Analysera och bygga nukleinsyrastrukturer med 3DNA

Summary

Den 3DNA programpaket är ett populärt och mångsidigt bioinformatik verktyg med förmåga att analysera, konstruera och visualisera tredimensionella nukleinsyrastrukturer. Den här artikeln presenterar detaljerade protokoll för en delmängd av nya och populära funktioner som finns i 3DNA, gäller både enskilda strukturer och ensembler av relaterade strukturer.

Abstract

Den 3DNA programpaket är ett populärt och mångsidigt bioinformatik verktyg med förmåga att analysera, konstruera och visualisera tredimensionella nukleinsyrastrukturer. Den här artikeln presenterar detaljerade protokoll för en delmängd av nya och populära funktioner som finns i 3DNA, gäller både enskilda strukturer och ensembler av relaterade strukturer. Protokoll 1 listar uppsättning instruktioner som behövs för att hämta och installera programvaran. Detta följs, i protokoll nr 2, genom analys av en nukleinsyra struktur, inklusive tilldelning av baspar och bestämning av stela kroppens parametrar som beskriver strukturen och i protokoll 3, med en beskrivning av återuppbyggnaden av en atom modell av en struktur från dess styv-kroppsparametrar. Den senaste versionen av 3DNA, version 2.1, har nya funktioner för analys och manipulation av ensembler av strukturer, såsom de härledda från kärnmagnetisk resonans (NMR) mätningar och molekylär dynamik (MD) Simuleringar, dessa funktioner presenteras i protokollen 4 och 5. Förutom den 3DNA fristående programpaket, den w3DNA webbserver, belägen vid http://w3dna.rutgers.edu ger, ett användarvänligt gränssnitt till utvalda funktioner i programvaran. Protokoll 6 visar en ny egenskap hos tomten för att bygga modeller av långa DNA-molekyler dekorerade med bundna proteiner vid användardefinierade lägen.

Introduction

Att förstå de tre-dimensionella strukturer av DNA, RNA och deras komplex med proteiner, läkemedel och andra ligander, är avgörande för att dechiffrera deras olika biologiska funktioner, och för att tillåta rationell design av terapi. Utforskning av sådana strukturer innebär tre separata, men ändå nära besläktade delar: analys (för att extrahera mönster i former och interaktion), modellering (att bedöma energetik och molekylära dynamik), och visualisering. Strukturell analys och modellbygge är i huvudsak två sidor av samma mynt, och visualisering kompletterar dem båda.

Den 3DNA svit av datorprogram är ett allt populärare strukturell bioinformatik verktygslåda med förmåga att analysera, konstruera och visualisera tredimensionella nukleinsyrastrukturer. Tidigare publikationer beskrivs funktionerna i programvaran ^1, förutsatt recept för att utföra vissa uppgifter ^2, införde det webbaserade gränssnittettill populära funktioner i programvaran ^3, samlas presenterade databaser av strukturella drag med 3DNA ^{4, 5} och illustreras användbarheten av programvaran i analysen av både DNA och RNA-strukturer ^{6, 7.}

Målet med denna artikel är att bringa 3DNA program kit till laboratorium forskare och andra med intresse och / eller behov för att undersöka DNA och RNA rumslig organisation med state-of-the-art beräkningsverktyg. De protokoll som presenteras här omfattar steg-för-steg-instruktioner (i) att ladda ner och installera programmet på en Mac OS X-system, (ii-iii) att analysera och modifiera DNA-strukturer på samma nivå som de ingående baspar steg, ( IV-V) för att analysera och anpassa uppsättningar av relaterade DNA-strukturer, och (vi) att konstruera modeller av protein-inredda DNA-kedjor med användarvänliga w3DNA webbgränssnitt. Programvaran har förmågan att analysera enskilda strukturer lösas med röntgenkristallografisk metoder samt storaensembler av strukturer bestämda med kärnmagnetisk resonans (NMR) metoder eller med hjälp av dator-simuleringsteknik.

Strukturerna undersökts här innefattar (i) den högupplösta kristallstruktur av DNA bundet till HBB proteinet från Borrelia burgdorferi ⁸ (den fästingburna bakterien som orsakar Lyme sjukdomen hos människor ^{9, 10),} (ii) två stora uppsättningar av sekventiellt relaterade DNA-molekyler som produceras med molekylära simuleringar ¹¹ - 4500 ögonblicksbilder av d (GGCAAAATTTTGCC) ₂ och d (CCGTTTTAAAACGG) ₂ uppsamlades vid 100-Psec inkrement under beräkningarna, och (iii) en liten ensemble av NMR-baserade strukturer av O3 DNA operatören bundna till överstycken i Escherichia coli Lac repressorprotein ^12. Instruktionerna nedan innehåller information om hur man kommer åt filerna på atomkoordinater associerade med var och en av dessa strukturer samt hur man använder 3DNA (en kopia av denna fil hittaspå 3DNA forumet på http://forum.x3dna.org/jove ) att granska och ändra dessa strukturer.

Protocol

Ett. Installation av programpaketet

1. Anslut till 3DNA hemsida http://x3dna.org och klicka på länken till 3DNA forumet. Inom forumet välj "register" länken och följ instruktionerna för att skapa ett nytt konto.
2. Följande instruktioner detalj installation av programvaran på en OS X-baserad Macintosh-dator med en standard "bash" skal. Förfarandet för Linux eller Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) system med vanliga snäckor (inklusive "tcsh") finns inom 3DNA forumet.
3. När du har etablerat ett användarnamn och lösenord, logga in på forumet. Välj 'Downloads' länken i Welcome avsnittet och på den nya sidan väljer '3 DNA nedladdning ". Detta tar dig till 3DNA nedladdningssida där olika versioner av programvaran kan laddas ner.
4. Välj Mac OS X Intel länken för att ladda ner en komprimerad tar-arkiv (tar.gz) innehåller programvaran.
5. Dubbel click på (tar.gz) fil för att skapa en mapp med namnet x3dna-v2.1. Den här mappen, som innehåller 3DNA programsvit, kan flyttas till valfri plats. För detta recept, drar vi och släppa den i "Program" katalogen. I detta skede du är klar med tar.gz-filen och kan ta bort den.
6. Öppna programmet Terminal, normalt återfinns under "Verktyg" och byt till x3dna-v2.1 katalog skapades i steg 5 med följande kommando (hamnade här och i alla instruktionerna nedan av en vagnretur):
   cd / Applications/x3dna-v2.1
7. Kör installationsskriptet behövs för 3DNA att fungera genom att skriva:
   ./bin/x3dna_setup
8. Kopiera tvåradiga exportinställningar ut i steg 7. Om användaren har placerat programvaran i "Program" katalog, bör de två linjer visas på följande sätt:
   export X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
   export PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
   Ett annat ord förutom "Applications kommer Appear i export-kommandot om användaren har valt att installera programmet i en annan katalog. Detta alternativ katalog namnet ersätter "Applications" i ovanstående två kommandon. Observera att om den förvalda skalet är "tcsh" istället för "bash", skulle innehållet i de två raderna: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 och setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
9. Kolla in "Finder" för att se om en fil som heter ". Bashrc 'finns redan på din dator.
10. Öppna Textredigerare programmet finns i "Program"-katalogen och välj "Gör Plain Text" under "Format"-menyn.
11. Om ". Bashrc 'filen från steg 9 föreligger, öppna filen i Textredigeraren och klistra exportinställningarna från steg 8 till slutet av filen. Om ingen ". Bashrc 'file utgångar, klistra exportinställningarna från steg 8 till en tom fil och spara med filnamnet". Bashrc "i din hemkatalog. (Den hemkatalog betecknas med ett "hus"-ikonen på Macintosh.)
12. För att de nya inställningarna till be tillgänglig, måste du köra nyfrälsta "bashrc." filen med följande kommando i Terminal-programmet:
    source ~ /. bashrc
13. Den 3DNA sviten är nu installerad på ditt system och du kan utföra Protokoll 2-5 i Terminal-programmet. Protokoll 6 utförs med w3DNA, ett webbgränssnitt till utvalda funktioner i 3DNA programvaran.

2. Analys av en kristallstruktur

1. Vi illustrerar analysen av en nukleinsyra struktur med användning av DNA bundet till HBB proteinet från Borrelia burgdorferi ^8. Filen för atomkoordinater förknippade med denna struktur kan hittas på Protein Data Bank ¹³ (PDB, http://www.rcsb.org ), där den tilldelas den strukturella identifierare 2np2. De medföljande Kompletterande data inkluderar en kopia av filen, som också kan hittas på 3DNA Forum på http://forum.x3dna.org/jove.
2. Det första steget i 3DNA analys av struktur är att skapa en fil som listar alla de parade baser. Detta görs med "find_pair-programmet genom att skriva följande:
   find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
   Här 2np2.pdb är indatafilen av atomkoordinater beskrivits ovan och 2np2.bps är produktionen textfil som innehåller basparning information. Den senare baspar fil kan granskas och redigeras av användaren om det är nödvändigt.
3. Nästa steg i analysen är att bestämma de geometriska parametrar som kännetecknar strukturen. Dessa inkluderar vanliga vinklar kemiska torsion ^14, pseudorotation vinklar som beskriver veckar sockret ringen ^15, styv-body parametrar som specificerar de arrangemang av baser och successiva baspar ^16, och andra åtgärder för tredimensionell kemisk struktur. Kommandot 'analysera' tar indata basparet fil som genereras i steg 2 och skapar flera output filer, som visas i den aktuella arbetskatalogen. Dessa värden är beräknade genom att skriva följande kommando:
   analysera 2np2.bps
   Utgången filer användas här innefattar 2np2.out, som innehåller en översikt över de beräknade parametrarna, och bp_step.par, som innehåller en förteckning över den styva-kroppen ovan beskrivna parametrarna. Den senare filen kan enkelt läsa in ett kalkylprogram för vidare analys och plottning. Se Representativa resultat (figur 1) för ett exempel.

Tre. Konstruktion av en DNA-struktur från Rigid-kroppsparametrar

1. Utöver analysen av en nukleinsyra-syra struktur ger 3DNA mjukvaran förmågan att bygga en strukturell modell av styv-kroppsparametrar användargränssnittet med ombyggnaden "-kommando. I detta protokoll visar vi hur man konstruerar två DNA spiralformade modeller, först med hjälp av stela-kroppsparametrar från HBB-DNA komplex som beräknats i protokoll 2 och sedan använda en modifierad uppsättning parametrar i vikthich utvalda rullningsvinklar ändras. Den rollvinkel mäter graden av böjning av successiva baspar in i spåren i det DNA ^16. Positiva värden på rulle är förknippade med förträngning av stora spåret och negativa värden med förträngning av den lilla fåran. Standarden referensram ¹⁷ som antogs av 3DNA och andra populära nukleinsyraanalys programvara, försäkrar t.ex. Kurvor + ^18, numerisk konsekvens i de beräknade parametrarna för Watson-Crick baspar.
2. Som standard kommer 3DNA 'ombyggnad' funktion skapar exakta atomära modeller som bara innehåller koordinaterna för atomerna i de kvävebaser. För att skapa en ungefärlig atommodell, vilket inkluderar koordinater från både ryggrad och atomer bas, skriver du följande kommando:
   x3dna_utils cp_std bDNA
   Detta kommando instruerar 3DNA att införa en standard B-DNA ryggraden konformation i byggandet av modeller från styv-kroppsparametrar.
3. Till build en dubbel-helix-modellen med stel-kroppsparametrar finns i HBB-DNA-strukturen, skriver du följande:
   återuppbygga-atom bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
   Här-atom "anger att bygga en all-atom modell med atomkoordinater för alla tunga (icke-väte) atomer, är" bp_step.par 'filen som genereras i steg 3 i protokoll nr 2, som innehåller de inmatade styv-kroppsparametrar , och '2 np2_rbld_org.pdb 'är den utgående filen med de atomkoordinater av den skapade strukturen. Den sistnämnda filen är formaterad i enlighet med specifikationerna i det preliminära budgetförslaget och därmed slutar med ". Pdb".
4. Den "bp_step.par" filen kan redigeras för att generera en modifierad struktur. På en Macintosh, kan förändringarna genomföras med Textredigerare ansökan enligt protokoll 1 Steg 10.
5. Här kan vi ändra de extrema rullningsvinklar bildas vid de två platserna för största böjning. De värden, som uttrycks i grader, ändras till noll från värden av 64.95 i linje 17 och 600,93 i linje 26. Vi sparar den modifierade filen med ett nytt namn, "bp_step_roll0.par ', och stäng Textredigerare-programmet.
6. Vi bygger strukturen, som i steg 3, med den modifierade uppsättning steg parametrar som indata filen genom att skriva:
   återuppbygga-atom bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
7. De två modellerna kan visas i en standard molekylär tittaren, såsom PyMOL ( www.pymol.org ), med användning av de genererade koordinatfiler (. pdb) som indata. Se Representativa resultat (figur 2) för bilder av den ombyggda strukturer.

4. Analys av Multi-modellens struktur filer

1. I motsats till protokoll 2, där vi analyserar en enda nuk-syra-innehållande struktur, här visar vi hur man analyserar en stor ensemble av strukturer. Vi undersöker variationen över tiden för de stela-kroppsparametrar längs en ​​serie av 14 baspar DNA-kedjor som erhålls från molekylär-dynamik (MD) simuleringar ¹¹ http://forum.x3dna.org/jove .
2. Det första steget i analysen är densamma som den som utförs i protokoll 2, identifiering av de parade baserna genom att köra 'find_pair "-programmet. Eftersom hela uppsättningen av strukturer har samma bas-parning system måste man köra 'find_pair "bara en gång på en representativ fil. Här väljer vi den 1001:e strukturen i simuleringen av DNA-kedjor som innehåller en central i steg, med filnamnet md_AT_set1.pdb.1001. Följande instruktion släktenTES denpara information och lagrar den i filen md_AT_set1.bps:
   find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
   Användaren kan undersöka identifierade basen Avklipp och göra manuella ändringar i filen som bygger på kunskap om struktur.
3. Nästa steg är att bestämma de geometriska parametrarna för hela uppsättningen av strukturer med hjälp av "x3dna_ensemble analysera" kommandot. Programmet används som indata av basparet fil som genereras i steg 2 (md_AT_set1.bps) såväl som en fil som innehåller en lista på de strukturer som skall analyseras. Den sistnämnda filen, här kallad md_AT_set1.list, innehåller 4.500 filer som ska analyseras, med filnamnen som anges på enskilda rader i den ordning som genereras av MD-simulering. En kopia av denna fil ingår i den kompletterande Material och erbjuds också på 3DNA forumet. Användaren bör varnas, på grund av det stora antalet filer, att beräkningstiden kan vara lång (~ 20 min per 1.000 filer på en AMD Phenom II X4 965 processor). The kommandot körs genom att skriva följande:
   x3dna_ensemble analysera-b md_AT_set1.bps-L md_AT_set1.list-o md_AT_set1.out
   I exemplet ovan "-b" avser basparet fil som skapades i steg 2, anger '-l' att en lista med filer ges, och '-o' tillåter användaren att tilldela ett namn till den utgående filen. Det finns många alternativ som kan användas i samband med "x3dna_ensemble analysera" kommandot, som val av specifika modeller. Användaren kan skriva 'x3dna_ensemble analysera-h' för att få mer information om dessa alternativ.
4. Nästa steg är att extrahera de önskade styva-kroppsparametrar från översikt utmatningsfilen, md_AT_set1.out, som skapas under steg 3. Detta utförs med hjälp av 'x3dna_ensemble extract "-kommando. En lista över tillgängliga geometriska parametrar kan hittas genom att skriva 'x3dna_ensemble extrakt-l'. Här kan vi extrahera rullningsvinklar och skapar en kommaseparerad textfil (CSV) av rullningsvinklar med följande kommando:
   x3dna_ensemble extrakt-proll-s,-f md_AT_set1.out-o md_AT_set1_roll.csv
   Den "-p roll" i detta kommando anger parametern som skall extraheras, betyder "-s," en kommaseparerad fil, betecknar '-f' utdatafilen erhållits från ensemblen analysera kommandot, och '-o "tillåter användaren att namnge CSV utdatafilen av rullningsvinklar längs DNA i alla analyserade konstruktioner. Denna fil kan läsas in i andra program för vidare analys och plottning. Se Representativa resultat (Figur 3) för analys av variationen av rullen i de två MD-genererade datamängder som beskrivs ovan och den 3DNA Forum för MATLAB script som används för att generera dessa bilder.

Fem. Överlagring av Multi-modellstrukturer på en gemensam referensram

1. Den senaste versionen av 3DNA (version 2.1) har en ny funktion som tillåter användaren att titta på flera strukturer ur ett gemensamt perspektiv. Den "x3dna_ensemble omorientera" kommandot överlagrar en samling relaterade strukes på en gemensam baspar eller baspar steg. Följande protokoll gäller denna förmåga till NMR-härledda strukturer O3 DNA operatören bunden till överstycken i Lac repressorprotein ^12. Dessa strukturer lagras i det preliminära budgetförslaget under identifierare 2kek i en multi-modell strukturell fil, som innehåller alla strukturmodellerna i en enda fil, i motsats till de olika filer som de som används för var och en av de 4.500 modeller i protokoll nr 4. De medföljande Kompletterande data inkluderar en kopia av filen, som också kan hittas på 3DNA Forum på http://forum.x3dna.org/jove .
2. Liksom i föregående protokollen, är det första steget att beräkna basparning av DNA med den "find_pair-programmet. I det här fallet använder vi som indata filen '2 kek.pdb "och skriver följande:
   find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
   Basparningen genereras med hjälp av den första modellen i det preliminära budgetförslaget filen. Manuella korrigeringar av utmatade base-pair-fil, '2 kek.bps ", kan göras baserat på kunskap om struktur.
3. Programmet "x3dna_ensemble omorientera" kommer att anpassa de olika modellerna i en multi-modell konstruktion på en gemensam referensram. Detta program kräver både pdb filen och basparande filen från föregående steg som input och drivs med följande kommando:
   x3dna_ensemble omorientera-b 2kek.bps-f 1-e 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
   Här '-b' alternativet anger basparande fil, betecknar '-f 1' i baspar som alla strukturer är i linje, i det här fallet baspar 1 vid 5'-änden av sekvensen-bärande Strand, den "-e" anger filen input ensemble, och '-o' tillåter användaren att tillhandahålla ett utfilnamet, i detta fall '2 kek_fr1.pdb '. Mer information om kommandoalternativen kan erhållas genom att skriva 'x3dna_ensemble omorientera-h'. Se Representativa resultat (Figur 4) för diskussion av de inriktade strukturer.

6. ConstruInsatser för ett protein dekorerad-DNA-molekyl

1. Den w3DNA webbgränssnitt innehåller några populära funktioner i 3DNA programpaketet. Här vi uppmärksamma möjligheten att konstruera tredimensionella modeller av protein dekorerad-DNA med webbservern. De bundna DNA-fragmenten antar de styv-kroppsparametrar för de valda protein-DNA-komplex, här värdena av DNA bundet till HBB-proteinet analyseras i protokoll 2. De obundna regioner av DNA kan anta ett av tre användarvalda spiralformade former (A, B eller C). A, B, och C avser tre kanoniska modeller av DNA, som erhållits från tidiga experiment fiber diffraktion, med respektive 11, 10 och 9 baspar per varv av dubbelspiral ^19-21.
2. Det första steget i att bygga en protein-dekorerad DNA-modellen är att besöka w3DNA webbplats på http://w3dna.rutgers.edu . Val av "Reconstruction" från menyn längst upp till vänster på sidan aktitiveras online-modell-byggnad kapacitet.
3. Nästa steg är att välja "Bundet protein-DNA-mall"-länken som finns i den lätt skuggade rutan i mitten av den nya sidan. Detta val kommer att aktivera en rullgardinsmeny, vilket tillåter användaren att specificera antalet bundna proteiner. Här väljer vi två proteiner och klicka på "Fortsätt". Notera att modeller är begränsade i storlek till 1000 baspar, eller 2000 nukleotider, och trettio proteiner.
4. Val av antalet bundna proteiner leder till en specifikation sida liknande den som visas i figur 5. På denna sida kan användaren att specificera den DNA-sekvens, den spiralformade formen av obundet DNA, och identiteterna och platser av de bundna proteiner.
5. Användaren skriver eller pastor i den önskade sekvensen i textrutan i mitten av specifikationen sidan (Figur 5, Etikett 1). Notera bara vanliga rester - A, T, C, G och U - accepteras. Här anger vi en 81 baspar homopolymer, består helt av A · T par med A i sekvensen bärande Strand.
6. Det finns en rullgardinsmeny (Figur 5, Etikett 2), under textrutan, för att välja helixkonformation av de obundna regioner av DNA. I det här exemplet väljer vi att B-formen konformation.
7. Det finns en textruta längst ned på sidan med specifikationer för att ange bindande ståndpunkt (er) och filnamn (er) av bundet protein (er) (Figur 5, Etikett 3). Den bindningsposition anger platsen för centrum av proteinbundna fragmentet på DNA-sekvensen. Om det bundna DNA innehåller ett udda antal baspar, såsom i HBB-DNA-strukturen, betecknar bindningspositionen placeringen av mitten baspar av fragmentet. I fallet med HBB-bundet DNA, är detta mellersta baspar en T · T felpaming. I det här exemplet, där vi binder två kopior av HBB proteinet till DNA-mallen, är T · T paret placeras vid positionerna 20 och 63 av de 81 baspar DNA SEkvens. Observera att sekvensen för den bundna fragmentet inte behöver sammanfalla med den som anges i steg 5. Om erhållna proteinbundna region innehåller ett jämnt antal baspar, betecknar bindningspositionen placeringen av mitten baspar steg på DNA. Det vill säga, den centrala basparet steg av det bundna fragmentet placeras mellan baspar n och n +1, där n är det angivna antalet längs segmentet. Observera också att användaren kan dekorera DNA med något protein så länge som strukturen av dess komplex med DNA är känd och lagras i standard PDB format ^13.
8. Längst ner på sidan med specifikationer finns en ruta som låter användaren skapa en förhandsvisning av protein-bundna DNA (Figur 5, Etikett 4). Här kontrollerar vi att rutan och klicka på knappen "Fortsätt". Åtgärden ger upphov till en översyn sida listar de valda parametrarna samt eventuella fel som kan ha uppstått från överlappningen av de utvalda bindningsställen. Användaren kan seavmarkerar funktionen "Bakåt"-knappen om några förändringar behöver göras eller "Build"-knappen för att fortsätta.
9. På nästa sida visar en statisk bild av DNA-protein komplex i sin mest utökade arrangemang och möjliggör on-line interaktiv visualisering via Jmol och Webmol. Användaren kan också ladda ner en koordinat (. PDB) fil som är formaterad i enlighet med specifikationerna i det preliminära budgetförslaget. Detta görs genom att välja "Ladda ombyggda pdb filen 'länken nedanför den genererade bilden. Den senare filen kan enkelt läsa in en molekylär grafikprogram för vidare visualisering. Se Representativa resultat (Figur 6) för exempel på HBB-dekorerat DNA som beskrivs ovan och en något längre (86 baspar) kedja med Hbb centrerad vid positionerna 20 och 67.

Representative Results

De 3DNA mjukvaruverktyg används rutinmässigt för att analysera nukleinsyrastrukturer. Till exempel är identiteterna av baspar och den styva-kroppsparametrar som kännetecknar de arrangemang av baser i dubbel-spiralformade fragment av DNA och RNA-strukturer automatiskt beräknas och lagras vid varje ny post i Nucleic Acid Database ^22, en global repository av nukleinsyra strukturell information. Värdena på de styva kropp som fastställts med protokoll 2 avslöjar lätt snedvridningar i tredimensionell struktur, såsom de två områden av extrem DNA böja in den stora spåret, med stora positiva rullningsvinklar (64.95 ° och 60,93 °), finns på AT · vid stegen 13 och 22 i kristallen komplex med Borrelia burgdorferi HBB protein ⁸ (figur 1).

Möjligheten av programvaran för att bygga strukturer från dessa kvantiteter med protokoll 3 gör det möjligt att bestämma hur iIndividen bas och bas-par steg bidrar till den totala molekylära vecket. Såsom illustreras i figur 2, återspeglar den globala böjning av DNA inducerad av Hbb mer än de två extrema rulle snedvridningar noterats ovan. Det är, förblir DNA starkt krökt när rekonstrueras med dessa baspar steg rätas, dvs med null rullningsvinklar på de båda platserna. Samma teknik har tidigare avslöjat bidragen av specifika baspar steg och deformationer till superhelical stigning av DNA lindade på ytan av nukleosomen kärnpartikeln ⁶ och bredden hos den lilla fåran av bunden DNA till den bakteriella nucleoid- associerat protein Fis ^23.

Den nya kapaciteten i 3DNA, som beskrivs i protokoll nr 4, för att undersöka ett stort antal relaterade strukturer gör det möjligt att utvinna både sekvens-och tidsberoende mönster i de rumsliga arrangemang av simulerad DNA-och RNA-molekyler. Till exempel (gul) coleller-kodning av rullningsvinklar mellan successiva baspar i två stora uppsättningar av simulerade DNA-strukturer ¹¹ avslöjar förmånliga böjning av dessa molekyler vid pyrimidin-purinbas-par steg (Figur 3). De högre värdena för rulle, avbildade i rött, som kvarstår under korta perioder vid ändarna av DNA tyder på lokal smältning och återparning av dubbel-spiralformade struktur. De variational mönster av andra stela kropp parametrar, såsom vinklar och avstånd mellan komplementära baser, kan hjälpa till att dechiffrera de exakta strukturella snedvridningar.

Den förmåga 3DNA programvara, som presenteras i protokoll 5, att omorientera relaterade molekyler i en gemensam referensram, avslöjar egenskaper övergripande struktur dolda i många av de filer som finns lagrade i det preliminära budgetförslaget. Till exempel producerar den konventionella inriktningen av besläktade strukturer på grundval av en root-mean-square passning av motsvarande atomer en rad liknande rumsliga banor thatt överlagra ungefär på varandra, här de tio NMR-baserade modeller av O3 DNA operatören bunden till överstycken i Lac repressorproteinet ¹² (Figur 4 vänster). Överlagring av samma strukturer på ett gemensamt koordinatsystem ram på 5'-terminala baspar för varje duplex avslöjar betydande snedvridning av den globala struktur, i vilken molekylerna flex märkbart olika riktningar (figur 4 till höger). Den strukturella variation kan påverka den lätthet med vilken Escherichia coli Lac repressorprotein binder O3 och inducerar en slinga mellan O3 och sekventiellt avlägsna aktörer i lac operonet ^24.

De steg som beskrivs i protokoll 6, för att bygga modeller av långa DNA-fragment dekorerade på godtyckliga platser med proteiner och andra ligander, tillför ett nytt perspektiv på organisation av stora makromolekylära församlingar. Sådana modeller hjälper till att förstå hur Multi-molekylära komplexinteragera under biologisk behandling. Såsom illustreras i figur 6 kan den exakta placeringen av ett arkitektoniskt protein som Hbb ha en dramatisk effekt på den totala vikningen av DNA. Om två kopior av den kända högupplöst struktur ⁸ är separerade av 43 baspar, sluter en 81-base-pair DNA-fragmentet i en tät, nästan stängt konfiguration. Om de två proteinerna separeras med ytterligare fem baspar, följer DNA en öppen, slingrande väg. De mycket olika arrangemang av proteinet dekorerade duplex visar hur avståndet mellan arkitektoniska proteiner kan påverka cykliserings eller looping av DNA ^{25, 26.}

Figur 1. Variation av rullen vinkeln mellan successiva baspar (se insats för visuell skildring) längs DNA chai bundet till HBB proteinet från Borrelia burgdorferi ^8. erhållna värden med "analysera" behärskar 3DNA och de strukturella data som beskrivs i protokoll 2. Notera de extrema värdena för vals vid AT steg som fäste den mittersta av strukturen.

Figur 2. Ungefärliga atomära modeller av konstruerade DNA med hjälp av "återuppbygga" funktion 3DNA och framfört i PyMOL med färgkodade atomer (C-cyan, N-blue, O-red, P-guld). Modeller baserade på (vänster) den styva kroppen steg parametrar Hbb protein och (höger) en modifierad uppsättning steg parametrar, där de två största värdena av omröstningarna har satts till noll. Se protokoll 3 till steg-för-steg-instruktioner . Notera vilket utvecklingen av DNA inducerad av de pålagda förändringar i rulle.

Figur 3. Mosaik bilder av rullningsvinklar längs DNA i två uppsättningar av simulerade strukturer ^11. Värden på rulle, extraherade med protokoll 4, är färgkodade från blått till rött över intervallet [-5 °, 20 °]. Notera i omvänd ordningsföljd i baser och stora värden på rulle som markeras av gula / röda kolonner, som uppstår vid pyrimidin-purin etapperna i de båda 14 själv-komplementära baspar sekvenser.

Figur 4. Tecknade bilder av de DNA-modellerna som finns i NMR-härledda strukturer O3 DNA operatör med lac repressorprotein överstycken ¹² belysande för kapacitetav "x3dna_ensemble omorientera" kommandot. Images utförda i PyMOL (ryggrader visas som guld tuber och baser som blå pinnar) och riktas upp med (vänster) koordinaterna i det preliminära budgetförslaget post (2kek) och (höger) den strukturella superposition presenteras i protokoll 5 . Notera de stora skillnaderna bland strukturerna när den placeras i en gemensam referensram på den 5'-terminala baspar.

Figur 5. Skärmdump från w3DNA webbservern illustrerar specifikationer av DNA-sekvensen (Etikett 1), den spiralformade form av obundet DNA (Etikett 2), de positioner och identiteter av proteiner (Label 3), och förhandsgranskningen kryssruta (Label 4) beskrivs i protokoll 6. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 6. Ungefärliga atomära modeller av två HBB proteiner ⁸ bundna till en lång DNA-fragment. Strukturer som skapas med w3DNA webbserver som beskrivs i protokoll 6 och återges i PyMOL. De proteinkedjor är show som violetta band under det att DNA färgas-kodas för atom typ (C-cyan, N-blått; O-röd, P-guld). Den centrala baspar av varje protein-bindningsställen är satt vid positioner (vänster) 20 och 62 längs 81 baspar DNA-kedja och (höger) 20 och 67 längs 86 baspar DNA-kedjan. Notera den stora förändringen i vikningen av konstruktioner i samband med den ökade (fem baspar) förskjutning av de två proteinerna.

Discussion

Den uppsättning protokoll presenteras i denna artikel endast vidröra på funktionerna i det 3DNA svit av program. Verktygen kan tillämpas på RNA-strukturer för att identifiera icke-kanoniska baspar, för att bestämma de sekundära strukturella sammanhang där sådan parning sker, för att kvantifiera den rumsliga dispositionen av spiralformade fragment, för att mäta överlappningen av baser längs kedjan ryggraden etc. Ombyggnaden Kommandot tillåter användaren att konstruera enkla och informativa blockera representationer av baserna och baspar ut som i den infällda figur 1. Byggnaden verktyg även inkludera funktioner till "tråd" olika sekvenser på en viss strukturell mall, för att generera modeller av många dubbel-, trippel-, och fyra DNA-strukturer, att orientera modeller i en viss riktning, etc. Slutligen har 3DNA spelat en viktig roll i ett antal andra projekt, såsom: SWS solvatisering webbtjänst för nukleinsyror ^27, ARTS webbserver förinriktande RNA tertiärstrukturer ^28, den MDDNA webbaserat verktyg för analys av molekylära dynamik resultat och struktur förutsägelse ^29, kolja informationen driven protein-DNA dockning metoden ^30, SARA-servern för funktion anteckning av RNA-strukturer ^31, 3D- DART DNA strukturmodulering server ^32, 3D-footprint databas för strukturell analys av protein-DNA-komplex ^33, RNA FRABASE 2.0-databas för identifiering av tredimensionella fragment inom RNA-strukturer ^34, och setter webbserver för den parvisa jämförelsen av RNA-strukturer ^35. Så vitt vi vet finns det för närvarande ingen annan nukleinsyra-syra struktur programpaket med en jämförbar bred kombination av funktioner och robust prestanda rekord av 3DNA.