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3DNAを有する核酸構造の分析と構築

Published: April 26, 2013 doi: 10.3791/4401
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry & Chemical Biology and BioMaPS Institute for Quantitative Biology, Rutgers - The State University of New Jersey, 2Department of Biological Sciences, Columbia University

Summary

3DNAソフトウェアパッケージは、解析構成し、三次元の核酸構造を可視化する機能を備えた人気があり、汎用性の高いバイオインフォマティクスツールである。この記事では、個々の構造と関連構造のアンサンブルの両方に適用3DNAで利用可能な新しい、人気の機能のサブセットのための詳細なプロトコルを提示します。

Abstract

3DNAソフトウェアパッケージは、解析構成し、三次元の核酸構造を可視化する機能を備えた人気があり、汎用性の高いバイオインフォマティクスツールである。この記事では、個々の構造と関連構造のアンサンブルの両方に適用3DNAで利用可能な新しい、人気の機能のサブセットのための詳細なプロトコルを提示します。プロトコル1は、ソフトウェアをダウンロードしてインストールするために必要な一連の命令を示しています。これは、塩基対の割り当てと、原子の再構成の記載により、プロトコル3で、構造を記述し、剛体パラメータの決定を含む核酸構造の分析により、プロトコール2において、続くその剛体パラメータから構造のモデル。 3DNAの最新バージョンは、2.1バージョンでは、このような核磁気共鳴（NMR）測定と分子動力学（MDから推定されるような構造のアンサンブルの分析と操作のための新しい機能を持っています）シミュレーション、これらの機能はプロトコル4と5に示されている。 3DNAスタンドアロンのソフトウェアパッケージに加えて、に位置w3DNA Webサーバ、 http://w3dna.rutgers.eduは 、ソフトウェアの選択された機能へのユーザーフレンドリーなインターフェースを提供します。プロトコル6は、ユーザーが指定した位置に結合したタンパク質で飾られた長いDNA分子のモデルを構築するためのサイトの新規な特徴を示しています。

Introduction

DNA、RNA、およびタンパク質、薬物、及び他のリガンドとの複合体の三次元構造を理解し、それらの多様な生物学的機能を解読するための、および治療の合理的な設計を可能にするために重要である。解析（形状や相互作用のパターンを抽出する）、モデリング（エネルギー論と分子動力学を評価する）、および視覚化：そのような構造の探査には、3つの独立した、まだ密接に関連のコンポーネントを必要とする。構造解析とモデル構築は、本質的に表裏一体であり、可視化は、それらの両方を補完するものです。

コンピュータプログラムの3DNAスイートは、分析し構築し、三次元の核酸構造を可視化する機能を備えた人気が高まって、構造バイオインフォマティクスツールキットです。以前の出版物は、ソフトウェア1の機能を概説し選択したタスク2を実行するためのレシピを提供する、Webベースのインターフェイスを導入しましたソフトウェア3の一般的な機能には、構造的特徴の提示のデータベースが使用して収集 3DNA 4,5およびDNAとRNAの構造6の両方の解析にソフトウェアの有用性を示すように、7。

この記事の目的は、最先端の計算ツールとDNAとRNAの空間組織を調査するために利益および/またはニーズに実験室の科学者や他の人に3DNAソフトウェアキットをもたらすことです。ここで紹介するプロトコルは、構成塩基対のステップのレベルでDNA構造を分析し、修正するためのMac OS Xシステムでは、（II-III）、（上のソフトウェアをダウンロードしてインストールするためのステップバイステップの手順（i）を含むIV-v）を分析し、関連するDNA構造のセットを揃え、および（vi）ユーザーフレンドリーw3DNA Webインターフェイスを持つタンパク質装飾DNAチェーンのモデルを構築しています。ソフトウェアは、個々の構造だけでなく、大型X線結晶学的方法を用いて解く分析する能力を有する核磁気共鳴（NMR）法を用いて測定又はコンピュータシミュレーション技術によって生成された構造のアンサンブル。

構造は、ここで（i）はボレリアブルグドルフェリ 8（ヒト9,10にライム病を引き起こすダニ媒介性細菌）、（ii）の順次の二つの大きなセットからHBBタンパク質に結合したDNAの高分解能結晶構造を含む調べDの4,500スナップショット（GGCAAAATTTTGCC）2およびd（CCGTTTTAAAACGG）2計算中100ピコ秒単位で収集し、O3のDNAオペレーターのNMRベースの構造の（ⅲ）小アンサンブル-分子シミュレーション11で生産関連DNA分子大腸菌 lacリプレッサータンパク質12のヘッドピースにバインドされた。以下の手順では、これらの構造のそれぞれに関連付けられた原子座標のファイルにアクセスするだけでなく、使い方を3DNA（このファイルのコピーが発見された方法に関する情報を含むで3DNAフォーラムhttp://forum.x3dna.org/jove ）これらの構造を調べ、変更することができます。

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Protocol

1。ソフトウェア·パッケージのインストール

  1. で3DNA Webサイトに接続http://x3dna.orgと3DNAフォーラムへのリンクをクリックします。フォーラム内で 'レジスタ "リンクを選択し、新しいアカウントを作成するための指示に従ってください。
  2. デフォルトの 'bashの'シェルとOS XベースのMacintoshコンピュータ上のソフトウェアの次の手順の詳細をインストール。一般的に使用されるシェル（ 'tcshの場合'を含む）と、LinuxまたはWindows（Cygwinは、MinGWの/ MSYS）システムのための手順は、3DNAフォーラム内にあります。
  3. ユーザー名とパスワードを確立したら、フォーラムにログインします。ようこそセクションおよび'3 DNAのダウンロード "を選択し、新しいページ上の 'ダウンロード'リンクを選択します。これは、ソフトウェアのさまざまなバージョンをダウンロードできる3DNAダウンロードページにあなたをもたらすでしょう。
  4. ソフトウェアを含む圧縮されたtarballファイル（tar.gz形式）をダウンロードするにはMac OS XのIntelのリンクを選択します。
  5. ダブルCLICx3dna-V2.1という名前のフォルダを作成する（tar.gz形式）ファイルにK。 3DNAソフトウェアスイートが含まれているこのフォルダは、任意の場所に移動することができます。このレシピの目的のために、我々は 'アプリケーション'ディレクトリにドラッグアンドドロップします。この段階では、tar.gzファイルが終了して、それを削除することができます。
  6. 通常は 'ユーティリティ'の下にある、ターミナルアプリケーションを開き、次のコマンドを入力します（ここでは、キャリッジリターンで以下の手順のすべてで終了）を使用して、ステップ5で作成x3dna-v2.1のディレクトリに移動します。
    CD / Applications/x3dna-v2.1
  7. 入力して、適切に機能するために必要な3DNAセットアップスクリプトを実行します。
    ./bin/x3dna_setup
  8. ステップ7で印刷2行エクスポート設定をコピーします。ユーザが 'アプリケーション'ディレクトリにソフトウェアを配置している場合は、2行は次のように表示されます：
    輸出X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    $ PATH：PATH = / Applications/x3dna-v2.1/binをエクスポート
    'アプリケーション'のほかに別の単語がAPPEますarはexportコマンドでは、ユーザは別のディレクトリにソフトウェアをインストールすることを選択している場合。この代替ディレクトリ名は、上記の二つのコマンドで "アプリケーション"を置き換えます。します。setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1とのsetenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin：$デフォルトのシェルではなく、 'bashの'の 'tcshの'の場合、二行の内容は次のようになりますので注意してくださいPATH。
  9. すでに '。bashrcに'という名前のファイルがコンピュータ上に存在するかどうかを確認するために 'Finderの "チェックインします。
  10. 'アプリケーション'ディレクトリにあるテキストエディットアプリケーションを開き、[形式]メニューの下に 'が標準テキストにする "を選択します。
  11. ステップ9から '。bashrcに'ファイルが存在する場合は、テキストエディットでファイルを開き、ステップ8からファイルの末尾にエクスポート設定を貼り付けます。 no 'を。bashrcに'ファイルが終了する場合は、空白のファイルにステップ8からの輸出の設定を貼り付けて、ファイル名のホームディレクトリの '。bashrcに'で保存します。 （ホームディレクトリはMacintoshの '家'のアイコンで示されます。）
  12. Bに新しい設定のためには利用可能なeは、ターミナルプログラム内で次のコマンドを使用して、新しく保存 '。bashrcに'ファイルを実行する必要があります。
    ソース〜/。bashrcに
  13. 3DNAスイートは、現在お使いのシステムにインストールされており、ターミナルプログラム内プロトコル2-5を実行することができます。プロトコル6は3DNAソフトウェアの選択されたフィーチャにw3DNA、Webインタフェースを使用して実行される。

2。結晶構造の分析

  1. 我々は、 ボレリアburgdorferiは 8からHBBタンパク質に結合したDNAを用いた核酸構造の解析を示す。 ;この構造体に関連付けられた原子座標のファイルは、プロテインデータバンク13（PDBで見つけることができますhttp://www.rcsb.orgそれは構造的な識別子2np2が割り当てられて、）。付随する補足データもで3DNAフォーラムに掲載されていますこのファイルのコピーが含まれhttp://forumを。x3dna.org/jove。
  2. 構造の3DNA分析の最初のステップは、対になった拠点のすべてを一覧表示し、ファイルの作成です。これは次のように入力して、 'find_pair'プログラムで行われます：
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    ここでは、原子2np2.pdb上述の座標と2np2.bpsの入力ファイルが塩基対形成情報を含む出力テキストフ​​ァイルである。必要であれば、後者の塩基対のファイルが検査され、ユーザーが編集することができます。
  3. 分析の次のステップは、構造体を特徴付ける幾何学的パラメータを決定することである。これらは、標準的な化学ねじれ角14、糖環15のパッカリングを記述する擬似回転角、塩基、連続した塩基対16、三次元化学構造の他の手段の配置を指定する剛体のパラメータを含む。コマンド '分析は'いくつかのOUを入力として、ステップ2で生成された塩基対のファイルを受け取り、作成現在の作業ディレクトリに表示TPUTファイル、。これらの値は、次のコマンドを入力して計算されます。
    2np2.bpsを分析
    ここで使用される出力ファイルは、算出されたパラメータの概要が含まれている2np2.outを含み、上述した剛体パラメータのリストが含まれbp_step.par。後者のファイルは、簡単に、さらなる分析とプロットするためのスプレッドシートプログラムに読み込むことができます。例えば代表的な結果（ 図1）を参照してください。

3。リジッドボディパラメータからのDNA構造の構築

  1. 核酸構造の解析に加えて、3DNAソフトウェアは '再構築'コマンドを使用して剛体パラメータから構造モデルを構築するための機能を提供します。このプロトコルでは、第2プロトコルで計算されたHBB-DNA複合体から剛体パラメータを用いし、wのパラメータの修正されたセットを使用して、2つのDNAらせんモデルを構築する方法を示していHICH選択したロール角が変更される。ロール角は、DNA 16の溝に連続した塩基対の曲がりの程度を測定する。ロールの正の値は、主溝と副溝の狭小化と負の値の縮小に関連付けられています。 3DNAおよび他の一般的な核酸分析ソフトウェアによって採用標準基準フレーム17、 例えば、カーブ+ 18は 、ワトソン-クリック塩基対の計算されたパラメータの数値の整合性を保証する。
  2. デフォルトでは、3DNA '再構築'関数は、窒素塩基中の原子の座標のみを含む正確な原子モデルを作成します。バックボーンとベース原子の両方から座標を含む概算の原子モデルを作成するためには、次のコマンドを入力します。
    x3dna_utils cp_std bdna
    このコマンドは、剛体パラメータからモデルの構築に標準B-DNA骨格コンフォメーションを導入する3DNA指示。
  3. BUIへHBB-DNA構造で見つかった剛体パラメータを持つ二重らせんモデルldは、次のように入力します。
    再構築 - アトミックbp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    ここでは ' - アトミック'はすべての重（非水素）原子のための原子座標を持つすべての原子モデルの構築を指定し、 'bp_step.par'が入力された剛体のパラメータが含まれていますプロトコル2のステップ3で生成されたファイルです。 、そして'2 np2_rbld_org.pdb 'が作成された構造の原子座標を出力ファイルです。後者のファイルは、PDBの仕様に従ってフォーマットしたがって '。PDB'で終了します。
  4. 'bp_step.par'ファイルが修正された構造を生成するために編集することができます。 Macintoshでは、変更がプロトコール1ステップ10で説明したようにテキストエディットアプリケーションを用いて行うことができる。
  5. ここでは、最大曲げの二つのサイトで形成され、極端なロール角度を変更します。度で表される値は、線17および60に64.95の値からゼロに変更される26行目で0.93。私たちは 'bp_step_roll0.par'、新しい名前で変更したファイルを保存し、テキストエディットプログラムを閉じます。
  6. 我々は次のように入力して、入力ファイルとステップパラメータの変更セットで、ステップ3のように、構造を構築：
    再構築 - アトミックbp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. 二つのモデルは、pymolの（ような、標準的な分子ビューアで表示することができますwww.pymol.org入力として生成された座標ファイル（。PDB）を使用して、）。再建された構造の画像のための代表的な結果（ 図2）を参照してください。

4。マルチモデルの構造ファイルの解析

  1. 我々は単一の核酸を含有する構造を解析するプロトコール2とは対照的に、ここでは、構造体の大きな集合体を分析する方法を示す。我々は、分子動力学（MD）のシミュレーション11から得られた14塩基対のDNA鎖の系列に沿った剛体パラメータの経時的変化を調べhttp://forum.x3dna.org/jove 。
  2. 分析の最初のステップは、 "find_pair 'プログラムを実行することにより、プロトコール2、対の塩基の同定を行ったものと同じである。構造株式のセット全体以来同じ塩基対スキーム1は、代表的なファイルで1回のみ 'find_pair'を実行する必要があります。ここでは、ファイル名md_AT_set1.pdb.1001と、ステップAT中央を含むDNAの鎖のシミュレーションで1001番目の構造を選択します。以下の命令の属塩基対形成情報をTES、ファイルmd_AT_set1.bpsに格納する。
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001のmd_AT_set1.bps
    ユーザーは、皮をむく識別された基地を調べ、構造の知識に基づいてファイルに手動で変更を加えることができます。
  3. 次のステップは、 "x3dna_ensemble分析"コ​​マンドを使用して、構造体のセット全体の幾何学的パラメータを決定することである。プログラムは、入力として、ステップ2（md_AT_set1.bps）で生成された塩基対のファイルと同様に、分析される構造体のリストを含むファイルを使用しています。ここmd_AT_set1.list呼ばれる後者のファイルは、MDシミュレーションによって生成されたために、個々の行に入力したファイル名で、分析する4500ファイルが含まれています。このファイルのコピーは、補足資料に含まれており、また、3DNAフォーラムで提供されています。ユーザーは、計算時間が長くなる可能性があること、なぜなら、多数のファイルを、警告されるべきである（〜AMDのPhenom II X4 965プロセッサで1,000ファイルあたり20分）。木曜日eコマンドは、次のように入力して実行されます。
    x3dna_ensemble分析-B md_AT_set1.bps-L md_AT_set1.list-O md_AT_set1.out
    ステップ2で作成した塩基対ファイルに '-B'関係上記の例では、 '-L'はファイルのリストが指定されていることを指定し、 '-o'をユーザが出力ファイルに名前を割り当てることができます。このような特定のモデルの選択として 'x3dna_ensembleを分析'コマンドと組み合わせて使用​​することができる多くのオプションがある。ユーザーは、これらのオプションの詳細情報を得るために 'x3dna_ensemble分析-H'を入力することもできます。
  4. 次のステップは、ステップ3で生成された概要出力ファイル、md_AT_set1.outから所望の剛体パラメータを抽出することである。これは、 'x3dna_ensembleエキス "コマンドを用いて行われる。利用可能な幾何学的パラメータのリストがタイピング 'x3dna_ensembleエキス-L'によって発見することができます。ここで我々は、ロール角を抽出し、次のコマンドを使用して、ロール角のカンマ区切りのテキストフ​​ァイル（CSV）を作成します：
    x3dna_ensembleエキス-Pロール-Sは、-f md_AT_set1.out-O md_AT_set1_roll.csv
    このコマンドに '-Pロール'を抽出するパラメータを指定し、 '-S'は、カンマ区切りのファイルを意味し、 '-F'は、コマンドを解析アンサンブルから得られた出力ファイルを意味し、 '-O 'ユーザーが分析されたすべての構造でDNAに沿ってロール角のCSV出力ファイルに名前を付けることができます。このファイルは、さらなる分析およびプロットするための他のプログラムに読み込むことができる。前述の2 MD-生成され、データセットとこれらの画像を生成するために使用するMATLABスクリプトの3DNAフォーラムにおけるロールの変化を分析するための代表的な結果（ 図3）を参照してください。

5。共通の基準フレームにマルチモデル構造の重ね合わせ

  1. 3DNAの最新バージョン（バージョン2.1）は、ユーザーが共通の視点から複数の構造を見ることができる新しい機能があります。 'x3dna_ensembleが向きを変える'コマンドは、関連structurのコレクションを重畳共通の塩基対または塩基対ステップのES。次のプロトコルはlacリプレッサータンパク質12のヘッドピースにバインドされたO3のDNAオペレーターのNMR由来の構造には、この機能を適用します。これらの構造は、プロトコル4で4500の各モデルに使用されるもののような独立したファイルとは対照的に、単一のファイル内のすべての構造モデルが含まれている、マルチモデルの構造ファイル内の識別子2kek下PDBに保存されます。付随する補足データもで3DNAフォーラムに掲載されていますこのファイルのコピーが含まれhttp://forum.x3dna.org/joveを 。
  2. 以前のプロトコルと同様に、最初のステップは、 "find_pair 'プログラムでDNAの塩基対形成を計算することである。このケースでは、入力ファイル'2 kek.pdb 'として使用すると次のように入力します。
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    塩基対形成がpdbファイル内の最初のモデルを使用して生成される。出力されたBへの手動修正アーゼペアファイル、'2 kek.bps 'は、構造の知識に基づいて行うことができる。
  3. プログラム共通の基準フレーム上のマルチモデル構造の個々のモデルの位置を合わせます 'x3dna_ensembleは新しい方向'は。このプログラムは、入力として前のステップからpdbファイルと塩基対ファイルの両方を必要とし、次のコマンドで実行されます：
    新しい方向-B 2kek.bps-F 1-E 2kek.pdb-O 2kek_fr1.pdb x3dna_ensemble
    ここで '-b'はオプションが塩基対ファイルを指定し、 'が-F 1'はこの場合には、全ての構造が整列された塩基対を示し、塩基対1配列担持鎖の5 '末端に、 '-eは'入力アンサンブルファイルを指定し、 '-o'は、ユーザーが、この場合'2 kek_fr1.pdb 'で、出力ファイル名を指定することができます。コマンドのオプションの詳細については、次のように入力 'x3dna_ensemble再配向-h'をすることによって得ることができる。整列構造の議論のための代表的な結果（ 図4）を参照してください。

6。 Construタンパク質飾らDNA分子のction

  1. w3DNA Webインターフェイスは3DNAソフトウェアパッケージのいくつかの人気のある機能を備えています。ここでは、Webサーバーとのタンパク質 - 飾られたDNAの三次元モデルを構築する能力に注意を引く。結合したDNA断片は、ここで選択されたタンパク質-DNA複合体、プロトコル2で分析HBBタンパク質に結合したDNAの値の剛体パラメータを採用する。 DNAの非結合領域は、3つのユーザが選択した螺旋形（A、B、又はC）のいずれかを採用することができる。 A、B、Cは早いそれぞれ11と繊維回折実験、10、および二重らせん19-21のターンごとに9塩基対から得られたDNAの3正規のモデルを参照してください。
  2. タンパク質飾らDNAモデルを構築する最初のステップは、に位置w3DNAウェブサイト訪問することですhttp://w3dna.rutgers.eduを 。ページACTIの上部左側にあるメニューから '復興'の選択オンラインモデル構築機能をvates。
  3. 次のステップは、新しいページの真ん中に軽く影付きボックスにある '結合タンパク質-DNAテンプレート "リンクを選択することです。この選択は、ユーザが結合したタンパク質の数を指定することができるプルダウンメニューをアクティブにする。ここで我々は2つ​​の結合タンパク質を選択し、[続行]ボタンをクリックします。モデルは1,000塩基対、または2,000ヌクレオチド、及び30結合タンパク質のサイズに制限されることに注意してください。
  4. 結合したタンパク質の数の選択は、図5に示すものと同様の仕様ページにつながる。このページには、ユーザーは、DNA配列、非結合DNAの螺旋形、そして結合したタンパク質の身元と場所を指定することができます。
  5. 仕様のページの中央にあるテキストボックスに所望の配列（ 図5、ラベル1）のユーザータイプまたはペースト。 A、T、C、G、およびU - - 受け入れられる唯一の標準残基は注意してください。ここでは、81塩基対HOMを入力シーケンス有利子鎖中で·Tペアで完全に構成opolymer、。
  6. プルダウンメニュー（ 図5、レーベル2）は、DNAの非結合領域のらせん構造を選択し、テキストボックスの下に存在する。この例では、B型のコンフォメーションを選択します。
  7. 結合したタンパク質（s）は（ 図5、レーベル3）の結合位置（s）とファイル名（複数可）を入力する仕様ページの下にテキストボックスがあります。結合位置は、DNA配列上のタンパク質結合フラグメントの中心の位置を指定します。結合したDNAはHBB-DNA構造体のように、塩基対の奇数個が含まれている場合は、綴じ位置は、フラグメントの中間塩基対の位置を示している。 HBB結合したDNAの場合には、この中間塩基対がT·T誤対合である。この例では、DNAテンプレートにHBBタンパク質の2つのコピーを結合する場合に、T·Tの一対の位置20及び81塩基対のDNA自体の63に配置されているquence。バインドされた断片の配列は、ステップ5で入力したものと一致する必要はないことに注意してください。タンパク質結合領域は塩基対の偶数番号が含まれている場合は、綴じ位置は、DNAの中央塩基対工程の位置を示している。すなわち、結合した断片の中央塩基対工程は塩基対nおよびnはセグメントに沿って指定された数はn +1との間に配置されている。また、ユーザーがあまりにも長い間、DNAとの複合体の構造が知られており、標準的なPDB形式13に格納され、どのような蛋白質とDNAを飾ることができます注意してください。
  8. 仕様のページの下部にあるユーザはタンパク質結合DNA（ 図5、ラベル4）のプレビューを生成することができますボックスがあります。ここでは、そのチェックボックスをオンにし、[続行]ボタンをクリックします。このアクションは、選択したパラメータと同様に、選択された結合部位の重なりから生じた可能性のあるエラーの一覧をレビューページを生成します。ユーザーがSEできます変更が行われる必要があるか、または続行する 'ビルド'ボタンが '戻る'ボタンをlect。
  9. 次のページでは、そのほとんどの拡張配列でDNA-タンパク質複合体の静止画像を表示するとJmolとWebmol経由のオンラインインタラクティブな可視化を可能にします。また、ユーザは、PDBの仕様に従ってフォーマットされた座標（PDB）ファイルをダウンロードすることができる。これは、生成された画像の下のリンク '再建pdbファイルダウンロード'を選択することによって行われます。後者のファイルは、簡単に、さらに視覚化のための分子グラフィックスプログラムに読み込むことができます。位置20および67を中心とHBBと前述のHBB飾られたDNAとわずかに長い（86塩基対）チェーンの例については、代表的な結果を（ 図6）を参照してください。

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Representative Results

3DNAソフトウェアツールを定期核酸構造を分析するために使用される。例えば、塩基対のアイデンティティとDNAとRNA構造の二重らせんの断片中の塩基の配列を特徴付ける剛体パラメータが自動的核酸データベース22の世界的なリポジトリに新しいエントリごとに計算して記憶する核酸構造情報。プロトコール2で決定剛体パラメータの値を容易に見つかり、そのような大きな正のロール角（64.95°、60.93°）で、主溝に曲げ極端なDNAの二部位として、三次元構造の歪みを明らかにするボレリアブルグドルフェリ HBBタンパク質8（ 図1）の結晶複合体中のステップ13と22 AT·AT。

プロトコル3でこれらの量から構造を再構築するためのソフトウェアの機能はどのよ​​うに決定することが可能になる分離したベースと塩基対のステップが全体の分子倍に貢献しています。 図2に示すように、HBBによって誘導されるDNAの全体的な湾曲は、2つの極端なロール歪みが上述したよりも多くを反映している。つまり、これらの塩基対のステップを再構築するときであり、DNAが高度に湾曲したまま、2つのサイトでヌルロール角度で、すなわち 、まっすぐ。同じ手法は、以前、細菌に特異的塩基対のステップや変形のヌクレオソームコア粒子6の表面にラップされたDNAの超らせんピッチへと結合したDNAの副溝の幅への貢献を明らかにした核様体-関連タンパク質FIS 23。

関連構造の多数を調べるためにプロトコル4に記載3DNAに新たな機能は、それが可能なシミュレートされたDNAおよびRNA分子の空間的配置の両方配列および時間依存パターンを抽出することができる。例えば、（イエロー）コルシミュレートされたDNA構造体11の二つの大きなセットの連続した塩基対の間にロール角の符号化ピリミジン又はプリン塩基対工程（ 図3）において、これらの分子の優先的曲げを明らかにする。 DNAの末端に短い期間持続する赤で示されているロールの高い値は、二重らせん構造の局所的な融解と再アニーリングを示唆している。このような角度と相補的塩基間の距離など他の剛体のパラメータ、、の変分パターンは解読正確な構造的歪みを助けることができます。

共通の基準フレームに関連分子の方向を変更するためのプロトコル5に示す3DNAソフトウェアの機能は、PDBに格納されたファイルの多くに隠された全体構造の特徴を明らかにする。例えば、対応する原子の二乗平均適合度に基づいて関連構造の従来の位置合わせは、同様の空間的な経路tのシリーズを生成帽子は大体lacリプレッサータンパク質12（ 図4左 ）のヘッドピースにバインドされたO3のDNA演算子の10 NMRベースのモデルここでは、お互いに依存重ねる。各二重鎖の5 '末端塩基対に共通の座標系上の同一の構造の重ね合わせは、分子がかなり異なる方向（ 右図4）に撓むたグローバル構造のかなりの歪みを、明らかにする。構造的変動性大腸菌 lacリプレッサータンパク質はO3を結合し、 ラックオペロン24 O3順次遠隔オペレータ間のループを誘導する容易さに影響を及ぼす可能性がある。

議定書の6で説明されている手順は、タンパク質や他のリガンドで任意のサイトで飾ら長いDNA断片のモデルを構築するため、大規模な高分子集合体の組織に新たな視点を追加します。このようなモデルは、マルチ分子複合体をどのように理解するのに役立つ生物学的処理中に対話します。 図6に示すように、HBB等の建築タンパク質の正確な配置は、DNAの全体的な折り畳みに劇的な効果を有することができる。知られている高解像度の構造体8の2つのコピーが43塩基対で区切られている場合は、81塩基対のDNA断片をタイト、ほぼ閉じた形状に終了。二つのタンパク質がさらに5塩基対によって分離されている場合、DNAが開いて、蛇行経路に従う。建築の蛋白質の間隔がDNA 25、26の環化またはループに影響を与えることができる方法タンパク質飾ら両面ショーの非常に異なるアレンジ。

図1
図1。 DNA茶に沿って連続した塩基対の間にロール角の変化（視覚的描写の挿入を参照してください）におけるボレリアブルグドルフェリ 8からHBBタンパク質に結合。3DNAの'分析'コマンドとプロトコル2で説明した構造データを使用して得られた値は、。そのブラケット構造の中央三分の一をステップATで、ロールの極値に注意してください。

図2
図2。色分けされた原子（; N-ブルー、O-赤、P-ゴールドC-シアン）とpymolのでレンダリング'再構築' 3DNAの機能を使用して構成するDNAのおよその原子モデル。に基づくモデル（左）HBBタンパク質の剛体工程パラメータおよび（右）ロールの二最大値はゼロに設定された工程パラメータの修正されたセットは、ステップ·バイ·ステップの手順については、プロトコル3を見る。ロールに課し変化によって誘発されたDNAの展開に注意してください。


図3。シミュレートされた構造物11の二組の中のDNAに沿ってロール角のモザイク画像。プロトコル4を使用して抽出されたロールの値は、範囲にわたって青から赤に色分けされています[-5°、20°]。 2 14塩基対、自己相補的配列でピリミジンプリンステップで起こる黄/赤の列で強調拠点やロールの大きな値と逆の順序に注意してください。

図4
図4。 lacリプレッサータンパク質の天飾りとO3のDNAオペレーターのNMR由来構造で見つかったDNAモデルの漫画の画像機能の実例12画像pymolのでレンダリング（バックボーンが青棒、金の管及び塩基として表示）と使用して整列（左）座標PDBエントリーインチコマンドを'x3dna_ensembleが向きを変える'（2kek）と（右）議定書5に示す構造の重ね合わせの。 5 '末端塩基対に共通の基準フレームに配置構造の間の大きな違いに注意してください。

図5
図5。 DNA配列（ラベル1）の仕様、非結合DNA（ラベル2）、タンパク質の位置やアイデンティティ（ラベル3）の螺旋形、およびプレビュー画像のチェックボックス（ラベル4）を示すw3DNA Webサーバからのスクリーンショットプロトコル6に記載。 大きい数字を表示するには、ここをクリック 。

図6
図6。長いDNA断片にバインドされた2つのHBBタンパク質8の近似原子モデル。議定書6に記載されており、pymolのでレンダリングとしてw3DNA Webサーバを使用して作成構造。 DNAが原子タイプ（; N-ブルー; O-赤、P-ゴールドC-シアン）で着色されたコード化されながらタンパク質鎖は紫のリボンのようにshowです。各タンパク質結合部位の中央塩基対は位置に設定されている86塩基対のDNA鎖に沿って（左）20及び62 81塩基対のDNA鎖に沿って（右）20および67。 2つのタンパク質の増加（5塩基対）の変位に関連付けられている構造の折りたたみにおける大きな変化に注意してください。

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Discussion

この記事で紹介した一連のプロトコルは、プログラムのみの3DNAスイートの能力に触れる。ツールは等、主鎖に沿っ塩基の重なりを測定するために、螺旋フラグメントの空間的な配置を定量化するために、そのようなペアリングが発生する二次構造のコンテキストを決定するために、非標準塩基対を識別するための構造をRNAに適用することができる再構築コマンドは、ユーザが図1を挿入図に示すような塩基と塩基対を簡単かつ有益なブロック表現を構築することができる。構築ツールはまた、多数の二重、三重、四重鎖DNA構造のモデルを生成するために、所与の構造テンプレート上の "スレッドの異なる配列の特徴を含む、特定方向に配向モデルに等最後に、3DNAがあります;用ARTS Webサーバー核酸27住友電装溶媒和Webサービス：など他のプロジェクトの数に重要な役割を果たした合わせRNA立体構造28、分子動力学の結果と構造予測29の分析のためのMDDNA Webベースのツール、ハドック情報駆動型タンパク質-DNAのドッキング方法30、RNA構造31の機能注釈用SARAサーバー、3D- DARTのDNA構造モデリングサーバ32、タンパク質-DNA複合体33の構造解析のための3Dフットプリントのデータベース、RNA構造34内の3次元の断片を同定するためのRNA FRABASE 2.0データベース、および対比較のsetter WebサーバーRNAの構造35。我々の知る限り、機能と3DNAのロバスト性能レコードの匹敵する広範な組み合わせを持つ他の核酸構造のソフトウェアパッケージは、現在ありません。

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Disclosures

利害の衝突は宣言されていない。

Acknowledgments

私たちは、分子動力学シミュレーションで生成されたDNAの二重らせんの座標を共有するためのイジーŠponerに感謝しています。また、これらの構造をダウンロードの支援のために灘Spackovaを認める。 USPHS研究助成GM34809とGM096889を通してこの仕事のサポートは感謝して承諾されます。

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