D'analyser et de structures d'acides nucléiques avec 3DNA

Summary

Le logiciel 3DNA est un outil bioinformatique populaire et polyvalent avec des capacités à analyser, construire et visualiser des structures d'acides nucléiques en trois dimensions. Cet article présente des protocoles détaillés pour un sous-ensemble de fonctionnalités nouvelles et populaires disponibles dans 3DNA, applicables aux deux structures individuelles et des ensembles de structures connexes.

Abstract

Le logiciel 3DNA est un outil bioinformatique populaire et polyvalent avec des capacités à analyser, construire et visualiser des structures d'acides nucléiques en trois dimensions. Cet article présente des protocoles détaillés pour un sous-ensemble de fonctionnalités nouvelles et populaires disponibles dans 3DNA, applicables aux deux structures individuelles et des ensembles de structures connexes. Protocole 1 répertorie l'ensemble des instructions nécessaires pour télécharger et installer le logiciel. Elle est suivie, dans le protocole 2, par l'analyse de la structure des acides nucléiques, y compris l'attribution de paires de bases et la détermination des paramètres de corps rigides qui décrivent la structure et, dans le protocole 3, par une description de la reconstruction d'un atome modèle d'une structure à partir de ses paramètres de corps rigides. La version la plus récente de 3DNA, version 2.1, comporte de nouvelles fonctionnalités pour l'analyse et la manipulation d'ensembles de structures, tels que ceux déduits de résonance magnétique nucléaire mesures (RMN) et la dynamique moléculaire (MDSimulations); ces caractéristiques sont présentées dans les protocoles 4 et 5. En plus du progiciel autonome 3DNA, le serveur Web w3DNA, situé à http://w3dna.rutgers.edu , fournit une interface conviviale pour les fonctions sélectionnées du logiciel. Protocole n ° 6 montre une nouvelle fonctionnalité du site pour construire des modèles de molécules d'ADN longues ornées de protéines liées à des endroits spécifiés par l'utilisateur.

Introduction

Comprendre les structures tridimensionnelles de l'ADN, l'ARN et leurs complexes avec des protéines, des médicaments et d'autres ligands, est essentielle pour déchiffrer leurs fonctions biologiques différentes, et pour permettre la conception rationnelle de médicaments. Exploration de ces structures comporte trois composantes distinctes, mais étroitement liés: l'analyse (pour extraire des motifs dans les formes et les interactions), la modélisation (pour évaluer l'énergétique et la dynamique moléculaire) et la visualisation. Analyse structurale et la construction de modèles sont essentiellement deux faces d'une même pièce de monnaie, et la visualisation des compléments deux d'entre eux.

La suite 3DNA des programmes d'ordinateur est une boîte à outils bioinformatique structurale de plus en plus populaire avec des capacités à analyser, construire et visualiser des structures d'acides nucléiques en trois dimensions. Publications antérieures ont décrit les capacités du logiciel ^1, à condition que les recettes d'effectuer des tâches sélectionnées ^2, introduit l'interface basée sur le Webà des fonctions populaires du logiciel ^3, bases de données présentées de caractéristiques structurelles recueillies à l'aide 3DNA ^{4, 5} et illustré l'utilité du logiciel dans l'analyse de l'ADN et l'ARN structures ^{6, 7.}

Le but de cet article est de mettre le kit de logiciel 3DNA aux scientifiques de laboratoire et d'autres qui ont des intérêts et / ou des besoins d'enquêter sur l'ADN et l'ARN organisation spatiale avec des outils informatiques state-of-the-art. Les protocoles présentés ici comprennent des instructions étape-par-étape (i) pour télécharger et installer le logiciel sur un système Mac OS X, (ii-iii) d'analyser et de modifier les structures de l'ADN au niveau des étapes de paires de bases constitutives ( iv-v) d'analyser et d'aligner des séries de structures d'ADN apparentées, et (vi) pour construire des modèles de chaînes d'ADN en protéines décoré de l'interface web conviviale w3DNA. Le logiciel a la capacité d'analyser des structures individuelles résolus en utilisant des méthodes de cristallographie aux rayons X ainsi que de grandesdes ensembles de structures déterminées par des méthodes résonance magnétique nucléaire (RMN) ou produite par des techniques de simulation sur ordinateur.

Les structures examinées ici figurent (i) la structure cristalline à haute résolution de l'ADN lié à la protéine Hbb de Borrelia burgdorferi ⁸ (la bactérie transmise par les tiques qui cause la maladie de Lyme chez les humains ^{9, 10),} (ii) deux grands ensembles de manière séquentielle molécules d'ADN apparentées produites par des simulations moléculaires ¹¹ - 4500 instantanés de D (GGCAAAATTTTGCC) ₂ et d (CCGTTTTAAAACGG) ₂ collectées à des incréments de 100 ps pendant les calculs, et (iii) d'un petit ensemble de structures de l'opérateur de l'ADN O3 RMN à base lié aux coiffes de l'Escherichia coli Lac répresseur protéique ^12. Les instructions ci-dessous contiennent des informations sur la façon d'accéder aux fichiers de coordonnées atomiques associés à chacune de ces structures ainsi que la façon d'utiliser 3DNA (une copie de ce fichier se trouvesur le forum 3DNA à http://forum.x3dna.org/jove ) pour examiner et modifier ces structures.

Protocol

1. L'installation du progiciel

1. Connectez-vous au site Web 3DNA à http://x3dna.org et cliquez sur le lien vers le forum 3DNA. Dans le cadre du Forum sélectionnez le lien «Inscription» et suivez les instructions pour créer un nouveau compte.
2. L'installation du détail des instructions suivantes du logiciel sur un ordinateur Macintosh OS X avec shell 'bash' un défaut. La procédure pour les systèmes Linux ou Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) avec des coquilles couramment utilisés (y compris 'tcsh') se trouve au sein du Forum 3DNA.
3. Une fois que vous avez créé un nom d'utilisateur et mot de passe, connectez-vous au Forum. Sélectionnez le lien «Téléchargements de la section d'accueil et sur la page Choisir un nouvel '3 téléchargement d'ADN. Cela vous amènera à la page de téléchargement 3DNA où différentes versions du logiciel peuvent être téléchargées.
4. Sélectionnez l'OS X Intel Mac lien pour télécharger un fichier d'archive compressé (tar.gz) contenant le logiciel.
5. Double click sur le fichier (tar.gz) pour créer un dossier nommé x3dna-v2.1. Ce dossier, qui contient la suite logicielle 3DNA, peut être déplacé n'importe où. Aux fins de cette recette, nous glisser-déposer dans le dossier 'Applications'. A ce stade, vous avez terminé avec le fichier tar.gz et vous pouvez le supprimer.
6. Ouvrez l'application Terminal, généralement dans la section «Utilitaires», et accédez au répertoire x3dna-v2.1 créé à l'étape 5 en utilisant la commande suivante (terminé ici et dans toutes les instructions ci-dessous par un retour chariot):
   cd / Applications/x3dna-v2.1
7. Exécutez le script de configuration nécessaire pour 3DNA pour fonctionner correctement en tapant:
   ./bin/x3dna_setup
8. Copier les paramètres d'exportation à deux lignes imprimées à l'étape 7. Si l'utilisateur a placé le logiciel dans le dossier 'Applications', les deux lignes doivent apparaître comme suit:
   exportation X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
   export PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
   Un autre mot d'ailleurs "Applications" sera Appear dans la commande d'exportation si l'utilisateur a choisi d'installer le logiciel dans un répertoire différent. Cet autre nom de répertoire remplacera 'Applications' dans les deux commandes ci-dessus. Notez que si le shell par défaut est 'tcsh' au lieu de 'bash', le contenu des deux lignes serait: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 et setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin $ PATH.
9. Arrivée «Finder» pour voir si un fichier nommé '. Bashrc' existe déjà sur votre ordinateur.
10. Ouvrez l'application TextEdit trouvé dans le dossier 'Applications' et sélectionnez 'Make Plain Text' dans le menu 'Format'.
11. Si le fichier '. Bashrc' de l'étape 9 existe, ouvrez le fichier dans TextEdit et coller les paramètres d'exportation à partir de l'étape 8 à la fin du fichier. Si le fichier quitte pas ». Bashrc», collez les paramètres d'exportation de l'étape 8 dans un fichier vierge et enregistrez avec le nom du fichier. Bashrc 'dans votre répertoire home. (Le répertoire de base est représentée par une icône «maison» sur le Macintosh.)
12. Pour que les nouveaux paramètres be disponible, vous devez exécuter le fichier nouvellement enregistré »bashrc. utilisant la commande suivante dans le Terminal programme:
    la source ~ /. bashrc
13. La suite 3DNA est maintenant installé sur votre système et vous pouvez effectuer des Protocoles 2-5 dans le programme Terminal. Protocole 6 est effectué en utilisant w3DNA, une interface web pour les fonctions sélectionnées du logiciel 3DNA.

2. Analyse d'une structure de cristal

1. Nous illustrons l'analyse d'une structure d'acide nucléique en utilisant l'ADN lié à la protéine Hbb de Borrelia burgdorferi ^8. Le fichier de coordonnées atomiques associés à cette structure peut être trouvé à la banque de données Protein ¹³ (APB; http://www.rcsb.org ), où il est affecté à la 2np2 identifiant structurel. Les données supplémentaires ci-joints comprennent une copie de ce fichier, qui peut également être trouvé sur le Forum 3DNA à http://forum.x3dna.org/jove.
2. La première étape de l'analyse 3DNA de la structure est la création d'un fichier qui répertorie toutes les bases appariées. Cela se fait avec le programme «find_pair» en tapant la commande suivante:
   find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
   Voici 2np2.pdb est le fichier d'entrée de coordonnées atomiques décrites ci-dessus et 2np2.bps est le fichier texte de sortie qui contient les informations d'appariement de bases. Ce dernier fichier de paires de bases peut être examiné et modifié par l'utilisateur si nécessaire.
3. L'étape suivante de l'analyse consiste à déterminer les paramètres géométriques qui caractérisent la structure. Il s'agit notamment des angles de torsion chimiques standard ^14, angles de PseudoRotation qui décrivent le plissement de la bague de sucre ^15, les paramètres corps rigides qui précisent les modalités de bases et de paires de bases successives ^{de 16,} et d'autres mesures de structure chimique tridimensionnelle. La commande 'analyser' prend en entrée le fichier de paires de bases généré à l'étape 2 et crée plusieurs UOtput fichiers qui apparaissent dans le répertoire de travail actuel. Ces valeurs sont calculées en tapant la commande suivante:
   analyser 2np2.bps
   Les fichiers de sortie utilisées ici comprennent 2np2.out, qui contient un aperçu des paramètres calculés, et bp_step.par, qui contient une liste des corps rigides paramètres décrits ci-dessus. Ce dernier fichier peut être lu facilement dans un tableur pour une analyse approfondie et de complot. Voir les résultats représentatifs (figure 1) pour un exemple.

3. Construction d'une structure d'ADN à partir des paramètres de corps rigide

1. En plus de l'analyse d'une structure d'acide nucléique, le logiciel 3DNA offre la possibilité de construire un modèle structurel à partir des paramètres de corps rigides en utilisant la commande «reconstruction». Dans ce protocole, nous montrons comment construire deux modèles hélicoïdaux d'ADN, d'abord en utilisant les paramètres de corps rigide du complexe Hbb-ADN tel que calculé dans le protocole 2, puis en utilisant un ensemble modifié des paramètres dans wuels angles de roulis sélectionnés sont modifiés. L'angle de roulis de mesurer le degré de flexion de paires de bases consécutives dans les rainures de l'ADN ^16. Les valeurs positives de rouleau sont associées à un rétrécissement de la rainure principale et les valeurs négatives avec le rétrécissement de la rainure mineure. L'image de référence étalon ¹⁷ adoptée par un logiciel d'analyse d'acide nucléique populaire 3DNA et autres, par exemple les courbes + ^18, assure la cohérence numérique dans les paramètres calculés de paires de bases Watson-Crick.
2. Par défaut, la fonction 3DNA 'Reconstruction' va créer des modèles atomiques exactes qui ne contiennent que les coordonnées des atomes dans les bases azotées. Afin de créer un modèle atomique approximative, qui comprend les coordonnées de deux colonne vertébrale et les atomes de base, tapez la commande suivante:
   x3dna_utils cp_std BDNA
   Cette commande indique 3DNA d'introduire un squelette conformation ADN-B standard dans la construction de modèles de paramètres de corps rigides.
3. Pour build un modèle en double hélice avec les paramètres corps rigides trouvés dans la structure Hbb-ADN, tapez la commande suivante:
   reconstruire atomique bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
   Voici atomique 'spécifie la construction d'un modèle tout-atome avec coordonnées atomiques pour tous (non-hydrogène) des atomes lourds,' bp_step.par 'est le fichier généré à l'étape 3 du protocole n ° 2, qui contient les paramètres de corps rigides saisies , et '2 np2_rbld_org.pdb 'est le fichier de sortie avec les coordonnées atomiques de la structure créée. Ce dernier fichier est formaté en conformité avec les spécifications de l'APB et se termine donc avec ». Pdb.
4. Le fichier 'bp_step.par' peut être modifié pour produire une structure modifiée. Sur un Macintosh, les modifications peuvent être effectuées à l'aide de l'application TextEdit, comme décrit dans le protocole 1 Étape 10.
5. Ici, nous modifions les angles de roulis extrêmes formées sur les deux sites de plus grande courbure. Les valeurs qui sont exprimées en degrés, sont modifiés à zéro à partir des valeurs de 64,95 dans la ligne 17 et 60.93 Dans la ligne 26. Nous sauvegardons le fichier modifié avec un nouveau nom, «bp_step_roll0.par», et fermez le programme TextEdit.
6. Nous construisons la structure, comme dans l'étape 3, avec l'ensemble modifié des paramètres d'étape que le fichier d'entrée en tapant:
   reconstruire atomique bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
7. Les deux modèles peuvent être visualisés dans un visualiseur moléculaire standard, comme PyMOL ( www.pymol.org ), en utilisant les fichiers de coordonnées générés (. pdb) en entrée. Voir les résultats représentatifs (figure 2) pour des images des structures reconstruites.

4. Analyse des fichiers de structure multi-modèle

1. Contrairement au protocole n ° 2, dans lequel nous analysons une structure unique contenant de l'acide nucléique, ici nous montrons comment analyser un vaste ensemble de structures. On examine la variation dans le temps des paramètres de corps rigide le long d'une série de chaînes d'ADN de 14 paires de bases obtenu à partir de dynamique moléculaire (MD) simulations ¹¹ http://forum.x3dna.org/jove .
2. La première étape de l'analyse est la même que celle effectuée dans le protocole 2, l'identification des bases appariées en lançant le programme «find_pair». Depuis l'ensemble des structures partage le même système d'appariement de base on a besoin pour exécuter 'find_pair' une seule fois sur un fichier représentant. Ici, nous choisissons la structure 1001e dans la simulation des chaînes d'ADN contenant une centrale à l'étape, avec le nom du fichier md_AT_set1.pdb.1001. Les genres d'instruction suivanteTES les informations d'appariement de base et les stocke dans les md_AT_set1.bps de fichiers:
   find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
   L'utilisateur peut examiner la base identifiée éplucher et effectuer des modifications manuelles dans le fichier basé sur la connaissance de la structure.
3. L'étape suivante consiste à déterminer les paramètres géométriques de l'ensemble des structures utilisant la "x3dna_ensemble analyser« commandement. Le programme utilise en entrée le fichier de paire de bases générées à l'étape 2 (md_AT_set1.bps) ainsi que d'un fichier contenant la liste des structures à analyser. Ce dernier fichier, appelé ici md_AT_set1.list, contient les 4500 fichiers à analyser, avec les noms de fichier entrées sur des lignes individuelles dans l'ordre générée par la simulation MD. Une copie de ce fichier est inclus dans les documents supplémentaires et a également proposé au Forum 3DNA. L'utilisateur doit être averti, en raison du grand nombre de fichiers, que le temps de calcul peut être longue (~ 20 min pour 1.000 fichiers sur un processeur AMD Phenom II X4 965). Thcommande électronique est géré par tapant la commande suivante:
   x3dna_ensemble analyser md_AT_set1.bps-b-l md_AT_set1.list-o md_AT_set1.out
   Dans l'exemple ci-dessus se rapporte '-B' pour le fichier de paires de bases créé à l'étape 2, '-l' précise que la liste des fichiers est donné, et '-o' permet à l'utilisateur d'attribuer un nom au fichier de sortie. Il ya plusieurs options qui peuvent être utilisées en conjonction avec la commande 'x3dna_ensemble analyser », comme la sélection de modèles spécifiques. L'utilisateur peut taper 'analyser x3dna_ensemble-h' pour obtenir plus d'informations sur ces options.
4. L'étape suivante consiste à extraire les paramètres rigide-corps désiré à partir du fichier de sortie de survol, md_AT_set1.out, généré à l'étape 3. Ceci est réalisé en utilisant la commande 'extrait x3dna_ensemble ». Une liste des paramètres géométriques disponibles peut être trouvée en tapant 'x3dna_ensemble extrait-l'. Ici, nous extrayons les angles de roulis et de créer un fichier texte séparé par des virgules (CSV) des angles de roulis avec la commande suivante:
   x3dna_ensemble extrait-proll-s,-f-o md_AT_set1.out md_AT_set1_roll.csv
   Le roll-p 'dans cette commande spécifie le paramètre à extraire le «-s,', signifie un fichier séparé par des virgules le '-f', désigne le fichier de sortie obtenu à partir de l'ensemble commande analyser, et le«-o 'permet à l'utilisateur de nommer le fichier de sortie CSV des angles de roulis long de l'ADN dans toutes les structures analysées. Ce fichier peut être lu dans d'autres programmes pour une analyse approfondie et de complot. Voir les résultats représentatifs (figure 3) pour l'analyse de la variation de rouler dans les deux ensembles de données MD générées décrites ci-dessus et le Forum 3DNA pour le script MATLAB utilisée pour produire ces images.

5. Superposition des structures multi-modèle sur un cadre de référence commun

1. La version la plus récente de 3DNA (version 2.1) a une nouvelle fonctionnalité qui permet à un utilisateur de regarder plusieurs structures à partir d'une perspective commune. Le «x3dna_ensemble réorienter» commande superpose une collection de structur connexees sur une paire de base commune ou de l'étape de paire de bases. Le protocole suivant s'applique cette capacité pour les structures RMN dérivés de l'opérateur d'ADN O3 lié aux coiffes du répresseur protéique Lac ^12. Ces structures sont stockées à l'APB sous la 2kek d'identification dans un fichier de structure multi-modèle, qui contient tous les modèles de structure dans un seul fichier, par opposition à des fichiers séparés comme ceux utilisés pour chacun des modèles 4500 du protocole 4. Les données supplémentaires ci-joints comprennent une copie de ce fichier, qui peut également être trouvé sur le Forum 3DNA à http://forum.x3dna.org/jove .
2. Comme dans les précédents protocoles, la première étape consiste à calculer l'appariement de bases de l'ADN avec le programme «find_pair». Dans ce cas, nous utilisons en entrée le fichier '2 kek.pdb »et tapez la commande suivante:
   find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
   L'appariement de base est généré en utilisant le premier modèle dans le fichier pdb. Corrections manuelles dans le b émis en sortiefichier ase-pair, '2 kek.bps », peut être fondée sur la connaissance de la structure.
3. Le programme «x3dna_ensemble réorienter» alignera les modèles individuels dans une structure multi-modèle sur un cadre de référence commun. Ce programme nécessite à la fois le fichier pdb et le fichier de base de couplage de l'étape précédente comme entrée et est géré avec la commande suivante:
   x3dna_ensemble réorienter-b 2kek.bps-f 1-e 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
   Ici l'option '-b' désigne le fichier de base de couplage de la '-f 1', représente la paire de base sur laquelle toutes les structures sont alignées, dans cette paire de base de boîtier 1 à l'extrémité 5 'du brin séquence-palier, le '-e' indique le fichier d'ensemble d'entrée, et le '-o' permet à l'utilisateur de fournir un nom de fichier de sortie, dans ce cas '2 kek_fr1.pdb ». Plus d'informations sur les options de commande peut être obtenue par 'x3dna_ensemble réorienter-h' frappe. Voir les résultats représentatifs (figure 4) pour la discussion des structures alignées.

6. Construction d'une protéine-décoré molécule d'ADN

1. L'interface web w3DNA comprend quelques fonctions populaires du progiciel 3DNA. Ici, nous attirons l'attention sur la capacité de construire des modèles tridimensionnels de protéines décoré ADN avec le serveur web. Les fragments d'ADN liés à adopter les paramètres de corps rigides des complexes ADN-protéines sélectionnées, voici les valeurs de l'ADN lié à la protéine Hbb analysé dans le protocole 2. Les régions non reliées de l'ADN peut adopter l'une des trois formes hélicoïdales sélectionnées par l'utilisateur (A, B, ou C). Le A, B et C se rapportent à trois modèles canoniques de l'ADN, obtenus à partir des expériences de diffraction début de fibres, avec respectivement 11, 10 et 9 paires de bases par tour de la double hélice ^{de 19 à 21.}
2. La première étape dans la construction d'un modèle de l'ADN aux protéines est décorée à visiter le site w3DNA situé à http://w3dna.rutgers.edu . Sélection de «reconstruction» dans le menu en haut à gauche de la page actiVATES les capacités de création de modèle en ligne.
3. L'étape suivante consiste à sélectionner le lien «modèle ADN-protéines Bound 'trouvé dans la boîte légèrement ombragée dans le milieu de la nouvelle page. Cette sélection va activer un menu déroulant qui permet à l'utilisateur de spécifier le nombre de protéines liées. Ici nous sélectionnons deux protéines liées et cliquez sur le bouton «Continuer». Notez que les modèles sont limités en taille de 1000 paires de bases, ou 2.000 nucléotides, et une trentaine de protéines liées.
4. Le choix du nombre de protéines liées conduit à une page de spécification similaire à celle représentée sur la figure 5. Cette page permet à l'utilisateur de spécifier la séquence de l'ADN, la forme hélicoïdale de l'ADN non lié, et l'identité et la localisation des protéines liées.
5. Les types d'utilisateurs ou des pâtes dans l'ordre désiré dans la zone de texte au milieu de la page des spécifications (Figure 5, étiquette 1). Notez que des résidus standards - A, T, C, G et U - sont acceptées. Nous entrons ici dans un hom paires de bases 81opolymer, composée entièrement de A · paires T avec le A dans le brin séquence de procréer.
6. Il ya un menu déroulant (Figure 5, étiquette 2), en dessous de la zone de texte, de sélectionner la conformation hélicoïdale des régions non reliées de l'ADN. Dans cet exemple, nous choisissons la forme B conformation.
7. Il ya une zone de texte au bas de la page des spécifications pour entrer dans la position de reliure (s) et nom de fichier (s) de la protéine liée (s) (Figure 5, Label 3). La position de liaison spécifiant l'emplacement du centre du fragment lié à une protéine sur la séquence d'ADN. Si l'ADN lié contient un nombre impair de paires de base, comme dans la structure Hbb-ADN, la position de reliure dénote l'emplacement de la paire de bases milieu du fragment. Dans le cas de l'ADN Hbb-lié, cette paire de base du milieu est un T · T mésappariement. Dans cet exemple, où nous lions deux copies de la protéine Hbb à la matrice d'ADN, le T · T paire est placée à des positions 20 et 63 des 81 paires de bases d'ADN sequence. Notez que la séquence du fragment lié n'a pas à coïncider avec celui entré à l'étape 5. Si la région lié à une protéine contient un nombre pair de paires de bases, la position de reliure dénote l'emplacement de l'étape de base, une paire moyenne sur l'ADN. Autrement dit, l'étape de paires de bases du fragment central relié est placé entre les paires de bases n et n +1, où n est le nombre spécifié le long du segment. Notez également que l'utilisateur peut décorer l'ADN avec toute protéine tant que la structure de son complexe avec l'ADN est connue et stockée au format PDB norme ^13.
8. Au bas de la page des spécifications il ya une case qui permet à l'utilisateur de générer un aperçu de l'ADN à la protéine (figure 5, Étiquette 4). Ici, nous vérifions que la case et cliquez sur le bouton «Continuer». Cette action génère une page de vérification énumérant les paramètres sélectionnés ainsi que les erreurs qui ont pu surgir à partir de la superposition des sites de liaison sélectionnés. L'utilisateur peut seCours sur le bouton «Retour» si des modifications doivent le bouton 'Build' pour continuer faire ou.
9. La page suivante affiche une image statique du complexe ADN-protéine dans sa formule la plus étendue et permet une visualisation interactive en ligne via Jmol et Webmol. L'utilisateur peut également télécharger un (. Pdb) de coordonnées qui est formaté en conformité avec les spécifications de l'APB. Cela se fait en sélectionnant le «Télécharger le fichier pdb reconstruit 'lien ci-dessous l'image générée. Ce dernier fichier peut être lu facilement dans un programme graphique moléculaire pour de plus amples visualisation. Voir les résultats représentatifs (figure 6) pour des exemples de l'ADN Hbb décorées décrites ci-dessus et une chaîne un peu plus longue (86 paires de bases) avec le Hbb centré sur des positions 20 et 67.

Representative Results

Les outils logiciels 3DNA sont couramment utilisés pour analyser les structures d'acides nucléiques. Par exemple, les identités des paires de base et des paramètres de corps rigides qui caractérisent les agencements des bases en fragments double hélice d'ADN et de structures d'ARN sont automatiquement calculées et stockées pour chaque nouvelle entrée dans la base de données de l'acide nucléique ^22, un stockage à travers le monde de l'information structurelle de l'acide nucléique. Les valeurs des paramètres de corps rigides fixées au protocole n ° 2 révèlent facilement distorsions dans la structure en trois dimensions, telle que les deux sites d'ADN extrême de flexion dans le sillon, avec de grands angles de roulis positifs (64,95 ° et 60,93 °), accessible au AT · Aux étapes 13 et 22 dans le complexe de cristal avec le Borrelia burgdorferi protéines Hbb ⁸ (Figure 1).

La capacité du logiciel à reconstruire les structures de ces quantités avec le protocole no 3, il est possible de déterminer comment, dansde base individuel et étapes de paires de bases contribuent à la fois moléculaire globale. Comme le montre la figure 2, la flexion globale de l'ADN induites par Hbb reflète plus que les deux distorsions de roulis extrêmes mentionnés ci-dessus. Cela signifie que l'ADN reste fortement courbée lorsque reconstruit avec ces étapes de paires de bases redressées, c'est à dire avec des angles de roulis nulles sur les deux sites. La même technique a déjà révélé les contributions des étapes de paires de bases et des déformations spécifiques à l'emplacement de la superhélice ADN enroulé sur la surface du noyau nucléosome particules ⁶ et à la largeur du sillon mineur de l'ADN lié à la bactérie-nucléoïde Fis de protéines associées ^23.

La nouvelle capacité dans 3DNA, décrit dans le protocole 4, d'examiner un grand nombre de structures connexes, il est possible d'extraire les deux séquences et modèles dépendant du temps dans les arrangements spatiaux de l'ADN simulé et molécules d'ARN. Par exemple, l'(jaune) colou-codage des angles d'enroulement entre les paires de bases successives dans deux grands ensembles de structures d'ADN simulées ¹¹ révèle la flexion préférentielle de ces molécules à des étapes de paires de bases pyrimidine-purine (figure 3). Les valeurs les plus élevées de rouleau, représentés en rouge, qui persistent pendant de courtes périodes à des extrémités de l'ADN sont évocateurs d'une fusion localisée et renaturation de la structure en double hélice. Les modèles variationnels d'autres paramètres corps rigides, tels que les angles et les distances entre les bases complémentaires, peuvent aider à déchiffrer les distorsions structurelles précises.

La capacité du logiciel 3DNA, présenté dans le protocole 5, de réorienter les molécules associées à un cadre de référence commun, révèle caractéristiques de la structure globale cachés dans la plupart des fichiers stockés dans l'APB. Par exemple, l'alignement classique des structures connexes sur la base d'un ajustement racine carrée moyenne des atomes correspondants produit une série de voies spatiales similaires tchapeau superposer à peu près les uns des autres, voici les dix modèles de l'opérateur d'ADN O3 RMN à base liés aux coiffes du répresseur protéique ¹² (Figure 4 gauche) Lac. La superposition de ces mêmes structures sur un système de coordonnées commun sur la paire de bases 5'-terminale de chaque duplex révèle des distorsions considérables de structure globale, dans laquelle les molécules fléchissent dans des directions sensiblement différentes (figure 4 à droite). La variabilité de structure peut influencer la facilité avec laquelle la protéine répresseur Lac coli Escherichia lie O3 et induit une boucle entre O3 et les opérateurs séquentielle éloignés dans l'opéron lac ^24.

Les étapes décrites dans le protocole no 6, pour construire des modèles de longs fragments d'ADN décorées dans des sites arbitraires avec des protéines et d'autres ligands, ajoute une nouvelle perspective sur l'organisation de grands assemblages macromoléculaires. Ces modèles permettent de comprendre comment les complexes multi-moléculairesinteragir pendant le traitement biologique. Comme le montre la figure 6, le positionnement précis d'une protéine architecturale comme Hbb peut avoir un effet dramatique sur le repliement global de l'ADN. Si deux copies de la structure à haute résolution connue ⁸ sont séparés par 43 paires de bases, un fragment d'ADN de 81 paires de bases ferme dans une configuration serrée presque fermé. Si les deux protéines sont séparées par un cinq paires de base supplémentaires, l'ADN ci-après, une voie sinueuse ouverte. Les très différentes dispositions de la protéine-décoré spectacle duplex comment l'espacement des protéines architecturales peuvent affecter la cyclisation ou la torsion de l'ADN ^{25, 26.}

Figure 1. La variation de l'angle de roulis entre les paires de base successives (voir insert de représentation visuelle) le long de l'ADN chadans lié à la protéine Hbb de Borrelia burgdorferi ^8. valeurs obtenues en utilisant la commande «analyser» de 3DNA et les données structurelles décrites dans le protocole 2. Remarque les valeurs extrêmes de roulis au niveau du au mesures que l'étrier de tiers central de la structure.

Figure 2. Modèles atomiques approximatives de l'ADN construit en utilisant la fonction «reconstruire» des 3DNA et rendu dans PyMOL avec des atomes de couleur (C-cyan, N-bleu; O-rouge; P-or). Les modèles basés sur (à gauche), les paramètres de l'étape de corps rigide de la protéine Hbb et (à droite) un ensemble modifié de paramètres de l'étape, où les deux plus grandes valeurs de roulis ont été mis à zéro. Voir Protocole n ° 3 pour les instructions étape-par-étape . Notez le déroulement de l'ADN induites par les changements imposés en rouleau.

Figure 3. images de mosaïque des angles de roulis long de l'ADN dans deux ensembles de structures simulées ^11. Valeurs de roulis, extraites à l'aide du protocole 4, le code couleur du bleu au rouge sur la plage [-5 °, 20 °]. Notez l'ordre inverse de bases et les grandes valeurs de roulis, mis en évidence par des colonnes jaunes / rouges, qui se produisent lors des étapes pyrimidine-purine dans les deux séquences 14 de base de paires auto-complémentaires.

Figure 4. images de dessin animé des modèles d'ADN trouvées dans les structures RMN dérivés de l'opérateur d'ADN O3 avec le Lac coiffes de protéine répresseur ¹² illustrant les capacitésdes «x3dna_ensemble réorienter 'command. Images rendus dans PyMOL (backbones montrent que les tubes d'or et les bases que des bâtons bleus) et aligné avec (à gauche) les coordonnées dans l'entrée PDB (2kek) et (à droite) la superposition structurelle présentée dans le protocole 5 . Noter les grandes différences entre les structures lorsqu'elle est placée dans un cadre de référence commun à la paire de bases 5'-terminale.

Figure 5. Capture d'écran du serveur Web w3DNA illustrant les spécifications de la séquence d'ADN (label 1), la forme hélicoïdale de l'ADN non lié (étiquette 2), les positions et les identités des protéines (Label 3), et la case à cocher image d'aperçu (label 4) décrit dans le protocole 6. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 6. Modèles atomiques approximatives de deux protéines HBB ⁸ liés à un fragment d'ADN de long. Des structures créées avec le serveur Web w3DNA tel que décrit dans le protocole 6 et rendu dans PyMOL. Les chaînes de protéines sont show comme des rubans violets alors que l'ADN est de couleur codé par type atome (C-cyan, N-bleu; O-rouge; P-or). La paire centrale de base de chacun des sites de liaison aux protéines est fixé à positions (à gauche) 20 et 62 le long de la chaîne d'ADN paires de bases 81 et (droite) 20 et 67 le long de la chaîne d'ADN 86 paires de bases. Notez le changement majeur dans le pliage des structures associées à l'accroissement (cinq paires de bases) déplacement des deux protéines.

Discussion

L'ensemble des protocoles présentés dans cet article ne touche pas les possibilités offertes par la suite 3DNA des programmes. Les outils peuvent être appliqués à l'ARN des structures à identifier des paires de bases non canoniques, afin de déterminer les contextes de structure secondaire dans lequel une telle appariement se produit, afin de quantifier la disposition spatiale des fragments hélicoïdaux, pour mesurer le recouvrement de base le long du squelette de la chaîne, etc La commande de reconstruction permet à l'utilisateur de construire des représentations de blocs simples et informatifs des bases et des paires de base tel que représenté dans l'encart à la figure 1. Les outils de construction comprennent également des éléments à «thread» des séquences différentes sur un modèle structural donné, pour générer des modèles de nombreuses structures d'ADN double, triple, et à quatre brins, les modèles orienter dans une direction spécifique, etc Enfin, 3DNA a joué un rôle important dans un certain nombre d'autres projets, tels que: le service web de solvatation SwS pour les acides nucléiques ^27, le serveur Web pour ARTSl'alignement des structures tertiaires d'ARN ^28; l'outil MDDNA basé sur le Web pour l'analyse des résultats de dynamique moléculaire et la structure prédiction ^29, le haddock axée sur l'information méthode d'amarrage protéine-ADN ^30, le serveur de la LEP pour fonction d'annotation de structures d'ARN ^31; la 3D ADN DART structure de serveur de modélisation ^32; la base de données 3D-empreinte pour l'analyse de la structure des complexes protéine-ADN ^33; la base de données d'ARN FRABASE 2,0 pour l'identification de fragments tridimensionnelles au sein des structures d'ARN ³⁴ et le serveur Web de définition pour cette comparaison par paires de structures d'ARN ^35. Au meilleur de notre connaissance, il n'existe actuellement aucun autre logiciel structure de l'acide nucléique avec une large association de fonctions et le bilan solide performance de 3DNA.