रकार पर निर्भर करता है के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  8. 10 मिनट के लिए 400 XG अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate, मीडिया के 0.5 मिलीग्राम से अधिक सेल गोली छोड़ने.
  9. धीरे ट्यूब flicking द्वारा सेल गोली Resuspend. osmotically सूजन कोशिकाओं को इस बिंदु पर कमजोर हो, तो देखभाल करने के लिए cytoplasmic झिल्ली को बाधित नहीं लिया जाना चाहिए.
  10. धीरे एक पाश्चर pipett के साथ pipetting द्वारा मिश्रण: Carnoy लगानेवाला (मेथनॉल 01:03 हिमनदों एसिटिक एसिड) की 3 बूँदें जोड़ेंई. धीरे एक पाश्चर विंदुक के साथ pipetting द्वारा 0.5 मिलीग्राम लगानेवाला और मिश्रण जोड़ें. लगानेवाला की मात्रा 5 मिलीग्राम लाओ और फिर धीरे से एक पाश्चर विंदुक के साथ pipetting मिश्रण. फिक्स्ड कोशिकाओं -20 डिग्री सेल्सियस में अंधेरे में कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
  11. अपकेंद्रित्र और 2.8 कदम में aspirate.
  12. ताजा लगानेवाला में सेल गोली Resuspend, गोली और ऐड ~ 10x Carnoy लगानेवाला की मात्रा की मात्रा का अनुमान है.
  13. सेल निलंबन गीला, ठंडा खुर्दबीन स्लाइड पर ड्रॉप - वार जोड़ें, एक ~ 45 डिग्री कोण पर स्लाइड पकड़ और सेल स्लाइड की सतह पर बहने निलंबन के लिए अनुमति देते हैं. कागज तौलिए पर फ्लैट स्लाइड और बाढ़ लगानेवाला के साथ स्लाइड निर्धारित करना और शुष्क हवा देते हैं. Mitotic एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर फैलता की उपस्थिति के लिए स्लाइड की जाँच करें.

3. RNase उपचार और इथेनॉल निर्जलीकरण

  1. जगह 10 ग्राम / 2x एसएससी में मिलीलीटर RNase (सिग्मा) प्रत्येक स्लाइड के लिए एक के 200 μl, 37 और डी में सेते1 घंटा के लिए सी, जी.
  2. धो 2x एसएससी, 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीएच 7.0 से 3 बार स्लाइड.
  3. कमरे के तापमान पर एक EtOH (सिग्मा) (70%, 90% और 100%) 3 मिनट के लिए प्रत्येक श्रृंखला के माध्यम से स्लाइड निर्जलीकरण.
  4. एयर कमरे के तापमान पर स्लाइड सूखी.

4. स्वस्थानी संकरण में बीएसी प्लस गुणसूत्र विशेष गुणसूत्रबिंदु गणन जांच (सीईपी) के लिए या पूरे क्रोमोजोम पेंट्स के लिए जांच कॉकटेल तैयार

  1. बीएसी / सीईपी एक साथ संकरण के लिए, पूर्व संकरण के लिए दो अलग - अलग जांच कॉकटेल तैयार. हमने पाया है कि बीएसी और सीईपी जांच कम पृष्ठभूमि और अधिक से अधिक संकेत तीव्रता में अलग stringencies परिणाम के तहत अलग से पूर्व hybridizing. हम यह भी पाया है कि व्यक्तिगत Fosmids भी बीएसी क्लोनों की जगह में इस्तेमाल किया जा सकता है. कॉकटेल नीचे वर्णित निर्माण एक एकल स्लाइड के लिए संस्करणों का प्रतिनिधित्व करता है. यदि एक से अधिक एक ही जांच का उपयोग स्लाइड्स प्रसंस्करण केवल संस्करणों appropr में वृद्धि iately.

    * बीएसी डीएनए जांच कॉकटेल:

    11.5 μl संकरण बफर (50% (सिग्मा) Formamide / 2x SSC / Dextran सल्फेट (सिग्मा)) 2 μl DH 2 हे

    DH 2 हे में 2.5 μl BAC/Cot1 डीएनए (प्रोटोकॉल लेबलिंग के लिए नीचे देखें) 15 μl कुल मात्रा

    * सीईपी जांच कॉकटेल:

    7 μl सीईपी संकरण (65% Formamide/2x सल्फेट SSC / Dextran) बफर 2 μl DH 2 हे

    1 μl CEP/Cot1 डीएनए (स्पेक्ट्रम Orange/Cy3/Texas लाल के साथ prelabeled खरीदा) 10 μl कुल मात्रा

    * Denaturing और पूर्व संकरण (5.1 कदम) सीईपी जांच के साथ 03:02 अनुपात 25 / μl स्लाइड और मिश्रण जांच कॉकटेल में मिश्रण बीएसी जांच के बाद.

    या

  2. 20 / μl पूरे क्रोमोजोम पेंट जांच (Cy3/Texas लाल) की एक ट्यूब में स्लाइड. अशेष भाजक विकृतीकरण और पूर्व संकरण कदम के लिए आगे बढ़ें.
"> 5 स्लाइड और जांच विकृतीकरण स्वस्थानी संकरण में

  1. 75 में denature जांच (ओं) कॉकटेल ° 10 मिनट के लिए सी. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पूर्व संकरण Cot1 डीएनए दोहराव दृश्यों को संकरण करने के लिए और बाद में संकरण को रोकने के लिए गुणसूत्रों मेटाफ़ेज़ की अनुमति.
  2. Coplin जार में 3 मिनट के लिए 70% Formamide/2x एसएससी, पर 72 पीएच 7.0 डिग्री सेल्सियस में denature स्लाइड.
  3. तुरंत एक EtOH Coplin जार में (70%, 90% और 100%) 4 ° सी श्रृंखला के माध्यम से 3 मिनट के लिए स्लाइड निर्जलीकरण.
  4. स्लाइड कमरे के तापमान पर शुष्क हवा करने की अनुमति दें.
  5. 45 स्लाइड्स पूर्व गर्म ° C जांच पूर्व hybridzation (5.1 कदम) के अंतिम 10 मिनट के लिए गर्म स्लाइड पर. पूर्व hybridized जांच कॉकटेल मिश्रण अगर जरूरत है और प्रत्येक स्लाइड 25 उल जोड़ने, धीरे और रबर सीमेंट के साथ सभी किनारों के साथ स्लाइड पर मुहर एक coverslip जगह. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक humidified कक्ष में सेते हैं.

  1. Coplin जार में 3 बार स्लाइड 50% formamide/2x एसएससी, पीएच 7.0 में 3 मिनट के लिए धो 38-40 डिग्री सेल्सियस पर. washes के तापमान जांच के बीच भिन्न हो सकते हैं. यदि उच्च पृष्ठभूमि संकरण है washes के तापमान में वृद्धि कर सकते हैं. इसके विपरीत, यदि संकेत बेहोश है और वहाँ कोई पृष्ठभूमि नहीं है तो आप इन washes के तापमान में कमी कर सकते हैं.
  2. धो कमरे के तापमान पर पी.एन. बफर में 1 बार स्लाइड 3 मिनट के लिए, और BrdU पता लगाने के कदम के लिए आगे बढ़ें.

7. BrdU डिटेक्शन

  1. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट (200 / μl स्लाइड) के लिए PNM बफर के साथ ब्लॉक स्लाइड.
  2. एक कागज तौलिया पर किनारे पर बदल स्लाइड नाली. 37 पर 30 मिनट के लिए PNM बफर में विरोधी BrdU FITC (50 ग्राम / एमएल Roche या Millipore) के 100 μl जोड़ें ° C.
  3. स्लाइड 3 मिनट के लिए प्रत्येक पी.एन. बफर में 3 बार कमरे के तापमान पर धो लें.
  4. नालीअतिरिक्त पी.एन. पर बफर किनारे पर एक कागज तौलिया पर मोड़ से एक समय में एक स्लाइड. 20 μl DAPI / antifade बढ़ते समाधान (Invitrogen) जोड़ें. एक कागज तौलिया के साथ स्लाइड कवर और coverslip पर नीचे प्रेस करने के लिए बाहर हवा बुलबुले और अधिक बढ़ते समाधान बल. छवि विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें.

8. छवियाँ कैप्चरिंग और BrdU निगमन बढ़ाता

  1. छवियाँ एक ओलिंप BX61 फ्लोरोसेंट खुर्दबीन और ओलिंप सीसीडी कैमरा, 100x उद्देश्य, स्वत: पहिया फिल्टर और Cytovision सॉफ्टवेयर (एप्लाइड इमेजिंग) के साथ कब्जा कर रहे हैं. BrdU एक FITC फिल्टर का उपयोग कर कब्जा कर लिया है, गुणसूत्र पेंट (टेक्सास लाल, Metasystems या Cytocell), बीएसी (Cy3) है और सीईपी जांच (Vysis स्पेक्ट्रम ऑरेंज) एक टेक्सास रेड या Cy3 फिल्टर का उपयोग कर कब्जा कर लिया कर रहे हैं, DAPI एक DAPI तक (देखें के साथ कब्जा कर लिया है 2 आंकड़े और 3).
  2. बीएसी / सीईपी या गुणसूत्र विशिष्ट रंग जांच (आंकड़े 2B और 3B) के साथ ब्याज की व्यक्तिगत गुणसूत्रों की पहचान कर रहे हैं. उपयोगCytovision सॉफ्टवेयर, ब्याज की प्रत्येक गुणसूत्र "कट आउट" एक पूरे के रूप में मेटाफ़ेज़ प्रसार से, एक लाइन के माध्यम से कम हाथ से लंबे हाथ (आंकड़े 2C और 3C) गुणसूत्र की लंबाई के साथ तैयार की है. Cytovision सॉफ्टवेयर प्रत्येक गुणसूत्र की लंबाई के साथ पिक्सेल तीव्रता प्रोफाइल यों के लिए प्रयोग किया जाता है. Cytovision सॉफ्टवेयर पिक्सल द्वारा कब्जा क्षेत्र की गणना और प्रत्येक अलग गुणसूत्र पर BrdU या DAPI संकेतों द्वारा प्रतिनिधित्व पिक्सल की तीव्रता quantifies. औसत पिक्सेल प्रत्येक गुणसूत्र द्वारा प्रतिनिधित्व तीव्रता तो पिक्सेल (1 टेबल और चित्रा 4) की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए उन पिक्सल द्वारा कब्जा क्षेत्र से गुणा किया जाता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल गुणसूत्रों की नवीनतम नकल क्षेत्रों के दृश्य के लिए अनुमति देता है. तदनुसार, BrdU समावेश की बंधी पैटर्न गुणसूत्रों की सक्रिय नकल क्षेत्रों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, और प्रतिकृति समय में chromos के बीच मतभेदome जोड़े इस बैंडिंग पैटर्न (2 आंकड़े और 3) में मतभेद के रूप में देखा जाता है. अंत में, बाध्यकारी पैटर्न में इन मतभेदों प्रत्येक 6,7 गुणसूत्र है, जो प्रतिकृति मुताबिक़ गुणसूत्र या गुणसूत्र 4 हथियार के बीच समय के अंतर का एक अनुमान के लिए अनुमति देता है के लिए जाना जाता है प्रतिकृति समय नक्शे तुलना की जा सकती है. उदाहरण के लिए, दो 6 गुणसूत्र चित्रा 3A> 2 घंटा की पैटर्न बैंडिंग जब 6 4 गुणसूत्र के सामान्य प्रतिकृति समय की तुलना में एक फर्क प्रदर्शित.
    इसके अलावा, यहाँ वर्णित एक एक इसी तरह की प्रक्रिया को सफलतापूर्वक किया गया है निष्क्रिय और सक्रिय एक्स गुणसूत्रों 8,9 के बीच अतुल्यकालिक प्रतिकृति समय के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है. सक्रिय और निष्क्रिय एक्स क्रोमोसोम एक्स गुणसूत्र पेंट का उपयोग पहचान की गई. छवियाँ चुटकी ली mFISH (Vysis) सॉफ्टवेयर और एक्स गुणसूत्रों के कब्जे पिक्सल की संख्या और fluorescently ला द्वारा कब्जा कर लिया पिक्सल की संख्या का उपयोग कर हासिल किया गयाbeled BrdU तो NIH छवि (का उपयोग कर की गणना की गई http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. निक फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए बीएसी डीएनए का अनुवाद (Vysis)

  1. निम्न जांच मिश्रण जोड़ें एक microfuge ट्यूब ठंडा:
    DH 2 हे में 70 μl (4 ग्राम डीएनए)
    10 μl मिमी .2 dUTP ऑरेंज या ग्रीन
    20 μl .1 मिमी dTTP
    20 μl 10x निक अनुवाद बफर
    40 μl NT dNTP (शून्य dTTP)
    40 μl निक अनुवाद एंजाइम
    200 μl कुल मात्रा
    16 @ सेते ° CO / एन 10 मिनट के लिए बंद करो प्रतिक्रिया हीटिंग द्वारा 70 डिग्री सेल्सियस. 5 मिनट के लिए बर्फ पर शांत रहो.
  2. जांच मिश्रण करने के लिए निम्नलिखित जोड़कर इथेनॉल के साथ डीएनए तलछट:
    200 μl जांच समाधान
    48 μl 3 एम NaOAc
    160 μl Cot1DNA (0.25 ग्राम / उल)
    1200 μl 100% EtOH
  3. -80 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ओ / एन स्टोर
  4. मैं स्पिनn 20 मिनट के लिए 12,000 XG पर ठंड. EtOH बंद पसाना. 70% EtOH साथ 1 बार से धो लें. पहले के रूप में स्पिन. EtOH बंद पसाना. एयर EtOH evaporates जब तक सूखी. 100 एनजी / बीएसी डीएनए की μl के अंतिम एकाग्रता के लिए 40 μl DH 2 हे में Resuspend.

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Representative Results

प्रतिकृति मानव गुणसूत्र 6 के लिए समय विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. युक्त कोशिकाओं का एक विलोपन ASAR6 4 जीन, 6q16.1 में स्थित BrdU 5 घंटे के लिए खुल गए थे, mitotic कोशिकाओं के लिए काटा और एक गुणसूत्र 6 रंग जांच (Vysis) के साथ मछली के लिए और BrdU शामिल करने के लिए कार्रवाई की. ध्यान दें कि वहाँ दो 6 के बीच BrdU बैंडिंग पैटर्न में एक महत्वपूर्ण अंतर है, जो एक गुणसूत्र 6 प्रतिकृति समय बैंडिंग 6 गुणसूत्र के पैटर्न के लिए [4 देखने के लिए> 2 घंटा की प्रतिकृति समय में देरी के साथ संगत करने से पहले ] विलोपन. इसके अलावा, वहाँ BrdU निगमन (पिक्सेल) की कुल राशि में एक महत्वपूर्ण अंतर जब DAPI धुंधला हो जाना का एक समान विश्लेषण (चित्रा 2 डी) की तुलना में है.

मानव गुणसूत्र 6 के लिए प्रतिकृति समय विश्लेषण का एक और उदाहरण चित्रा 3 में दिखाया गया है. सैम युक्त कोशिकाओंई जीन ASAR6 अगर 4 चित्रा 2 5 घंटे के लिए BrdU से अवगत कराया गया दिखाया गया है, mitotic कोशिकाओं के लिए काटा और एक गुणसूत्र 6 सीईपी जांच प्लस एक बीएसी ASAR6 जीन युक्त और BrdU शामिल करने के लिए मछली के लिए कार्रवाई की विलोपन. ध्यान दें कि नष्ट कर दिया 6 गुणसूत्र (Δ6) अधिक BrdU और गैर नष्ट कर दिया गुणसूत्र 6 से अधिक बढ़ाया BrdU निगमन के बैंडिंग पैटर्न समावेश प्रदर्शित करता है. 7 विभिन्न कोशिकाओं से mitotic फैलता चित्रा 3 में प्रोसेस किया गया और दोनों DAPI और BrdU के लिए पिक्सेल प्रोफाइल तालिका 1 में दिखाया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. BrdU टर्मिनल लेबल योजना. स्तनधारी कोशिकाओं में 8 से 10 घंटे के लिए पिछले और G2 एक ठेठ एस चरण आम तौर पर 2 से 5 घंटे है. BrdU में वृद्धि करने के लिए समय की अवधि (हरी तीर) को दोहराने के लिए गुणसूत्रों के अंतिम भाग लेबल के लिए जोड़ा गया है. गुस्तनधारी कोशिकाओं में ई क्रोमोसोम एक अस्थायी कार्यक्रम के अनुसार जल्दी और देर प्रतिकृति शुरुआत और एस चरण के अंत में क्रमशः (काला लाइन) में होने वाली के साथ पेश करता है. निष्क्रिय एक्स क्रोमोसोम प्रतिकृति समय में एस चरण (नीली रेखा) की दूसरी छमाही के दौरान होने वाली डीएनए संश्लेषण के बहुमत के साथ देरी कर रहे हैं. देरी प्रतिकृति समय के साथ क्रोमोसोम और डीएनए संश्लेषण की दीक्षा के पूरा होने में देरी कर रहे हैं, सक्रिय प्रतिकृति G2 (लाल रेखा) के माध्यम से जारी रखने के साथ. अतुल्यकालिक संस्कृतियों mitotic कोशिकाओं के लिए काटा जाता है और BrdU समावेश और मछली के लिए कार्रवाई की.

चित्रा 2
चित्रा 2 मानव गुणसूत्र 6 के अतुल्यकालिक प्रतिकृति. ASAR6 4 जीन के एक इंजीनियर विलोपन युक्त कोशिकाओं BrdU के साथ 5 घंटे के लिए इलाज किया गया, mitotic कोशिकाओं के लिए काटा और BrdU समावेश और मछली एक chrom का उपयोग के लिए कार्रवाई जांच के रूप में osome 6 रंग. डीएनए DAPI (नीला) के साथ सना हुआ था. ए) एक mitotic प्रसार युक्त एक ठेठ BrdU निगमन (हरा) "बंधी" पैटर्न दिखाया गया है. गुणसूत्र 6 रंग जांच दो गुणसूत्र 6 इस सेल में (लाल) संकरित. बी) दो गुणसूत्र 6 (मैं और द्वितीय) "बाहर कट" किया गया और तीन अलग छवियों में फ्लोरोसेंट अलग लेबल के साथ प्रदर्शित. सी) गुणसूत्र 6 दोनों (नीला) DAPI और BrdU (हरा) दिखाए जाते हैं के लिए Cytovision सॉफ्टवेयर और संकेत तीव्रता प्रोफाइल का उपयोग विश्लेषण किया गया. लाल लाइन का इस्तेमाल किया पथ को इंगित करता है, कम हाथ (पी) से दोनों BrdU और DAPI की मात्रा का ठहराव के लिए लंबी बांह (क्यू),. दूरी कम हाथ (पी) से पिक्सल में लंबे हाथ (क्यू) के लिए प्रत्येक गुणसूत्र की लंबाई को संदर्भित करता है. डी दोनों DAPI और BrdU प्रतिदीप्ति के लिए कुल संकेत की मात्रा). कुल मूल्यों औसत पिक्सेल उन पिक्सल द्वारा प्रतिनिधित्व क्षेत्र से गुणा तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं.

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चित्रा 3. मानव गुणसूत्र 6 युक्त ASAR6 के विलोपन की प्रतिकृति विलंबित. 4 जीन ASAR6 के एक इंजीनियर विलोपन युक्त कोशिकाओं BrdU साथ 5 घंटे के लिए इलाज किया गया, mitotic कोशिकाओं के लिए काटा और BrdU समावेश और मछली एक गुणसूत्र 6 सीईपी प्लस एक जांच के रूप ASAR6 जीन युक्त बीएसी का उपयोग करने के लिए कार्रवाई की. डीएनए DAPI (नीला) के साथ सना हुआ था. ए) एक mitotic प्रसार युक्त एक ठेठ BrdU निगमन (हरा) "बंधी" पैटर्न दिखाया गया है. गुणसूत्र 6 सीईपी जांच दो गुणसूत्र 6 (बड़े लाल centromeric संकेत) संकरित, और बीएसी इस कक्ष में एक 6 गुणसूत्र (लंबे हाथ पर छोटे लाल सिग्नल) संकरित. नोट दो 6 के बीच BrdU बैंडिंग पैटर्न में अंतर है. बी) नष्ट कर दिया गुणसूत्र 6 Δ6 और 6 गैर नष्ट कर दिया 6 द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. दो 6 "बाहर कट" किया गया और तीन अलग छवियों में फ्लोरोसेंट अलग लेबल के साथ प्रदर्शित. सी) टीवह 6 गुणसूत्र दोनों (नीला) DAPI और BrdU (हरा) दिखाए जाते हैं के लिए Cytovision सॉफ्टवेयर और संकेत तीव्रता प्रोफाइल का उपयोग विश्लेषण किया गया. लाल लाइन का इस्तेमाल किया पथ को इंगित करता है, कम हाथ (पी) से दोनों BrdU और DAPI की मात्रा का ठहराव के लिए लंबी बांह (क्यू),. दूरी कम हाथ (पी) से पिक्सल में लंबे हाथ (क्यू) के लिए प्रत्येक गुणसूत्र की लंबाई को संदर्भित करता है. डी दोनों DAPI और BrdU प्रतिदीप्ति के लिए कुल संकेत की मात्रा). कुल मूल्यों औसत पिक्सेल उन पिक्सल द्वारा प्रतिनिधित्व क्षेत्र से गुणा तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4 प्रतिकृति गुणसूत्र 6 के बीच समय के अंतर की मात्रा. ASAR6 जीन 4 के एक इंजीनियर विलोपन युक्त कोशिकाओं BrdU के साथ 5 घंटे के लिए इलाज किया गया, mitotic कोशिकाओं के लिए काटा और BrdU समावेश और मछली एक गुणसूत्र 6 सीईपी जांच प्लस एक का उपयोग करने के लिए कार्रवाई कीबीएसी जांच के रूप ASAR6 जीन युक्त. Mitotic फैलता चित्रा 3 में प्रोसेस किया गया और 7 विभिन्न कक्षों के लिए मान (1 टेबल देखें) दिखाए जाते हैं. ए) DAPI धुंधला हो जाना और मात्रा निर्धारित किया गया था पिक्सल की कुल संख्या प्रत्येक कक्ष के लिए प्रदर्शित किया जाता है. ध्यान दें कि एक ही कोशिका के भीतर क्रोमोसोम के बीच केवल ~ 10-20% अंतर है. बी) BrdU समावेश पैनल के ऊपर बी के रूप में एक ही गुणसूत्रों से मात्रा निर्धारित किया गया था. ध्यान दें कि वहाँ> 2 नष्ट कर दिया और गैर नष्ट कर दिया गुणसूत्र 6 के लिए कुल पिक्सेल मूल्यों के बीच गुना अंतर है.

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Discussion

गुणसूत्र फैलता की तैयारी यहाँ वर्णित सफल परख प्रतिकृति - समय के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. एक colcemid pretreatment कदम का समावेश hypotonic उपचार से पहले आवृत्ति में और mitotic कोशिकाओं के प्रसार में सहायता कर सकते हैं. हम आम तौर पर 1-3 घंटे के लिए फसल के लिए पहले colcemdi कोशिकाओं को उजागर और उपयोग 10 स्नातकीय / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में colcemid. हालांकि, एक colcemid pretreatment कदम का समावेश G2 की लंबाई में परिवर्तन और फलस्वरूप स्पष्ट प्रतिकृति और तीन गुणसूत्रों के संघनन के समय राज्य को बदल सकता है हो सकता है.

इस प्रक्रिया BrdU ऊष्मायन की लंबाई, जो कोशिका चक्र अवधि पर निर्भर करता है अलग से कई अलग अलग सेल प्रकार और प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है. सबसे मानव और माउस सेल लाइनों के लिए, G2 चरण आम तौर पर 3-6 घंटे है, इसलिए, BrdU उपचार इस श्रेणी में आम तौर पर कर रहे हैं. BrdU के लिए एक वैकल्पिक (edu) 5 - ethynyl 2'deoxyuridine और उसके बाद का उपयोग कर पता लगानेएक फ्लोरोसेंट azide और "रसायन शास्त्र क्लिक" प्रतिक्रिया 10. Edu पता लगाने की योजना BrdU पता लगाने योजना पर कई फायदे हैं. उदाहरण के लिए, edu का पता लगाने के नमूना निर्धारण या डीएनए विकृतीकरण आवश्यकता नहीं है. इस प्रकार, गधे प्रतिकृति समय edu उपयोग मछली के बजाय सरल तकनीक जी बैंडिंग लिए ब्याज की गुणसूत्रों की पहचान के साथ जोड़ा जा सकता है.

प्रतिकृति समय प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित परख एस देर चरण के अलावा किसी भी डीएनए G2 में विस्तार संश्लेषण के लिए विशेष रूप से बनाया गया है. इसके अलावा, डीएनए प्रतिकृति BrdU से कम (15-30 मिनट) 6-10 घंटे की अपेक्षाकृत लंबी पीछा अवधि के बाद दालों का उपयोग करके इस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए चरण के दौरान नजर रखी जा सकता है. इस दोनों जल्दी और एस चरण बीच में BrdU समावेश के दृश्य के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, कुछ ट्यूमर व्युत्पन्न गुणसूत्र rearrangements 3 गुणसूत्रों की पूरी लंबाई के साथ दोनों और डीएनए संश्लेषण की दीक्षा पूरा में देरी कर रहे हैं

इस प्रतिकृति समय की प्रक्रिया का एक फायदा यह है कि यह व्यक्ति की कोशिकाओं में assays प्रतिकृति समय है. इसलिए, यह के मुताबिक़ एक ही कोशिका के भीतर निहित गुणसूत्रों के बीच प्रतिकृति समय में अंतर का पता लगाने की क्षमता है. जबकि वहाँ अन्य प्रक्रियाओं कर रहे हैं, जैसे. स्वस्थानी संकरण में नकल समय (ReTiSH, 11), कि प्रतिकृति समय में मुताबिक़ क्रोमोसोम पर विशिष्ट loci में alleles के बीच मतभेदों का पता लगाने की क्षमता है, यहाँ वर्णित प्रक्रिया प्रतिकृति गुणसूत्रों की पूरी लंबाई के साथ समय में अंतर का पता लगा सकते हैं. इसके अतिरिक्त, इस प्रक्रिया कि केवल एक 3 आबादी की कोशिकाओं के एक अंश में मौजूद हैं गुणसूत्रों की प्रतिकृति समय में मतभेद परख कर सकते हैं. उदाहरण के लिए कई कैंसर कोशिका लाइनों और प्राथमिक ट्यूमर के नमूनों गुणसूत्र rearrangements कि कोशिकाओं के कम से कम 50% में मौजूद होते हैं. वर्तमान में हम परख गुणसूत्रों के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग कर रहे हैंप्राथमिक ट्यूमर के नमूनों में, और कई नमूने में गुणसूत्रों के बीच अतुल्यकालिक प्रतिकृति का पता लगाने में सक्षम किया गया है. हालांकि दिया, कि प्राथमिक ट्यूमर के नमूनों mitotic आंकड़े के एक सीमित संख्या है, प्राथमिक संस्कृतियों के बारे में एक तिहाई mitotic फैलता की पर्याप्त संख्या देने में असफल रहा.

एक और लाभ यह है कि इस प्रक्रिया माइक्रोएरे या आधारित assays अनुक्रमण है है कि व्यक्तिगत गुणसूत्रों कोशिकाओं के पूल से immunoprecipitated डीएनए बजाय हैं assayed. Immunoprecipitation आधारित assays में बहुरूपताओं और की पहचान किया जाना चाहिए क्रम में विशिष्ट alleles से जुड़े alleles के बीच प्रतिकृति समय भेद.

इसके अलावा, मान्यता है कि कई कैंसर की कोशिकाओं के कई गुणसूत्र rearrangements 12, और अवलोकन है कि डीएनए प्रतिकृति तनाव 13 कैंसर कोशिकाओं में जीनोमिक अस्थिरता के साथ जुड़ा हुआ है, हम मानते हैं कि इस प्रोटोकॉल एक उपयोगी और सरल उपकरण चया कैंसर की कोशिकाओं में गुणसूत्रों की प्रतिकृति समय की दिनचर्या विश्लेषण.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, CA131967 से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 μg/μl
Nick Translation Kit Abbott Molecular (Vysis) 07J00-0001
Spectrum Orange dUTP Abbott Molecular (Vysis) 02N33-050
CEP Abbott Molecular (Vysis) Varies
LSI/WCP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 06J67-011
CEP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 07J36-001
Chromosome paints MetaSystems Group D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluorescent Microscope Olympus BX61TRF-1-5
Microscope imaging software system Applied Imaging Cytovision 3.93.1
Digital Camera Olympus UCMAD3

IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES
Formamide Solutions
70% Formamide/2x SSC

35 ml Formamide* (Sigma)
10 ml 10x SSC
5 ml d2H20
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

* It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low.

50% Formamide/2x SSC

25 ml formamide (Sigma)
10 ml 10x SSC
15 ml dH2O
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

20x SSC, 4 L

702 g NaCl (Sigma)
358 g Na Citrate (Sigma)
dH2O to volume

PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)]

Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots).

0.1 M NaH2P04 , 1 L

13.8 g NaH2P04 (Sigma):
dH2O to volume

0.1 M NaH2P04 1 L

14.2 g NaH2P04 (Sigma)
dH2O to volume.

PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40.

PNM 50 ml

1.25 g Non-fat dry milk (Sigma)
25 ml PN buffer (Recipe above)

Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.

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References

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Smith, L., Thayer, M. Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (70), e4400, doi:10.3791/4400 (2012).

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