Summary
一个多层面的方式来调查海马电路的功能变化进行了解释。电技术，以及受伤的协议，行为检测和区域的清扫方法。可以应用这些技术的组合，以类似的方式用于其他大脑区域和科学问题。
Abstract
创伤性脑损伤（TBI）折磨着每年超过170万人在美国，即使是轻微的脑外伤可能会导致持久性神经损伤1。普及和禁用的症状所经历的TBI幸存者，记忆障碍和减少癫痫发作阈值，被认为是介导的海马脑外伤引起的功能障碍2,3。为了演示如何改变伤后在小鼠海马的电路功能造成不利影响的行为，我们采用横向液压冲击伤，常用的TBI动物模型，再现了人类TBI的许多功能，包括神经细胞的损失，胶质细胞增生和离子扰动4 - 6。
在这里，我们展示了一个组合的方法调查TBI对海马功能障碍。我们的方法集成了多种体外生理技术结合起来，与动物行为学和生化分析，以分析在海马-TBI后的变化。我们开始实验的伤害模式与行为分析，评估认知障碍，脑外伤。接下来，我们提供三个不同的体外记录技术：外场势记录，可视化全细胞膜片夹紧，和对电压敏感染料记录。最后，我们展示了次区域的海马-TBI后的神经化学和代谢变化的详细分析，可用于区域解剖的方法。
这些方法已被用于检查修改后的海马电路TBI和探测对方在网络电路功能的变化发生在齿状回的海马CA1次区域（ 见图1）。分析后TBI在各次区域的能力是必不可少的理解基本的机制，促进脑外伤引起的行为和认知ðeficits。
这里列出的多面性的系统，使调查人员推过去的表征现象引起的一种疾病状态（在这种情况下，TBI），并确定负责与TBI所观察到的病理机制。
Protocol
1。横向闭合性损伤中的作用
- 麻醉的小鼠腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物。鼠标的头部，然后准备切口用碘擦洗。
- 执行去骨瓣超过使用3毫米（外径）环锯的右顶叶面积。
- 安全鲁尔-LOC针轮毂（内直径为3毫米）在骨瓣使用cyanoarylate和牙齿的丙烯酸。
- 24小时后，麻醉吸入异氟醚通过鼠标使用。
- 一旦恢复正常的呼吸，但之前鼠标的刺激变得敏感，通过液压冲击伤设备，提供20毫秒的脉冲生理盐水入颅。
- 伤后立即取下集线器，reanaesthetize鼠标采用异氟醚，和头皮缝合关闭。
假手术组将收到一个相同的程序与步骤1.5省略。
2。行为分析 - 恐惧RESPONSE
- 处理小鼠连续两天之前，条件性恐惧反应（CFR）培训。
- 将鼠标放置在空调室管理1.5毫安地板冲击2秒的前3分钟。发布鼠标在一个额外的30秒内的腔室。
- 的延迟时间（通常24小时）后，返回鼠标调节室持续5分钟。评估冻结5秒的时间间隔。
分析包括两个群体，在我们的例子脑损伤的小鼠和假手术组比较的相对量冻结的时间。冻结速率较低（与对照组比较）表示无法保留上下文之间的关联和地面的冲击，记忆障碍和认知功能障碍的迹象。
3。急性海马脑片准备
*注：麻醉用钟罩只能实现终端程序（如本文所述的大脑解剖）。
- 后7天损伤，使1 L的人工脑脊髓液（人工脑脊液）和250毫升蔗糖裁剪解决方案。
- 使用冰宽松，以确保所有脑片制备过程中使用的仪器和解决方案是冰冷的。
- 使用异氟醚麻醉小鼠。快速，轻轻取出大脑中蔗糖从鼠标和地点。
- 修剪大脑和一滴胶水前面的琼脂块切割面。
- 切350微米厚的冠状切片，你应该能够得到完整的海马电路与4或5片。
- 孵育切片至少1小时，在37°C。
4。外场电位记录
- 拉硼硅玻璃电极到2-5MΩs垂直拉拔器。
- 将片室，并插入电极，电极支架上。
- 成片，如perforant的路径或Schaffer侧支在轴突道的刺激电极降低。下记录电极入位置，同时监测输出的痕迹，以确保电极是在相同的z级（深度）。当达到最大反应，刺激电流电平保持恒定，电极是在相同的z级。
- 得到的曲线由三个部分组成：突触前纤维的凌空抽射，领域外突触后电位（fEPSP的），和突触后的人口秒杀。一些准备工作的组成部分重叠时间，使分析更加困难。如果有模棱两可之间是否响应是突触前或突触后，APV和CNQX可以加入到熔池中以阻止兴奋传导，而所有剩余的信号将是突触前的原点。
- 刺激方案各不相同，生产三个不同的实验类型：输入/输出曲线，双脉冲录音，并长期可塑性的实验。
分析通常由比较的fEPSP的斜率的测量，在两个大脑损伤的小鼠和假对面操作控制，控制输入强度通过测量光纤凌空。
5。可视膜片钳记录
- 准备片，电极，和钻机记录先前如上所述到步骤4.2。
- 只考虑细胞深度超过80微米到接近表面的细胞组织，将是死的，和/或减少的连接。方法与在电极上的正压力，以确保它不会被堵塞，因为它向下移动穿过组织的细胞。当电极轻轻触及细胞施加负压，以便创建一个'gigaseal'之间的电极和质膜。
- 应用短脉冲串的负压，以便破裂下的plama膜的电极，并实现整个小区的配置。
- 消除使用放大器的电容瞬态和串联电阻补偿。补偿的单元格中的串联电阻是必不可少的，以确保ccurate测量。
- 两种模式，可以进行单细胞录音：电流钳（测量电压）膜和电压钳位（测量电流通过膜中的离子通道）。
分析可能出现的类型很多，但在我们的例子中，主要包括生物物理分析，定量分析脑损伤的小鼠和假手术组的突触电流的速度和规模。
6。电压敏感染料成像（VSD）
- 准备记录片和钻机上述步骤4.2。
- 50μl乙醇混合1毫克二3 ANEPPDHQ的到，准备染料股票分配2微升等份箔纸包裹的管道，储存在-20°C每天工作染料溶液，稀释1:200脑脊液。
- 孵育湿滤纸片上脑脊液和染色与90μl的染料16分钟;与脑脊液和接口在录音室冲洗。
- 调节光stimulatio器Ň，直到反应强度集中在中间的摄像头的范围。画像通常500-1000帧每秒的速率获得。
- 电刺激，让初期的快速光漂白稳定之前触发快门的光刺激200毫秒。替代的采集试验之间的电刺激，非电刺激，以允许购买减法非刺激的背景。录制休息的光强度（荧光值与快门关闭）之前打开快门。每个VSD的审判将是一个y像素x像素的荧光读数的时间“电影”。记录10 - 12的VSD试验在每个测试条件。
- 所有的测量都是上执行帧内像素的预电刺激归一化的荧光变化，DF / F，它被计算为如下：
减去休息的光强度VSD的原料收购的试验。如果在每次试验中的每个像素，根据电刺激前的平均值，该正常化试验，减去团结。电刺激和非电刺激试验。创建从非电刺激试验的平均的“背景荧光”试验，并从电刺激试验试减去这个背景。进一步的分析，通常进行的平均值为10 - 12个这样的试验中，也通常在空间和时间，以改善信噪比过滤。
7。生化分析的区域解剖
- 如前面所述的从小鼠中取出的大脑。
- 准备切片组织菜刀。
- 莱节平，显微切割CA1区和DG。
- 裂解缓冲液中含有蛋白酶抑制剂，立即浸入冷水中。冷冻在液氮中并存储在-80°C。
8。代表性的成果
我们的实验通常开始与行为数据，以确认预期版中存在的脑损伤小鼠的认知功能障碍。 ，因为它是海马依赖的行为，是可靠的，只需要一个训练阶段，以及一个测试环节，我们采用情境恐惧反应测试。在图2中所示的数据表示行为的测试，以测量顺行存储器，然而，也可以使用测试测量逆行性记忆受伤之前进行，如果训练会话。
兴奋性突触后电位（fEPSPs）测量，以确定的净突触效能的一个人口众多的细胞（ 图3A）。我们通常采用三种不同类型的刺激模式，每个得到其自己的结果和结论。首先，通过一系列的步骤，通过增加的刺激强度，我们创建了一个输入/输出曲线（ 图3B / C）。
接着，通过提供两个相同强度的单独的刺激D的一个短暂的延迟（通常为50毫秒），我们调查潜在的突触囊泡释放概率的改变。此外，我们经常执行长时程增强（LTP）实验。建立基线响应，简短的高频刺激（通常为100Hz的）后，在相同强度的传递，导致细胞内的级联，导致恢复正常时刺激一个增效突触反应。
从全细胞膜片夹紧细胞的电活动可以在两种模式下记录。在电压钳位模式，实验者控制膜片夹紧单元格中参照浴膜电压，通过相关联的计算机软件与放大器。在这种情况下，电流调解突触后的事件被记录，提供突触前释放频率有关下列内容的信息，数字突触后受体激活和水泡性神经递质的浓度（ 图4A）。在电流钳模式下，实验者操纵注入的电流和测量的电压响应。这可能是有用的，以确定的动作电位的特性，如动作电位的阈值和半角。这些特性允许兴奋或抑制基于他们的动作电位的放电模式（ 图4B）的神经元的功能分类。为了验证蜂窝的身份，我们建议记录后，目视确认身份的存在或不存在的树突棘与路西法黄色填充单元格。 （ 图4C，D）。
使用电压敏感染料测量膜电压的变化的实验结果的一个例子示出在图5中。在这种情况下，刺激电极已被放置在Schaffer侧支途径所得CA1区的神经元的电活动进行分析。电压敏感染料不报告膜电位的绝对值，而是吨他的电压变化，从基线条件无刺激。然而，比较两个条件（ 如脑受伤与假手术）的分析可用于确定不能使用fEPSPs或全细胞膜片钳记录测量的生理改变的时空参数。
图1。海马电路图。部分通过海马的水平。在海马的主要途径，通过显示为黄色。工程通过的perforant的途径进入齿状回齿状回颗粒细胞的树突形成突触内嗅皮质神经元的轴突从。颗粒细胞的轴突项目通过苔藓纤维通路CA3 CA3神经元的树突形成突触。 CA3神经元的项目通过Schaffer侧支途径到的dendrit上的轴突ES CA1锥体细胞。通过下脚的海马CA1锥体细胞的轴突投射出的。注：还描绘了CA3锥体细胞的轴突投射到对侧海马通过伞的抵押品。 （CA1 CA2：的考纽Ammonis 1，的考纽Ammonis 2，CA3：的考纽Ammonis 3，DG：齿状回，虚线表示的细胞体层，实线表示结构边界）。
图2。代表行为数据。A：行为数据，描绘脑损伤小鼠（FPI）和假手术对照组（假）的条件性恐惧反应模式之间的差异，冻结速率。培训发生在损伤后第 6天，24小时后测试期间发生。 （**表示P <0.01）。
图3。代表细胞外记录数据。A：的场兴奋性突触后电位（fEPSP的）记录CA1区的一个例子。第一向下偏转的刺激的神器，其次由突触前纤维凌空和最后fEPSP的。 B：输入/输出曲线描绘了一个突触效能净减少CA1下面的液压冲击伤（FPI）。 C：输入/输出曲线描绘净增加突触效能海马齿状回（DG）FPI。 （*表示P <0.05）。 点击此处查看大图 。
图4。代表全细胞膜片钳数据。答：一个例子自发从CA1锥体细胞兴奋性突触后电流（sEPSC的）。 B：从CA1锥体细胞（上迹线）和快速扣球：CA1 interneuron（下迹线）的动作电位火车的。 C：示例的荧光黄充斥CA1抑制性。注意树突棘（上面板）的情况下。 D：荧光黄的实例充满CA1锥体神经元。注意存在的树突棘（上图）。 点击这里查看大图 。
图5。代表电压敏感染料成像数据。答：鼠标冠海马脑片显示，以解剖。 （DG：齿状回，CA1：考纽Ammonis 1）B：黄色至红色像素CA1区14毫秒后传入刺激Schaffer侧支代表兴奋性活动。红中dicates更多的去极化，而黄色表示低，但仍然显着的去极化。 C：蓝色像素代表网站的抑制活性CA1区56毫秒后，同样的传入刺激Schaffer侧支B.深蓝色的表示更多的超极化。
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Discussion
上面列出的每个技术有助于更深入的了解所观察到的行为赤字的内在机制造成的。通过结合从每个方法所取得的固有信息，我们能够检查更精确的生物学机制。
测量的fEPSPs是有用的为大，空间定义的区域的神经元量化净突触的功效。它也可以提供信息的一组细胞的潜力，经过突触可塑性，学习和记忆的神经相关的。这是一个非常有用的，因为它是第一点的电生理分析技术简单，提供更广泛的措施电路功能的信息。
相反，fEPSPs，全细胞膜片钳记录提供了一个单细胞的电生理参数的详细信息。这是一个非常多元化的技术为许多不同的参数和典型ES的突触输入，可根据拍摄条件（在吸液管或浴缸的药物，保持电压，录音模式等）。例如，全细胞膜片钳记录，可用于区分的相对贡献的兴奋性和抑制性突触传递的突触效能净观察到的差异所描述的fEPSPs。
电压敏感染料成像实验中增加上述所提供信息的时空动态电路的变化较传统的电生理技术所获得的知识。可以使用的任何修改的时空更新，可能涉及的生成电路的功能障碍，然后可以通过更有针对性的方法，像全细胞膜片钳分析有关的潜在的细胞类型来生成假设。
在我们的例子中，我们和其他已经证实subregi的净突触效能7-9，而导致无法产生LTP在CA1特征TBI 10的具体变化。进一步的研究使用了多种分子生物学技术和电生理调查的兴奋/抑制性突触传递的11所观察到的不平衡背后的机制。更重要的是，这些研究采用行为不仅展示出一种认知功能障碍，脑外伤后，也来验证来自使用我们的组合方法获得的结果的饮食治疗策略的有效性。
这种多方位的系统没有什么限制了其应用领域的TBI或地区的海马的兴趣。事实上，这套工具相结合是可能导致biomechanistic描述观察到的行为差异的神经系统疾病中的数量的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢艾略特他的资产阶级用于技术援助。这项工作是由国家机构的健康补助R01HD059288和R01NS069629的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | AXOPATCH 200B | Patch-clamp rig |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | Patch-clamp rig | |
| MP-225 micromanipulator | Sutter | MP-225 | Patch-clamp rig |
| DMLFSA microscope | Leica | Patch-clamp rig | |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Multipurpose (field) rig |
| Digidata 1440 digitizer | Molecular Devices | Multipurpos (field) rig | |
| MPC-200 micromanipulator | Sutter | MPC-200 | Multipurpose (field) rig |
| BX51WI microscope | Olympus | BX51WI | Multipurpose (field) rig |
| Axoclamp 900A amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 900A | VSD rig |
| Digidata 1322 digitizer | Molecular Devices | VSD rig | |
| Redshirt CCD-SMQ camera | Redshirt | NCS01 | VSD rig |
| VT 1200S Vibratome | Leica | 14048142066 | |
| P-30 Electrode puller | Sutter | P-30/P | |
| cOmplete protease inhibitor | Roche | 11697498001 |
References
- Faul, M., Xu, L., Wald, M. M., Coronado, V. G. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits Hospitalizations and Deaths 2002-2006. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , (2010).
- McAllister, T. W. Neuropsychiatric sequelae of head injuries. Psychiatr. Clin. North Am. 15, 395-413 (1992).
- Pierce, J. E., Smith, D. H., Trojanowski, J. Q., McIntosh, T. K. Enduring cognitive, neurobehavioral and histopathological changes persist for up to one year following severe experimental brain injury in rats. NSC. 87, 359-369 (1998).
- Dixon, C. E., et al. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. J. Neurosurg. 67, 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
- Carbonell, W. S., Grady, M. S. Regional and temporal characterization of neuronal, glial, and axonal response after traumatic brain injury in the mouse. Acta Neuropathol. 98, 396-406 (1999).
- Toth, Z., Hollrigel, G. S., Gorcs, T., Soltesz, I. Instantaneous perturbation of dentate interneuronal networks by a pressure wave-transient delivered to the neocortex. J. Neurosci. 17, 8106-8117 (1997).
- D'Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R., Janigro, D. Selective loss of hippocampal long-term potentiation, but not depression, following fluid percussion injury. Brain Res. 786, 64-79 (1998).
- Witgen, B. M. Regional hippocampal alteration associated with cognitive deficit following experimental brain injury: A systems, network and cellular evaluation. Neuroscience. 133, 1-15 (2005).
- Schwarzbach, E., Bonislawski, D. P., Xiong, G., Cohen, A. S. Mechanisms underlying the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury. Hippocampus. 16, 541-550 (2006).
- Cole, J. T. Dietary branched chain amino acids ameliorate injury-induced cognitive impairment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 366-371 (2010).
