Analysere og bygningsloven Nukleinsyre Structures med 3DNA

Summary

Den 3DNA programvarepakke er en populær og allsidig bioinformatikk verktøy med evner til å analysere, konstruere og visualisere tredimensjonale nukleinsyre strukturer. Denne artikkelen presenterer detaljerte protokoller for en undergruppe av nye og populære funksjoner som er tilgjengelige i 3DNA, som gjelder for både individuelle strukturer og ensembler av beslektede strukturer.

Abstract

Den 3DNA programvarepakke er en populær og allsidig bioinformatikk verktøy med evner til å analysere, konstruere og visualisere tredimensjonale nukleinsyre strukturer. Denne artikkelen presenterer detaljerte protokoller for en undergruppe av nye og populære funksjoner som er tilgjengelige i 3DNA, som gjelder for både individuelle strukturer og ensembler av beslektede strukturer. Protokoll 1 viser sett med instruksjoner som trengs for å laste ned og installere programvaren. Dette ble fulgt i to protokoll, ved analyse av en nukleinsyre, medregnet de tilordningen av basepar og bestemmelse av stiv-kroppsparametere som beskriver strukturen og, i protokoll 3, ved en beskrivelse av rekonstruksjon av et atom modell av en struktur fra den stive-kroppsparametere. Den nyeste versjonen av 3DNA, versjon 2.1, har nye funksjoner for analyse og manipulering av ensembler av strukturer, slik som de utledes fra kjernemagnetisk resonans (NMR) målinger og molekylær dynamikk (MD) Simuleringer, og disse funksjonene er presentert i protokoll 4 og 5. I tillegg til den 3DNA frittstående programvare pakken, w3DNA web server, som ligger på http://w3dna.rutgers.edu gir et brukervennlig grensesnitt mot utvalgte funksjoner i programvaren. Protokoll 6 viser en ny funksjon i området for å bygge modeller av lange DNA-molekyler dekorert med bundne proteiner på brukerdefinerte steder.

Introduction

Forstå det tredimensjonale strukturer av DNA, RNA, og deres komplekser med proteiner, narkotika og andre ligander, er avgjørende for å tyde deres ulike biologiske funksjoner, og for å la rasjonell utforming av legemiddelselskap. Utforskning av slike strukturer innebærer tre separate, men likevel tett knyttet komponenter: analyse (for å trekke ut mønstre i former og interaksjoner), modellering (for å vurdere energetics og molekylær dynamikk), og visualisering. Strukturell analyse og modellbygging er i hovedsak to sider av samme sak, og visualisering utfyller dem begge.

Den 3DNA suite av dataprogrammer er en stadig mer populær strukturell bioinformatikk verktøykasse med evner til å analysere, konstruere og visualisere tredimensjonale nukleinsyre strukturer. Tidligere publikasjoner skisserte mulighetene i programvaren ^1, forutsatt oppskrifter for å utføre utvalgte oppgaver ^2, introduserte web-basert grensesnitttil populære funksjonene i programvaren ^tre, samlet presentert databaser av strukturelle trekk ved hjelp ^{4 3DNA, 5} og illustrert nytten av programvaren i analysen av både DNA og RNA strukturer ^{seks, syv.}

Målet med denne artikkelen er å bringe 3DNA programvare kit til laboratorium forskere og andre med interesse og / eller behov for å undersøke DNA og RNA romlige organiseringen med state-of-the-art dataverktøy. Protokollene som presenteres her inkluderer trinn-for-trinn-instruksjoner (i) å laste ned og installere programvaren på en Mac OS X-systemet, (ii-iii) å analysere og endre DNA-strukturer på nivå med de konstituerende base-par skritt, ( iv-v) for å analysere og justere sett av beslektede DNA strukturer, og (vi) å konstruere modeller av protein-dekorert DNA-kjeder med den brukervennlige w3DNA webgrensesnitt. Programvaren har evnen til å analysere de enkelte strukturer løst ved hjelp av røntgen-krystallografiske metoder samt storensembler av strukturer bestemmes med kjernemagnetisk resonans (NMR) metoder eller generert av datamaskinen-simulering teknikker.

Strukturene undersøkt her inkluderer (i) den høyoppløselige krystallstruktur av DNA bundet til HBB protein fra Borrelia burgdorferi ⁸ (tick-borne bakterien som forårsaker Lyme sykdom hos mennesker ^{9, 10),} (ii) to store sett med sekvensielt relaterte DNA-molekyler som produseres med molekylære simuleringer ¹¹ - 4,500 øyeblikksbilder av d (GGCAAAATTTTGCC) ₂ og d (CCGTTTTAAAACGG) ₂ oppsamlet ved 100-psec intervaller i løpet av beregningene, og (iii) en liten ensemble av NMR-baserte strukturer av O3 DNA operatør bundet til headpieces av Escherichia coli Lac repressor protein ^12. Instruksjonene nedenfor inneholder informasjon om hvordan du får tilgang til filene på atom-koordinater knyttet til hver av disse strukturene, samt hvordan man bruker 3DNA (en kopi av denne filen blir funnetpå 3DNA forumet på http://forum.x3dna.org/jove ) for å undersøke og endre disse strukturene.

Protocol

En. Installasjon av Software Package

1. Koble til 3DNA hjemmeside http://x3dna.org og klikk på linken til 3DNA Forum. Innenfor Forum velge 'register' linken og følg instruksjonene for å opprette en ny konto.
2. Følgende instruksjoner detalj installasjon av programvaren på en OS X-basert Macintosh-maskin med en standard 'bash' shell. Prosedyren for Linux eller Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) systemer med brukte skjell (inkludert "tcsh ') er funnet i 3DNA Forum.
3. Når du har opprettet et brukernavn og passord, logge inn på forumet. Velg 'Nedlastinger koblingen i Velkommen delen og på den nye siden velger '3 DNA download ". Dette vil bringe deg til 3DNA nedlastingssiden der ulike versjoner av programvaren kan lastes ned.
4. Velg Mac OS X Intel linken for å laste en komprimert tarballen fil (tar.gz) inneholder programvaren.
5. Dobbel click på (tar.gz fil) for å opprette en mappe kalt x3dna-v2.1. Denne mappen, som inneholder 3DNA programvarepakke, kan flyttes til hvilket som helst sted. For hensikten med denne oppskriften, drar vi og slipp den inn i "Programmer"-katalogen. På dette stadiet du er ferdig med tar.gz og kan slette den.
6. Åpne Terminal-programmet, som vanligvis finnes under "Verktøy", og bytt til den x3dna-v2.1 katalogen opprettet i trinn 5 ved hjelp av følgende kommando (endte her og i alle instruksjonene nedenfor ved linjeskift):
   cd / Applications/x3dna-v2.1
7. Kjør setup script som trengs for 3DNA å fungere skikkelig ved å skrive:
   ./bin/x3dna_setup
8. Kopier tolinjers eksportinnstillingene trykt i Trinn 7. Hvis brukeren har plassert programvaren i "Programmer"-katalogen, bør de to streker som følger:
   eksport X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
   eksport PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
   Et annet ord foruten 'Applications' vil appear i eksport kommandoen hvis brukeren har valgt å installere programvaren på en annen katalog. Denne alternative katalog navnet erstatter "Programmer" i over to kommandoer. Merk at hvis standard shell er 'tcsh' istedenfor 'bash', vil innholdet av de to linjene være: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 og setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
9. Sjekk inn "Finder" for å se om en fil som heter ". Bashrc 'finnes allerede på datamaskinen.
10. Åpne TextEdit applikasjonen finnes i "Programmer"-mappen og velger Gjør ren tekst "under" Format "-menyen.
11. Hvis '. Bashrc' fil fra trinn 9 eksisterer, åpne filen i TextEdit og lim inn eksportinnstillingene fra trinn 8 til slutten av filen. Hvis nei ". Bashrc 'filen avslutter, lim eksport innstillinger fra Trinn 8 inn i en tom fil og lagre med filnavnet'. Bashrc 'i ditt hjemmeområde. (Hjemmet katalogen er merket med en "hus"-ikonet på Macintosh.)
12. For de nye innstillingene til be tilgjengelig, må du kjøre nyfrelst 'bashrc.' fil ved hjelp av følgende kommando i Terminal-programmet:
    source ~ /. bashrc
13. Den 3DNA suite er nå installert på systemet ditt, og du kan utføre Protokoller 2-5 i Terminal-programmet. Protokoll 6 er utført ved hjelp w3DNA, et webgrensesnitt til utvalgte funksjoner i 3DNA programvare.

2. Analyse av en Krystallstruktur

1. Vi illustrerer analysen av en nukleinsyre-struktur ved hjelp av DNA bundet til HBB protein fra Borrelia burgdorferi ^8.. Filen av atom-koordinater knyttet til denne strukturen kan bli funnet på Protein Data-Bank ¹³ (PDB; http://www.rcsb.org ), hvor det er tildelt den strukturelle identifikator 2np2. De medfølgende Utfyllende data inkluderer en kopi av denne filen, som også kan finnes på 3DNA Forum på http://forum.x3dna.org/jove.
2. Det første trinnet i 3DNA analyse av strukturen er etableringen av en fil som inneholder alle de sammenkoblede baser. Dette gjøres med "find_pair 'program ved å skrive følgende:
   find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
   Her 2np2.pdb er input-fil av atom-koordinater som er beskrevet ovenfor og 2np2.bps er det utgang tekstfil som inneholder base-paring informasjon. Sistnevnte basepar fil kan undersøkes og redigeres av brukeren hvis det er nødvendig.
3. Det neste trinn i analysen er å bestemme de geometriske parametre som karakteriserer strukturen. Disse inkluderer standard kjemiske torsjon vinkler ^14, pseudorotation vinkler som beskriver rynkes av sukkeret ring ^15, stiv-body parametere som angir arrangementer av baser og påfølgende basepar ^16, og andre tiltak av tre-dimensjonale kjemiske struktur. Kommandoen 'analysere' bruker som inndata basepar fil generert i trinn 2 og skaper flere output filer, som vises i den nåværende arbeidskatalog. Disse verdiene er beregnet ved å skrive følgende kommando:
   analysere 2np2.bps
   Utdatafilene brukt her inkluderer 2np2.out, som inneholder en oversikt over de beregnede parametre, og bp_step.par, som inneholder en liste over den stive kroppen parametrene beskrevet ovenfor. Sistnevnte fil kan lett leses inn i et regneark program for videre analyse og plotting. Se Representant Resultater (figur 1) for et eksempel.

3. Bygging av en DNA Struktur fra Rigid-body parametere

1. I tillegg til analyse av en nuklein-syre struktur, gir 3DNA programvare evnen til å bygge en modell fra stiv-kropp parametere ved hjelp av 'gjenoppbygge-kommandoen. I denne protokoll viser vi hvordan du kan lage to DNA spiralformede modeller, først ved hjelp av rigid-kroppsparameter fra HBB-DNA kompleks som beregnet i protokoll 2 og deretter bruke en modifisert sett med parametre i wjør utvalgte roll vinkler er endret. Rullevinkelen måler graden av bøying av suksessive basepar inn i sporene ^16. DNA. Positive verdier av rullen er forbundet med innsnevringen av store sporet og negative verdier med innsnevringen av mindre sporet. Standard referanseramme ¹⁷ vedtatt av 3DNA og andre populære nukleinsyre analyse programvare, forsikrer f.eks Curves + ^18, numerisk konsistens i de beregnede parametre av Watson-Crick basepar.
2. Som standard vil 3DNA 'gjenoppbygging' funksjon lage eksakte atom modeller som bare inneholder koordinatene til atomer i de nitrogenholdige baser. For å skape en tilnærmet atom-modellen, som inkluderer koordinatene fra både ryggrad og base atomer, skriver du inn følgende kommando:
   x3dna_utils cp_std bDNA
   Denne kommandoen instruerer 3DNA å innføre en standard B-DNA ryggrad konformasjon i bygging av modeller fra rigid-kroppsparameter.
3. Til build en dobbel-spiralformede modell med stiv-kroppsparameter funnet i HBB-DNA-strukturen, skriver du inn følgende:
   gjenoppbygge-atomic bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
   Her '-atom "angir bygging av en all-atom modell med atom-koordinater for alle tunge (ikke-hydrogen) atomer, er' bp_step.par 'filen generert på trinn 3 i protokoll 2, som inneholder de innmatede rigid-kroppsparameter , og '2 np2_rbld_org.pdb 'er output fil med atom-koordinatene til den opprettede strukturen. Sistnevnte fil er formatert i henhold til spesifikasjonene for PDB og dermed avsluttes med '. Pdb'.
4. The 'bp_step.par' Filen kan tilpasses til å generere en modifisert struktur. På en Macintosh, kan endringene utføres ved hjelp av TextEdit applikasjonen som beskrevet i protokoll 1. Trinn 10.
5. Her kan vi endre de ekstreme roll vinkler dannet på de to stedene i størst bøying. Verdiene, som uttrykkes i grader, endres til null av verdier fra 64.95 i linje 17 og 600,93 i line 26. Vi lagre den endrede filen med et nytt navn, "bp_step_roll0.par ', og lukk TextEdit program.
6. Vi bygger strukturen, som i trinn 3, med den modifiserte sett av trinn parametre som input-filen ved å skrive:
   gjenoppbygge-atomic bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
7. De to modellene kan sees i en standard molekylær viewer, for eksempel PyMOL ( www.pymol.org ), ved hjelp av de genererte koordinere filer (. pdb) som input. Se Representative resultater (fig. 2) for bilder av de ombygde strukturer.

4. Analyse av Multi-modell Struktur filer

1. I motsetning til to Protocol, hvor vi analyserer en enkelt nukleinsyre-syreholdig struktur, her viser vi hvordan å analysere et stort ensemble av strukturer. Vi undersøker variasjon over tid av de stive-kroppsparameter langs en ​​serie på 14 basepar DNA kjedene hentet fra molekylær-dynamikk (MD) simuleringer ¹¹ http://forum.x3dna.org/jove .
2. Det første trinnet i analysen er den samme som den som utføres i to protokoll, identifikasjon av de sammenkoblede baser ved å gjøre «find_pair"-program. Siden hele settet av strukturer aksjer samme base-paring ordningen man trenger å kjøre "find_pair 'bare én gang på et representativt fil. Her velger vi den 1001st strukturen i simuleringen av DNA-kjeder som inneholder en sentral AT trinn, med filnavnet md_AT_set1.pdb.1001. Følgende instruksjon slektertes base-paring informasjon og lagrer den i filen md_AT_set1.bps:
   find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
   Brukeren kan undersøke identifisert basen paring og gjøre manuelle endringer i filen basert på kunnskap om strukturen.
3. Det neste trinn er å bestemme de geometriske parametre for hele settet med strukturer ved hjelp av den 'x3dna_ensemble analyserer "kommando. Programmet benytter som inndata base-par fil generert i trinn 2 (md_AT_set1.bps) samt en fil som inneholder en oppføring av strukturene som skal analyseres. Sistnevnte fil, her kalt md_AT_set1.list, inneholder 4500 filer som skal analyseres, med filnavnene lagt inn på enkelte linjer i den rekkefølgen som genereres av MD simulering. En kopi av denne filen er inkludert i Supplementary Material og også tilbudt på 3DNA Forum. Brukeren skal varsles, på grunn av det store antall filer, som beregningsorientert kan være lang (~ 20 min per tusen filer på en AMD Phenom II X4 965 prosessor). The-kommandoen kjøres ved å skrive følgende:
   x3dna_ensemble analysere-b md_AT_set1.bps-l md_AT_set1.list-o md_AT_set1.out
   I eksempelet ovenfor '-b' gjelder base-pair-filen ble opprettet i trinn 2, angir "-l" som en liste over filer er gitt, og '-o' tillater brukeren å tildele et navn til filen. Det er mange alternativer som kan brukes i forbindelse med "x3dna_ensemble analysere 'kommandoen, som for eksempel valg av bestemte modeller. Brukeren kan skrive "x3dna_ensemble analysere-h" for å få mer informasjon om disse alternativene.
4. Det neste trinnet er å trekke ut de ønskede rigid-kroppsparameter fra oversikten output file, md_AT_set1.out, generert i trinn tre. Dette gjøres ved hjelp av "x3dna_ensemble ekstrakt 'kommando. En liste over tilgjengelige geometriske parametere kan finnes ved å skrive 'x3dna_ensemble ekstrakt-l'. Her kan vi trekke ut roll vinkler og skape en kommaseparert tekstfil (CSV) av roll vinkler med følgende kommando:
   x3dna_ensemble ekstrakt-proll-s,-f md_AT_set1.out-o md_AT_set1_roll.csv
   The '-p roll "i denne kommandoen angir parameteren som skal trekkes ut, betyr'-s 'en kommaseparert fil, betegner'-f 'output file hentet fra ensemblet analysere kommandoen, og'-o 'tillater brukeren å gi navn til CSV output file av rulle vinkler langs DNA i alle analyserte strukturer. Denne filen kan leses inn i andre programmer for videre analyse og plotting. Se Representant Resultater (figur 3) for analyse av variasjonen av roll i de to MD-genererte datasett som er beskrevet ovenfor og den 3DNA Forum for MATLAB script som brukes til å generere disse bildene.

5. Superposisjon av Multi-modell Structures på en felles referanseramme

1. Den nyeste versjonen av 3DNA (versjon 2.1) har en ny funksjon som lar brukeren se på flere strukturer fra et felles perspektiv. The 'x3dna_ensemble reorientere' kommando superimposes en samling av relaterte Struktureringr på en felles base pair eller base-par trinn. Den følgende protokollen gjelder denne evne til NMR-avledede strukturer av O3 DNA operatør bundet til headpieces over Lac repressor proteinet ^12.. Disse strukturene er lagret på PDB under identifikator 2kek i en multi-modell strukturelle fil som inneholder alle struktur modeller i en enkelt fil, i motsetning til separate filer som de som brukes for hver av de 4500 modellene i protokoll 4. De medfølgende Utfyllende data inkluderer en kopi av denne filen, som også kan finnes på 3DNA Forum på http://forum.x3dna.org/jove .
2. Som i tidligere protokoller, er det første trinnet å beregne baseparring av DNA med "find_pair"-program. I dette tilfellet bruker vi som input filen '2 kek.pdb 'og skriv følgende:
   find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
   Basen sammenkoblingen er generert ved hjelp av den første modellen i pdb filen. Manuelle korrigeringer til outputted bASE-pair-fil, '2 kek.bps ', kan gjøres basert på kunnskap om strukturen.
3. Programmet 'x3dna_ensemble reorientere' vil innrette de enkelte modellene i en multi-modell struktur på en felles referanseramme. Dette programmet krever både pdb filen og base-paring fil fra forrige trinn som input og drives med følgende kommando:
   x3dna_ensemble reorientere-b 2kek.bps-f 1-e 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
   Her '-b' alternativet angir base-paring fil, betegner '-f 1' den basepar som alle strukturer er innrettet, i dette tilfelle basepar 1 ved 5'-enden av sekvensen-bærende hårstreng den '-e' angir innspill ensemble-filen, og '-o' tillater brukeren å gi en output fil navn, i dette tilfellet '2 kek_fr1.pdb '. Mer informasjon om kommandoalternativer kan fås ved å skrive 'x3dna_ensemble reorientere-h'. Se Representative resultater (figur 4) for drøftelse av de innrettede strukturer.

6. ConstruDette skjer av en Protein-dekorert DNA Molecule

1. Den w3DNA webgrensesnitt inneholder noen populære funksjonene i 3DNA programvarepakken. Her kan vi trekke oppmerksomhet til evne til å konstruere tredimensjonale modeller av protein-dekorert DNA med webserveren. De bundne DNA-fragmenter vedta rigid-kroppsparameter av de utvalgte protein-DNA komplekser, her verdiene i DNA bundet til HBB protein analysert i protokoll 2. De ubundne regioner av DNA kan benytte én av tre brukervalgte skruelinjeformede former (A, B eller C). A, B og C refererer til tre kanoniske modeller av DNA, oppnådd fra tidlige fiber diffraksjon eksperimenter, med henholdsvis 11, 10 og 9 basepar pr omdreining av dobbeltspiralen ^19-21.
2. Det første skritt i å bygge et protein-dekorert DNA-modellen er å besøke w3DNA nettsted på http://w3dna.rutgers.edu . Utvalg av "Reconstruction" fra menyen øverst til venstre på siden aktivivates den elektroniske modell-bygningen evner.
3. Det neste trinnet er å velge "Bound Protein-DNA mal koblingen funnet i en skygget boksen i midten av den nye siden. Dette valget vil aktivere en rullegardinmeny, som lar brukeren å spesifisere antall bundne proteiner. Her velger vi to innbundne proteiner og klikk på "Fortsett"-knappen. Legg merke til at modellene er begrenset i størrelse til 1000 basepar, eller 2000 nukleotider, og tretti bundne proteinene.
4. Valg av antall bundne proteinene fører til en spesifikasjon side lik den som er vist i figur 5.. Denne siden lar brukeren å spesifisere DNA sekvens, spiralformede form av ubundet DNA, og de identiteter og plasseringen av de bundne proteiner.
5. Brukeren skriver eller pasta i ønsket rekkefølge i tekstboksen i midten av spesifikasjonen side (Figur 5, Label 1). Merk bare standard rester - A, T, C, G og U - er akseptert. Her kan vi legge inn en 81 basepar homopolymer, består utelukkende av A · T parene med A i sekvensen-bærende strand.
6. Det er en rullegardinmeny (Figur 5, Label 2), under tekstboksen, for å velge den spiralformede konformasjon av ubundne regioner av DNA. I dette eksempelet velger vi B-formen konformasjon.
7. Det er en tekst-boksen nær bunnen av spesifikasjonen for å angi binding stillingen (e) og fil-navnet (e) av det bundne protein (er) (figur 5, Etikett 3). Bindingen stilling angir plasseringen av senteret av protein-bundet fragment i DNA-sekvensen. Hvis det bundne DNA inneholder et odde antall basepar, som i HBB-DNA-struktur, betegner binding stilling plasseringen av den midtre basepar av fragmentet. I tilfelle av HBB-bundet DNA, er denne midtre basepar et t * T mispair. I dette eksempel, der vi binder to kopier av HBB proteinet til DNA-templat, blir t * T paret plassert ved posisjoner 20 og 63 i 81 base-par DNA SEkvens. Merk at sekvensen av det bundne fragmentet ikke behøver å falle sammen med det angitt i Trinn 5. Dersom proteinbundet regionen inneholder et likt antall basepar, betegner binding stilling plasseringen av den midtre base-par steg på DNA. Det vil si at den sentrale base-par trinn i den bundne fragment plassert mellom basepar n og n +1, hvor n er det angitte antall langs segmentet. Merk også at brukeren kan dekorere DNA med en hvilken som helst protein så lenge som strukturen av dets kompleks med DNA er kjent og lagres i PDB standard-størrelse ^13.
8. På bunnen av spesifikasjonen side er det en boks som gjør det mulig for brukeren å generere en forhåndsvisning av proteinbundet DNA (figur 5, etikett 4). Her kan vi sjekke at boksen og klikk på "Fortsett"-knappen. Denne handlingen genererer en gjennomgang side som viser de valgte parametrene samt eventuelle feil som kan ha oppstått fra overlappingen av de valgte bindende områder. Brukeren kan sedan du velger Tilbake-knappen hvis eventuelle endringer må gjøres eller "Build"-knappen for å fortsette.
9. Den neste siden viser et statisk bilde av DNA-protein kompleks i sin mest utvidet ordning og gir mulighet for on-line interaktiv visualisering via Jmol og Webmol. Brukeren kan også laste ned en koordinat (. Pdb-fil) som er formatert i henhold til spesifikasjonene for PDB. Dette gjøres ved å velge "Last ned ombygd pdb filen 'linken under generert image. Sistnevnte fil kan lett leses inn i en molekylær grafikk program for videre visualisering. Se Representant Resultater (figur 6) for eksempler på HBB-dekorerte DNA beskrevet ovenfor, og en litt lengre (86 basepar) kjede med HBB sentrert i posisjonene 20 og 67.

Representative Results

De 3DNA dataverktøy blir rutinemessig brukt til å analysere nukleinsyre strukturer. For eksempel, er identiteten til basepar og stive-body parametere som karakteriserer arrangementer av baser i dobbel-spiralformede fragmenter av DNA og RNA strukturer automatisk ut og lagres for hver ny oppføring i nukleinsyre Database ^22, en verdensomspennende oppbevaringssted for nukleinsyre strukturell informasjon. Verdiene av stiv-kroppsparameter bestemmes med protokoll 2 lett avsløre skjevheter i tredimensjonal struktur, slik som de to stedene i ekstrem DNA bøyd opp mot det store groove, med store positive roll vinkler (64.95 ° og 60,93 °), finnes på AT AT · trinn 13 og 22 i krystallen kompleks med Borrelia burgdorferi HBB protein ⁸ (figur 1).

Den evnen til programvaren for å gjenoppbygge strukturer fra disse mengdene med protokoll 3 gjør det mulig å bestemme hvor iindivid base og base-par skritt bidra til den generelle molekylær fold. Som illustrert i figur 2, reflekterer den globale bøying av DNA indusert av HBB mer enn de to ekstreme forvrengninger roll nevnt ovenfor. Det er, forblir DNA sterkt buet når rekonstruert med disse basepar skritt rettet, dvs. med null roll vinkler på de to stedene. Den samme teknikken har tidligere åpenbart bidragene av spesifikke base-par trinn og deformasjoner til superhelical banen av DNA pakket på overflaten av nucleosome kjernepartikkel ⁶ og i forhold til bredden av det mindre spor av DNA bundet til det bakterielle nucleoid- tilknyttede protein Fis ^23.

Den nye evne i 3DNA, beskrevet i protokoll 4, for å undersøke et stort antall beslektede strukturer som gjør det mulig å trekke ut både sekvens-og tidsavhengige mønstre i de romlige arrangementer av simulert DNA og RNA-molekyler. For eksempel, (gul) coleller-koding av rullen vinkler mellom suksessive basepar i to store sett av simulerte DNA-konstruksjoner ¹¹ avslører preferensiell bøyning av disse molekylene ved pyrimidin-purin base-par trinn (figur 3). Høyere verdier av roll, avbildet i rødt, som vedvarer i korte perioder ved endene av DNA antyder lokalisert smelting og reannealing av dobbel-spiralformede struktur. De variational mønstre av andre stive-body parametere, slik som vinkler og avstander mellom komplementære baser, kan bidra til å dechiffrere den presise strukturelle skjevheter.

Evnen til 3DNA programvare, presentert i protokoll 5, for å reorientere relaterte molekyler i en felles referanseramme, avslører funksjoner i overordnet struktur skjult i mange av filene som er lagret i PDB. For eksempel produserer den konvensjonelle oppstilling av beslektede strukturer på basis av en rot-middel-kvadrat tilpasning av korresponderende atomer en serie like romlige trasé Tlue omtrent overlagre på hverandre, her ti NMR-baserte modeller av O3 DNA operatør bundet til headpieces over Lac repressor proteinet ¹² (fig. 4 til venstre). Overlagringen av de samme strukturer på et felles koordinatsystem ramme på den 5'-terminale base par av hver dupleks avslører betydelige forvrengninger av global struktur, hvori molekylene beveger seg merkbart forskjellige retninger (figur 4 høyre). Den strukturelle variasjoner kan påvirke brukervennligheten som Escherichia coli Lac repressor protein binder O3 og induserer en sløyfe mellom O3 og sekvensielt fjerne operatører i lac operon ^24.

Fremgangsmåten i protokoll 6, for å bygge modeller av lange DNA-fragmenter dekorert på vilkårlige nettsteder med proteiner og andre ligander, legger et nytt perspektiv på organiseringen av store makromolekylære forsamlinger. Slike modeller bidra til å forstå hvordan de multi-molekylære kompleksersamhandle under biologisk behandling. Som illustrert i figur 6, kan den nøyaktige plassering av en arkitektonisk protein som HBB ha en dramatisk effekt på den totale folding av DNA. Hvis to kopier av den kjente høy oppløsning struktur ^8, er adskilt med 43 basepar, lukkes en 81 base-par DNA-fragment inn i en trang, nesten lukket konfigurasjon. Hvis de to proteinene blir separert ved ytterligere fem basepar, følger DNA en åpen, buktende bane. De svært ulike arrangementer av protein-dekorert duplex viser hvordan avstanden mellom arkitektoniske proteiner kan påvirke cykliseringen eller looping av ^{25 DNA, 26.}

Figur 1. Variant av rullevinkelen mellom påfølgende basepar (se innsatsen for visuell fremstilling) langs DNA chai bundet til HBB protein fra Borrelia burgdorferi ^åtte. Verdiene er oppnådd ved hjelp av "analysere" kommando av 3DNA og de ​​strukturelle data er beskrevet i protokoll 2. Legg merke til de ekstreme verdier av rullen ved nevnte i trinn som braketten den sentrale tredjedel av strukturen.

Figur 2. Omtrentlige atom modeller av DNA konstruert ved hjelp av "gjenoppbygge" funksjon 3DNA og gjengitt i PyMOL med fargekodede atomer (C-cyan, N-blå, O-rød, P-gull). Modeller basert på (venstre) de stive-body trinn parametere av HBB protein og (til høyre) en modifisert sett med trinn parametre, hvor de to største verdiene av roll er satt til null. Se protokoll 3 til trinn-for-trinn-instruksjoner . Legg merke til utfoldelsen av DNA indusert av de pålagte endringer i roll.

Figur 3. Mosaikk bilder av roll vinkler langs DNA i to sett av simulerte strukturer ^11. Verdier av roll, hentet ved hjelp av protokoll 4, er fargekodet fra blått til rødt over området [-5 °, 20 °]. Legg merke motsatt rekkefølge av baser og store verdier roll, markert med gule / røde søyler, som oppstår ved pyrimidine-purine trinnene i de to 14 basepar selv-komplementære sekvenser.

Figur 4. Tegnefilmfigurer av DNA som er funnet i de NMR-avledede strukturer av O3 DNA operatør med lac repressor protein headpieces ¹² Illustrerende for egenskapeneav de "x3dna_ensemble reorientere 'kommando. Images gjengitt i PyMOL (stamnett viser som gull rør og baser som blå pinner) og justert ved hjelp av (til venstre) koordinatene i PDB oppføring (2kek) og (høyre) den strukturelle superposisjonsprinsippet presentert i protokoll 5 . Legg merke til de store forskjellene mellom de strukturene når den plasseres i en felles referanseramme på 5'-terminal basepar.

Figur 5. Skjermbildet fra den w3DNA webserveren illustrerer spesifikasjoner av DNA-sekvensen (etikett 1), den spiralformede form for ubundet DNA (Etikett 2), de posisjoner og identiteter av proteiner (Label 3), og forhåndsvisningen sjekk boks (etikett 4) beskrevet i protokoll 6. Klikk her for å se større figur .

Figur 6. Omtrentlige atom modeller av to HBB proteiner ⁸ bundet til en lang DNA fragment. Konstruksjoner laget med w3DNA webserveren som beskrevet i protokoll 6 og gjengitt i PyMOL. Protein kjedene er showet som fiolette bånd mens DNA er farget-kodet av atom type (C-cyan, N-blå, O-rød, P-gull). Den sentrale basepar av hver protein-bindende områder er satt i posisjoner (venstre) 20 og 62 langs 81 basepar DNA-kjeden og (høyre) 20 og 67 langs 86 basepar DNA-kjeden. Legg merke til den større endring i folding av strukturene forbundet med den økte (fem basepar) forskyvning av de to proteiner.

Discussion

Settet av protokoller som presenteres i denne artikkelen kun berøre mulighetene til 3DNA pakke med programmer. Verktøyene kan brukes til RNA strukturer for å identifisere ikke-kanonisk basepar, for å bestemme de sekundære strukturelle sammenhenger der en slik sammenkobling oppstår, å kvantifisere den romlige fordelingen av skrueformede fragmenter, for å måle overlappingen av baser langs kjeden ryggrad, etc. gjenoppbyggingen kommandoen tillater brukeren å konstruere enkle og informative blokk representasjoner av baser og basepar sånn vist i den lille til figur 1. Bygningen verktøy også inkluderer funksjoner til 'tråd' ulike sekvenser på et gitt strukturell mal, for å generere modeller av mange dobbelt-, trippel-og fire-strandet DNA strukturer, for å orientere modeller i en bestemt retning, etc. Endelig har 3DNA spilte en betydelig rolle i en rekke andre prosjekter, for eksempel: SWS solvation nettjeneste for nukleinsyrer ^27; ARTS web server forsamkjøre RNA tertiære strukturer ^28, den MDDNA web-basert verktøy for analyse av molekylære dynamikk resultater og struktur prediksjon ^29, hyse informasjon-drevet protein-DNA docking metode ^30, den SARA server for funksjon annotering av RNA strukturer ³¹ og vises i 3D- DART DNA struktur modellering server ³² og vises i 3D-footprint database for strukturell analyse av protein-DNA komplekser ^33, RNA FRABASE 2,0 database for identifisering av tredimensjonale fragmenter i RNA strukturer ^34, og SETTER web server for den parvise sammenligningen av RNA strukturer ^35. Så langt vi kjenner til, er det i dag ingen andre nukleinsyre-syre struktur programvarepakke med en tilsvarende bred kombinasjon av funksjoner og robust ytelse registrering av 3DNA.