Summary
Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi kullanır
Abstract
Memeli DNA replikasyonu zamansal bir çoğaltma programı sonrasında, S fazında farklı zamanlarda kromozomlar boyunca birçok bölgeden başlatır. Çoğaltma zamanlaması özellikleri epigenetik değişikliklere duyarlı doku-spesifik ve gelişimsel ipuçları tarafından düzenlenen dinamik bir süreç olduğu düşünülmektedir. Ancak, nerede ve DNA replikasyonu kromozomlar boyunca başlattığında düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Homolog kromozomlar genellikle ancak bu kuralın önemli istisnalar vardır, eşzamanlı çoğaltırlar. Örneğin, dişi memeli hücrelerinde iki X kromozomu X inaktivasyonu 1 olarak bilinen bir süreç yoluyla geç kopyalayan olur. 2-3 saat olarak tahmin çoğaltma zamanlaması, bu gecikme ile birlikte, genlerin çoğunluğu transkripsiyonel bir X kromozomu üzerinde susturdu olur. Buna ek olarak, X inaktivasyonu merkezi olarak bilinen bir ayrık cis-hareket eden odağı, th dahil olmak üzere, bu X inaktivasyonu işlem düzenlertüm inaktif X kromozomu üzerinde gecikmiş çoğaltma zamanlaması e indüksiyonu. Buna ek olarak, kanser hücreleri ve hücreler bulunan bazı kromozom tüm kromozom 2,3 etkilemektedir> 3 saat bunun çoğaltma zamanlaması önemli bir gecikme görüntülemek iyonizan radyasyona maruz. Bizim laboratuvar son çalışmaları ayrık olduğunu bozulması cis-oyunculuk tüm kromozom 4 etkileyen bir çok geç kopyalayan fenotipe otozomal lokus sonucu gösterir. Ek 'kromozom mühendislik' çalışmaları tüm memeli kromozomları bireyin kromozom Uygun çoğaltma zamanlaması 5 kontrol ayrık cis-etkili lokus içeren düşündüren, bu anormal çoğaltma zamanlaması fenotipe birçok farklı kromozom sonucu etkileyen bazı kromozom göstermektedir.
Burada, floresan in situ hibridizasyon ile kombine kromozom çoğaltma zamanlaması kantitatif analizi için bir yöntem mevcut. Buyöntem, aynı hücre içinde Homolog kromozomlar arasındaki çoğaltma zamanlaması doğrudan bir karşılaştırma sağlar, ve 6 uyarlanmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem tam kromozom replikasyonu zamanlama etkileyen değişiklikler ile ilişkili kromozomal düzenlenmesinde çok kesin tanımlanması için olanak sağlar. Bu yöntem son yıllarda geliştirilen yüksek kapasiteli mikro-dizi üzerinde veya yeniden düzenlenmiş ve kromozomlar un düzenlenmeyecek üzerinde sunmaktan homolog allelleri arasındaki farkı ayırt edemez protokolleri sıralama avantajları vardır. Burada açıklanan yöntem tek hücreler değerlendirir Buna ek olarak, bu bir nüfus içinde hücrelerin sadece küçük bir bölümü içinde mevcut olan kromozom üzerinde çevrilme kromozom replikasyonu zamanlama değişiklikleri tespit eder.
Protocol
1. BrdU Ortaklığın (Terminal Etiketleme)
- Önceki BrdU ilavesi ile 150 mm doku kültürü çanağı 24 saat içinde yaklaşık% 70 birleştiği yere Plaka hücreleri.
- Hasattan önce uygun zaman noktalarında 20 ug / ml BrdU (Sigma) içeren tam kültür ortamı, taze ortam ile değiştirin. Zaman hücrelerin BrdU uzunluğu tipik olarak G2 fazında saat (Şekil 1) 2 ile 5 arasında sürer, hücre tipi ve türler ile değişecektir ile ortam içinde kültürlenmiştir.
2. Monolayer Hücre Kültürleri Kromozom Hasat
- Plaka kültür ortamı çıkarın ve 15 ml konik santrifüj tüpüne 10 ml toplamak. Kalan ortamı atın.
- 10 ml Versine [veya HBSS (Sigma)] ile bir kez yıkayın hücrelerini.
- Plakasına Versine (ya da HBSS) içinde 5 ml% 0.25 tripsin ekleyin. Hücreler plaka ayrılmış kadar oda sıcaklığında inkübe edin.
- Adım 2.1, ortam 10 ml'lik tüp tripsinize hücre süspansiyonu ekleyin. </ Li>
- Pelet hücreler 10 dakika için 400 x g'da santrifüj yapılır. 0.5 ml ortam artı hücre peleti bırakarak, süpernatan aspire.
- Pasteur pipeti ile pipetleme tarafından iyice hücreler süspanse edin.
- Hipotonik çözelti 3 damla ekleme (0.075 M KCl (Sigma), 37 ° C'a ısıtılmış); bir Pasteur pipeti ile hücre süspansiyonu ilave edilir. 0.5 ml hipotonik solüsyonu eklenir ve bir Pasteur pipeti ile tekrar karıştırın. 5 ml hipotonik çözeltinin hacmi getirin ve tekrar karıştırın. Hücre tipine bağlı olarak 20-45 dakika, 37 ° C'de inkübe edin.
- 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. 0.5 ml ortam artı hücre peleti bırakarak, süpernatan aspire.
- Tüpü yavaşça getirerek hücre pelet yeniden süspanse edin. Ozmotik şişmiş hücreleri bu noktada kırılgan olacak, bu nedenle bakım sitoplazmik membran bozmayacak şekilde alınmalıdır.
- Hafifçe Pasteur pipett ile pipetleme karışımı;: Carnoy en fiksatif (Metanol 01:03 Buzul Asetik Asit) 3 damla ekleyine. Yavaşça Pasteur pipeti ile pipetleme 0.5 ml fiksatif ekleyin ve karıştırın. Sabitleştirici hacmi 5 ml getirin ve yavaşça Pasteur pipeti ile pipetleme tarafından tekrar karıştırınız. Sabit hücreleri birkaç ay boyunca -20 ° C'de karanlıkta saklanabilir.
- Santrifüj ve adım 2.8 olarak aspire.
- Taze fiksatif içinde hücre pelletini tekrar; pelet ve eklenti ~ 10x Carnoy en fiksatif hacminin hacminin hesaplanabilmesi.
- Hücre süspansiyonu ıslak, buz mikroskop lamı üzerine açılan akıllıca ekleyin; bir ~ 45 ° açıyla tutun ve slayt slayt yüzeyi üzerinde akmaya hücre süspansiyonu sağlar. Kağıt havlu üzerinde düz kaydırak ve sel fiksatif ile slayt Lay ve kurumaya bırakın. Ters bir mikroskop kullanılarak mitotik yayılır varlığı için slaytlar edin.
3. RNase Tedavisi ve Etanol Dehidrasyon
- 10 mikrogram / her slayt için 2x SSC ml RNaz A (Sigma) Yeri 200 ul; 37 & de inkübeg; C, 1 saat boyunca.
- Yıkama 2x SSC, 3 dakika her biri için, oda sıcaklığında, pH 7.0 ile 3 kez kayar.
- 3 dakika her biri için ve oda sıcaklığında bir EtOH (Sigma) serisi (% 70,% 90 ve% 100) slaytlar kurutmak.
- Hava oda sıcaklığında slaytları kurulayın.
4. In situ Hibridizasyon BAC Artı Kromozom-spesifik Sentromer Numaralama Sondası (CEP) veya Tüm Kromozom Boyalar için prob Kokteyller hazırlanması
- BAC / CEP eşzamanlı hibridizasyon için, ön-hibridizasyon için iki ayrı probu kokteyller hazırlamak. Bu daha az ve daha büyük bir arka plan sinyal yoğunlukları farklı sıkıntıları sonuçlar altında ayrı ayrı BAC ve CEP problar ön-melezleştirici olduğunu bulduk. Ayrıca bireysel Fosmids BAC klonları yerine de kullanılabilir olduğunu bulduk. Aşağıda açıklanan kokteyl formülasyon için tek bir slayt birimleri temsil etmektedir. Aynı problar kullanılarak birden çok slayt işleme, basitçe hacimleri appropr artırmak Vakit.
* BAC DNA prob kokteyli:
11.5 ul hibridizasyon tamponu (% 50 Formamid (Sigma) / 2 x SSC / dekstran sülfat (Sigma)) 2 ul dH 2 O
DH 2 O 2.5 ul BAC/Cot1 DNA (protokol etiketleme için aşağıya bakınız) 15 ul toplam hacmi
* CEP prob kokteyli:
7 ul CEP hibridizasyon tamponu (% 65 Formamide/2x SSC / Dekstran Sülfat) 2 ul dH 2 O
1 ul CEP/Cot1 DNA (Spektrum Orange/Cy3/Texas Kırmızı ile prelabeled satın) 10 ul toplam hacmi
* 3:2 oranı 25 ul / slayt ve mix prob kokteyller CEP prob ile karıştırın BAC prob denatüre ve ön hibridizasyon (adım 5.1) sonra.
VEYA
- Tablet 20 ul / tüp içerisine Tüm Kromozom Boya prob (Cy3/Texas Kırmızı) arasında slayt. Denatürasyon ve ön hibridizasyon adıma geçin.
- 75 doğasını sonda kokteyl (ler) ° C de 10 dakika. Cot1 tekrarlayan DNA sekansları ile melezleşme ve kromozomların metafaz takiben melezleştirme önlemek için izin vermek için 30 dakika boyunca 37 ° C'de ön-melezleşir.
- 3 dakika boyunca 72% 70 Formamide/2x SSC, pH 7.0 ° C Coplin kavanoz içinde denatüre kayar.
- Hemen 3 dakika her biri için 4 de Coplin kavanozlara bir EtOH serisi (% 70,% 90 ve% 100) ° C slaytlar kurutmak.
- Slaytları oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- 45 Pre-sıcak slaytlar ° C probu ön hybridzation (adım 5.1) son 10 dakika süreyle sıcak slayt üzerinde. Gerekirse ön melezleştirilmiş prob kokteyl karıştırın ve her slayt için 25 ul ekleyin; hafifçe kauçuk çimento ile tüm kenarları boyunca her slayt ve mühür üzerine bir lamel yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edin.
- 3 dk için her 38-40 ° C 'de en az% 50 formamide/2x SSC, pH 7.0 içinde 3 kez Coplin kavanoz içinde slaytlar yıkayın. Yıkama sıcaklık probları arasında değişebilir. Yüksek arkaplan hibridizasyon varsa size yıkama sıcaklığını artırabilir. Sinyal soluk ve hiçbir arka plan varsa Tersine, o zaman bu yıkama sıcaklığını düşürebilir.
- Yıkama oda sıcaklığında PN tampon içinde 1 saat slaytlar 3 dakika ve BrdU algılama adıma geçin.
7. BrdU Algılama
- Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika (200 ul / dia) için PNM tampon ile blok kayar.
- Bir kağıt havlu üzerine kenarında açarak slaytlar boşaltın. 37 30 dakika için PNM tampon içinde anti-BrdU-FITC (50 ug / ml Roche veya Millipore) 100 ul ekle ° C.
- 3 dakika her biri için oda sıcaklığında PN tampon slaytlar 3 kez yıka.
- Boşaltmaküzerine aşırı PN tampon bir kağıt havlu üzerine kenarında açarak birer birer kayar. 20 ul DAPI / antifade montaj çözüm (Invitrogen) ekleyin. Bir kağıt havlu ile slayt örtün ve hava kabarcıklarını ve fazla montaj çözümü zorlamak için lamel üzerine bastırın. Görüntü analizi ile devam edin.
8. Görüntü yakalama ve BrdU Ortaklığın nicel
- Görüntüleri Olympus BX61 Floresan Mikroskop ve Olympus CCD Kamera, 100x objektif, otomatik filtre tekerleği ve Cytovision yazılım (Uygulamalı Imaging) ile yakalanır. BrdU bir FITC filtresi kullanılarak yakalanır; kromozom boyalar (Texas Red, Metasystems veya Cytocell), BAC nin (Cy3) ve CEP (Vysis Spektrum Turuncu) probları Texas Red veya Cy3 filtre kullanarak yakalanır; DAPI bir DAPI Filtresi (bkz. yakalanır Şekiller 2 ve 3).
- Ilgi Bireysel kromozomları BAC / CEP veya kromozom özel boya problar (Şekil 2B ve 3B) ile tanımlanır. KullanılmasıCytovision yazılım, ilgi her kromozom bir bütün olarak metafaz yayılım "cut-out", bir çizgi uzun kol (Şekil 2C ve 3C) kısa kolundan kromozom uzunluğu boyunca çekilir. Cytovision yazılım her bir kromozom uzunluğu boyunca piksel yoğunluk profili ölçmek için kullanılır. Cytovision yazılım piksel tarafından işgal edilen alan hesaplar ve her bir izole kromozom üzerinde BrdU ya da DAPI sinyalleri tarafından temsil edilen piksel şiddeti miktarını belirler. Her bir kromozom tarafından temsil edilen ortalama piksel şiddeti sonra, piksel (Tablo 1 ve Şekil 4) toplam sayısını elde etmek için bu piksel işgal ettiği alan ile çarpılır. Buna ek olarak, bu protokol kromozom son kopyalayan bölgelerin görüntülenmesi için olanak sağlar. Buna göre, BrdU şirketleşme bantlı deseni kromozomların aktif kopyalayan bölgelerin tespiti için izin verir ve Chromos arasında çoğaltma zamanlama farklılıklarıome çiftleri bu bantlama modeli (Şekil 2 ve 3) farklılıklar olduğu görülmektedir. Son olarak, bağlayıcı desenler bu farklılıklar homolog kromozomlar veya kromozom kollarının 4 arasındaki çoğaltma zamanlama farkı bir tahmini için izin veren her kromozom 6,7, bilinen çoğaltma zamanlaması haritalar mukayese edilebilir. Örneğin, iki kromozom 6 3A kromozom 6 4 normal çoğaltma zamanlama kıyasla> 2 saat arasında model bantlama bir fark görüntü Şekil var.
Buna ek olarak, burada tarif edilen bir benzer bir prosedür başarılı bir şekilde inaktif ve aktif X kromozomuna 8,9 arasında uyumsuz çoğaltma zamanlama incelenmesi için kullanılmıştır. Aktif ve inaktif X kromozomu X kromozomundan boyalar kullanılarak tespit edilmiştir. Görüntü Quips mFISH yazılımı (Vysis) ve X kromozomuna tarafından işgal edilen piksel sayısı ve floresan la tarafından işgal edilen piksel sayısı kullanılarak elde edildiBeled BrdU sonra NIH Image (hesaplanmıştır http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).
9. Floresan Etiketleme için BAC DNA Nick yaptı (Vysis)
- Bir mikrofuge'de tüp soğutulmuş için aşağıdaki prob karışımı ekleyin:
DH 2 O 70 ul (4 mg DNA)
10 ul .2 mM dUTP-Turuncu veya Yeşil
20 ul .1 mM dTTP
20 ul 10x Nick yaptı Tampon
40 ul NT dNTP nin (eksi dTTP)
40 ul nick yaptı enzim
200 ul toplam hacim
@ 16 inkübe ° CO / N. 10 dk için 70 ısıtma ile reaksiyon ° C durdurun. 5 dakika buz üzerinde soğutun. - Sonda karışımı aşağıdaki ekleyerek etanol ile DNA çökelti:
200 ul prob çözümü
48 ul 3 M NaOAc
160 ul Cot1DNA (.25 mg / ul)
1.200 ul% 100 EtOH - O / N 10 dk için -80 ° C'de saklayın
- I Spinn 20 dakika boyunca 12.000 xg'de soğuk. EtOH kapalı Durusu. % 70 EtOH ile 1 kez yıkayın. Daha önce olduğu gibi döndürün. EtOH kapalı Durusu. Hava sadece EtOH cekene kadar kurutun. 100 ng / BAC DNA ul'lik nihai konsantrasyon için 40 ul dH 2 O de yeniden süspanse edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insan kromozom 6 için çoğaltma zamanlama analizinin bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. 6q16.1 bulunan ASAR6 gen 4, bir silme içeren hücreler, 5 saat boyunca BrdU maruz mitotik hücre için hasat edilmiş ve bir kromozom 6 boya probu (Vysis) ile FISH ve BrdU eklenmesi için işleme tabi tutulmuştur. İki 6'ın arasındaki BrdU bantlama modeli önemli bir fark olduğunu unutmayın, hangi öncesinde kromozom 6'nın [bkz 4 6. kromozomun desen bantlama çoğaltma zamanlaması için biri için> 2 saat çoğaltma zamanlaması bir gecikme ile tutarlı Silme]. Buna ek olarak, DAPI boyama benzer bir analizi (Şekil 2D) ile karşılaştırıldığında BrdU eklenmesi (piksel) toplam miktarının önemli bir farklılık vardır.
Insan kromozom 6 için çoğaltma zaman analizi bir başka örneği Şekil 3'te gösterilmektedir. Sam içeren hücreler4, Şekil 2'nin 5 saat için BrdU maruz bırakıldı eğer mitotik hücre hasat için, gösterilen ve bir kromozom 6 CEP sonda ayrıca ASAR6 geni içeren bir BAC ve BrdU eklenmesi için FISH için işlenmiş gen ASAR6 e silinmesi. Silinen kromozom 6 (Δ6) olmayan silinmiş 6. kromozomun fazla BrdU dahil edilmesi ve BrdU şirketleşme daha uzun bir bant deseni görüntülediğini unutmayın. 7 farklı hücreler mitotik yayılır Şekil 3 'de olduğu gibi işlendi ve DAPI ve BrdU her ikisi için piksel profilleri Tablo 1' de gösterilmiştir.
Şekil 1. BrdU terminali etiket planı. 8 ila 10 saat boyunca geçen ve G2, memeli hücrelerinde tipik S fazına tipik olarak 2-5 saat. BrdU çoğaltmak için, kromozomların son bölümlerini etiketlemek için sürelerde (yeşil oklar) artırmak için eklenir. ThMemeli hücrelerinde e kromozomlar erken ve geç çoğaltma sırasıyla S fazının başlangıcı ve sonu (siyah çizgi) de meydana gelen, geçici bir programa göre çoğaltabilirsiniz. İnaktif X kromozomu S fazı (mavi çizgi) ve ikinci yarısında meydana gelen DNA sentezi çoğunluğu ile çoğaltma zamanlaması geciktirilir. Gecikmiş çoğaltma zamanlaması ile Kromozomlar etkin çoğaltma G2 (kırmızı çizgi) ile devam ile, DNA sentezinin başlatılması ve tamamlanması hem de gecikiyor. Asenkron kültürler mitotik hücreler için hasat ve BrdU Kuruluş ve FISH için işlenir.
Şekil 2. İnsanın kromozom 6. Uyumsuz çoğaltma. ASAR6 gen 4 arasında bir mühendislik silme içeren hücreler, 5 saat boyunca BrdU ile tedavi edilen hücreler mitotik için hasat edilmiş ve bir krom kullanılarak BrdU eklenmesi ve balık için işleme tabi tutuldu prob olarak osome 6 boya. DNA DAPI (mavi) ile boyandı. A) BrdU dahil (yeşil) tipik bir "bantlı" desen içeren bir mitotik yayılması gösterilir. 6. kromozomun boya prob iki kromozom 6'nın (kırmızı) Bu hücre için melez. B) iki kromozom 6'nın (i ve ii) "kesip" ve belirgin görüntüleri ayrılmış üç floresan etiketleri ile sergilendi. C) 6. kromozomun en DAPI (mavi) ve BrdU (yeşil) gösterilir hem Cytovision yazılım ve sinyal yoğunluğu profilleri kullanılarak analiz edildi. Kırmızı çizgi kısa kolunda (p) gelen BrdU ve DAPI hem ölçümü için uzun kol (q) için kullanılan yolu gösterir. Mesafe kısa kol (p) gelen pikseller olarak uzun kol (q) her bir kromozom uzunluğunu ifade eder. D DAPI ve BrdU floresan hem toplam sinyal) Sayısallaştırma. Toplam değerleri bu pikselleri temsil alanı ile çarpılır ve ortalama piksel yoğunluğunu temsil eder.
ŞEKIL 3 "src =" / files/ftp_upload/4400/4400fig3.jpg "/>
Şekil 3. ASAR6 bir silinmesini içeren insan 6. kromozomun çoğaltma Gecikmeli. ASAR6 gen 4 bir mühendislik silinmesini içeren hücreler mitotik hücreler için hasat ve kromozom 6 CEP artı probları olarak ASAR6 geni içeren bir BAC kullanarak BrdU Kuruluş ve FISH için işlenmiş, 5 saat BrdU ile tedavi edildi. DNA DAPI (mavi) ile boyandı. A) BrdU dahil (yeşil) tipik bir "bantlı" desen içeren bir mitotik yayılması gösterilir. Kromozom 6 CEP prob iki kromozom 6'nın (büyük kırmızı sentromerik sinyali) melezi ve BAC bu hücrede tek bir kromozom 6 (uzun kolunda küçük kırmızı sinyali) melezi. İki 6'ın arasındaki BrdU bantlama desen farkı unutmayın. B) silinmiş kromozom 6 6 ile Δ6 ve non-silinmiş 6 ile temsil edilir. İki 6'ın "kesip" ve belirgin görüntüleri ayrılmış üç floresan etiketleri ile sergilendi. C) To kromozom 6'nın DAPI (mavi) ve BrdU (yeşil) gösterilir hem Cytovision yazılım ve sinyal yoğunluğu profilleri kullanılarak analiz edildi. Kırmızı çizgi kısa kolunda (p) gelen BrdU ve DAPI hem ölçümü için uzun kol (q) için kullanılan yolu gösterir. Mesafe kısa kol (p) gelen pikseller olarak uzun kol (q) her bir kromozom uzunluğunu ifade eder. D DAPI ve BrdU floresan hem toplam sinyal) Sayısallaştırma. Toplam değerleri bu pikselleri temsil alanı ile çarpılır ve ortalama piksel yoğunluğunu temsil eder.
Şekil 4. Kromozom 6'nın arasındaki çoğaltma zamanlama farkı kantifikasyonu. ASAR6 gen 4 bir mühendislik silinmesini içeren hücreler, 5 saat BrdU ile tedavi mitotik hücreler için hasat ve kromozom 6 CEP prob artı kullanarak BrdU kuruluş ve FISH için işlendiBAC prob olarak ASAR6 geni içeren. Mitotik yayılır Şekil 3 'de olduğu gibi işleme tabi tutulmuştur ve 7 farklı hücreler için değerler (bkz. Tablo 1) gösterilmiştir. A) DAPI boyama ölçüldü ve toplam piksel sayısı, her bir hücre için gösterilir. Aynı hücre içinde kromozom arasında sadece ~% 10-20 fark olduğunu unutmayın. B) BrdU eklenmesi yukarıda panel B ile aynı kromozom itibaren ölçülmüştür. Silinmiş ve silinmemiş 6. kromozomun en için toplam piksel değerleri arasındaki> 2 kat fark olduğunu unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kromozom yayılır hazırlanması burada açıklanan başarılı çoğaltma-zamanlama testi için kritik bir adımdır. Hipotonik tedavi öncesinde colcemid ön adım dahil sıklığı ve mitotik hücrelerin yayılmasını yardımcı olabilir. Bu tipik olarak hasat öncesi 1-3 saat için colcemdi hücrelerin ortaya çıkarmak, ve 10 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda colcemid kullanımı. Ancak, ön arıtma adımı colcemid dahil G2 uzunluğu değiştirebilir ve dolayısıyla kromozom 3'ün yoğunlaşma belirgin çoğaltma zamanlama ve durum değiştirebilir.
Bu prosedür, hücre döngüsü süresine bağlıdır BrdU inkübasyon süresi, değişen bir çok farklı hücre tipleri ve türlere uygulanabilir. En fazla fare ve insan hücre hatları için, G2 fazında tipik olarak 3-6 saat 'tir, bu nedenle, BrdU tedaviler bu aralık tipik olarak. BrdU alternatif 5-etinil-2'deoxyuridine (EDU) kullanarak ve onun sonraki algılama olduğunuBir floresan azid ve "klik kimyası" reaksiyonu 10. EDU algılama düzeni BrdU algılama düzeni üzerinde birçok avantajı vardır. Örneğin, edu tespit örnek tespit ya da DNA denatürasyon gerektirmez. Bu nedenle, eşek çoğaltma için zamanlama EDU kullanımı ilgi kromozom tanımlamak yerine FISH basit G-bantlama teknikleri ile birleştirilebilir.
Burada açıklanan çoğaltma zamanlaması protokol özellikle S tahlil geç faz artı G2 uzanan herhangi bir DNA sentezi için tasarlanmıştır. Buna ek olarak, DNA replikasyonu 6-10 saat arasında nispeten uzun bir süre ile takip BrdU ardından kısa (15-30 dk) pulslar kullanılarak bu prosedürü kullanarak S fazı boyunca izlenebilir. Bu erken ve S-fazı ortasında hem de BrdU şirketleşme görselleştirme sağlar. Örneğin, bazı tümör edilen kromozom kromozom 3'ün tüm uzunluğu boyunca DNA sentezinin başlangıç ve bitiş her ikisi de geciktirilir
Bu çoğaltma zamanlaması prosedürün bir avantajı bireysel hücrelerin o deneyleri çoğaltma zamanlama. Bu nedenle, aynı hücre içinde yer alan homolog kromozomlar arasında çoğaltma zamanlama farklılıklarını belirlemek için yeteneğine sahiptir. Diğer prosedürler varken, örneğin. in situ hibridizasyon çoğaltma zamanlaması (ReTiSH; 11) Homolog kromozomlar üzerindeki belirli bölgelerinin alleller arasında çoğaltma zamanlama farklılıkları tespit etmek için yeteneği var, burada açıklanan prosedürü kromozomların tüm uzunluğu boyunca çoğaltma zamanlaması farklılıkları saptayabilir. Buna ek olarak, bu işlem, bir nüfusu 3 hücrelerin sadece küçük bir kısmını mevcut olan kromozom replikasyonu zamanlama içinde tahlil farklılıklar olabilir. Örneğin, birçok kanser hücre dizilerinde ve primer tümör örnekleri hücrelerinin% 50'sinden daha az mevcut olan kromozom içerir. Şu anda test kromozomlar için bu yordamı kullanıyorsanızPrimer tümör örneklerinde ve birden örneklerde kromozom arasında uyumsuz çoğaltma tespit etmek mümkün olmuştur. Ancak, primer kültürlerinde yaklaşık üçte birini mitotik yayılır yeterli sayıda vermek için başarısız, primer tümör örnekleri mitoz sınırlı sayıda olması göz önüne alındığında.
Bu prosedür mikroarray üzerinde ya dayalı testler sequencing olduğu diğer bir avantajı tek tek kromozom yerine hücrelerin havuzlarından immunoprecipitated DNA daha test olmasıdır. Allelleri arasındaki çoğaltma zamanlaması ayırmak için immünopresipitasyon tabanlı analizlerde polimorfizm tespit edilmeli ve spesifik allel bağlantılı.
Ayrıca, birçok kanser hücreleri çok sayıda kromozom 12 ve DNA replikasyonu stres kanser hücreleri 13 genomik instabilite ile ilişkili olduğu gözlem içeren tanıma, bu protokol bir kullanışlı ve basit bir araç f olduğuna inanıyorumkanser hücrelerinde kromozom replikasyonu zamanlaması ya da rutin analizler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü, CA131967 bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
| Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
| CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
| LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
| CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
| Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
| Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
| Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
| Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
| IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |
|||
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
- Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
- Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
- Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
- Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
- Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
- Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
- Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
- Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
- Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from: http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman (2006).
- Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).
