Summary
Een veelzijdige benadering van het onderzoek naar functionele veranderingen in de hippocampus circuits wordt uitgelegd. Elektrofysiologische technieken worden beschreven, samen met de schade-protocol, gedrags-testen en regionale dissectie methode. De combinatie van deze technieken kunnen worden toegepast op soortgelijke wijze andere hersengebieden en wetenschappelijke vragen.
Abstract
Traumatisch hersenletsel (TBI) treft meer dan 1,7 miljoen mensen in de Verenigde Staten elk jaar en zelfs licht traumatisch hersenletsel kan leiden tot blijvende neurologische stoornissen 1. Twee indringende en invaliderende symptomen ervaren door TBI overlevenden, geheugen tekorten en een vermindering van de convulsiedrempel, worden verondersteld te worden gemedieerd door TBI-geïnduceerde hippocampus disfunctie 2,3. Om aan te tonen hoe veranderde de hippocampus circuit functie negatief gedrag beïnvloedt na TBI bij muizen, maken we gebruik laterale vloeistof percussie letsel, een veel gebruikte diermodel van TBI die veel kenmerken van de menselijke TBI waaronder neuronale cel verlies, gliose, en ionische verstoring 4 herschept - 6.
Hier laten we zien een combinatoriële werkwijze voor het onderzoeken TBI-geïnduceerde disfunctie hippocampus. Onze aanpak bevat meerdere ex vivo fysiologische technieken met diergedrag en biochemische analyse, om te analyserenna TBI veranderingen in de hippocampus. We beginnen met de experimentele letsel paradigma samen met gedragsanalyse om cognitieve handicap te beoordelen volgens TBI. Vervolgens hebben we voorzien van drie verschillende ex vivo opnametechnieken: extracellulaire gebied potentiële opname, gevisualiseerd whole-cell patch-klemmen, en de spanning gevoelige kleurstof opname. Tot slot tonen we een methode voor regionaal ontleden subregio's van de hippocampus die nuttig kunnen zijn voor een gedetailleerde analyse van de neurochemische en metabole veranderingen na traumatisch hersenletsel.
Deze methoden zijn gebruikt om de veranderingen in hippocampale circuits onderzocht na TBI en de tegengestelde veranderingen in netwerk circuit functie die optreden in de dentate gyrus en CA1 subgebieden van de hippocampus (zie figuur 1) probe. Het vermogen om de post-TBI veranderingen in elk deelgebied analyseren is essentieel voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen die bijdragen aan TBI geïnduceerde gedrags-en cognitieve deficits.
De veelzijdige systeem hier beschreven kunnen onderzoekers het verleden karakterisering van de fenomenologie veroorzaakt door een ziekte (in dit geval TBI) te duwen en de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de waargenomen pathologie geassocieerd met TBI te bepalen.
Protocol
1. Laterale Fluid Percussie Injury
- Verdoof de muis met een mengsel van ketamine en xylazine intraperitoneaal. Maak vervolgens de muis het hoofd voor incisie met behulp van een jodium scrub.
- Voer een craniectomie over het rechter pariëtale gebied met behulp van 3 mm (buitendiameter) trephine.
- Secure Luer-loc naald hub (binnendiameter 3 mm) over de craniectomie met cyanoarylate en tandheelkundige acryl.
- 24 uur later, verdoven de muis met behulp van isofluraan via inademing.
- Zodra normale ademhaling hervat, maar voordat de muis gevoelig wordt voor stimulatie, 20 msec puls van zoutoplossing leveren in de schedel via het fluïdum percussie schade apparaat.
- Verwijder onmiddellijk na een blessure de hub, reanaesthetize de muis met behulp van isofluraan, en hechten de hoofdhuid gesloten.
Sham bediende ontvangt een identieke procedure met stap 1.5 weggelaten.
2. Behavioral Analysis - Geconditioneerde Angst Response
- Behandel muizen op twee opeenvolgende dagen voorafgaand aan de geconditioneerde angstreactie (CFR) opleiding.
- Plaats de muis in conditionering kamer voor 3 minuten vóór de toediening van 1,5 mA verdieping schok voor 2 sec. Reactie muis in de kamer gedurende 30 sec.
- Na bepaalde tijd periode (meestal 24 uur), terug de muis om te conditioneren kamer voor 5 minuten. Beoordeel bevriezen op 5 sec intervallen.
Analyse bestaat uit het vergelijken van de relatieve hoeveelheid tijd bevriezen in twee populaties, in ons geval hersenen verwonde muizen en schijn-geopereerde controles. Lagere vriessnelheden (in vergelijking met controle) geven het onvermogen om de associatie tussen de context en de vloer schok, een indicatie van geheugenstoornissen en cognitieve disfunctie te behouden.
3. Voorbereiding Acute hippocampus Slices
* Opmerking: verdoving met een stolp kan alleen worden uitgevoerd voor terminal procedures (zoals de hersenen dissectie hierin beschreven).
- 7 dagen naschade maak 1 L kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) en 250 ml sucrose snijden oplossing.
- Royaal Gebruik ijs om ervoor te zorgen dat alle instrumenten en oplossingen die tijdens de hersenontwikkeling slice voorbereiding zijn ijskoud.
- Verdoof de muis met behulp van isofluraan. Snel en verwijder voorzichtig de hersenen van de muis en plaats in sucrose.
- Trim hersenen en plaats op snijoppervlak op een druppel secondelijm voor een agar blok.
- Snijd 350 pm dikke coronale plakken, moet u in staat om 4 of 5 plakjes te komen met de intacte hippocampus circuit.
- Incubeer plakken ten minste 1 uur bij 37 ° C.
4. Extracellulaire Field Potentiële Opname
- Trek borosilicaatglas elektroden tot 2-5 MΩs met behulp van verticale trekker.
- Plaats slice in de kamer en steek elektrode op elektrodehouder.
- Laat stimulerende elektrode in slice in een axonale-darmkanaal, zoals de perforant pad of Schaffer collateralen. Lagere registratie-elektrodein positie tijdens het monitoren uitgang sporen te waarborgen dat elektroden op hetzelfde niveau z (diepte). Bij een maximale respons wordt bereikt, houdt stimulatiestroom niveau constant, elektroden op hetzelfde niveau z.
- De resulterende spoor bestaat uit drie componenten: de presynaptische vezel volley, het gebied extracellulaire postsynaptische potentiaal (fEPSP), en de postsynaptische bevolking spike. De componenten kunnen tijdelijk overlappen in sommige preparaten waardoor analyse bemoeilijkt. Als er onduidelijkheid tussen of reacties zijn presynaptische of postsynaptische, kan APV en CNQX worden toegevoegd aan het bad om exciterende transmissie blokkeren en alle overige signalen worden van presynaptische oorsprong.
- Stimulatie protocollen te variëren om drie verschillende types experimenteren produceren: input / output curven, gekoppeld pols opnamen, en op lange termijn plasticiteit experimenten.
Analyse bestaat typisch uit metingen vergelijken van de helling van de fEPSP in zowel hersenen verwonde muizen en shamBediende, gecontroleerd voor de input kracht door het meten van de vezel volley.
5. Gevisualiseerd Patch-clamp-opname
- Bereid plakjes, elektroden en tuig op te nemen, zoals eerder hierboven beschreven tot 4,2 stappen.
- Alleen overwegen cellen dieper dan 80 micrometer in het weefsel als cellen dichter bij de oppervlakte zal dood zijn en / of een verminderde connectiviteit. Naderen van een cel met positieve druk op de elektrode te zorgen dat het niet verstopt raken omdat het naar beneden door het weefsel. Wanneer de elektrode voorzichtig raakt de cel onderdruk toegepast om een "gigaseal 'tussen de elektrode en het plasmamembraan te maken.
- Toepassing korte uitbarstingen van onderdruk om de breuk Plama membraan onder de elektrode en het bereiken van gehele celconfiguratie.
- Elimineer capaciteit transiënten met versterker en compenseren serieweerstand. Compenseren van de serieweerstand van de cel is essentieel om een zorgenccurate metingen.
- Twee manieren van enkele cel opnamen kunnen worden uitgevoerd: stroomtang (meet membraan spanning) en spanning klem (het meten van stroom die door ionenkanalen in het membraan).
Mogelijke soorten analyses zijn talrijk, maar in ons geval bestaan voornamelijk uit biofysische analyse kwantificeren van de snelheid en de grootte van spontane synaptische stromen in zowel de hersenen-verwonde muizen en schijn-geopereerde controles.
6. Voltage Sensitive Dye Imaging (VSD)
- Bereid plakjes en tuig op te nemen, zoals eerder hierboven beschreven tot 4,2 stappen.
- Bereid door het mengen kleurstof stock 1 mg di-3-ANEPPDHQ in 50 pi ethanol, afgezien 2 pi aliquots in folie verpakt buizen bij -20 ° C. Het werken kleurstofoplossing dagelijks door verdunning 1:200 in aCSF.
- Incubeer slice op aCSF bevochtigd filtreerpapier en vlekken met 90 ul van kleurstof voor 16 min; spoelen met aCSF en plaats in de interface van de opname kamer.
- Pas licht stimulatie vann intensiteit totdat reactie is gecentreerd in het midden van camera's. Beelden worden meestal verkregen met een snelheid van 500-1000 frames per seconde.
- Trigger sluiter voor lichte stimulatie 200 msec voor elektrische stimulatie toe te staan initiële snelle fotobleken te stabiliseren. Alternatieve overname proeven tussen elektrisch gestimuleerde en niet-elektrisch gestimuleerd om later aftrekken van niet-gestimuleerde achtergrond maken. Record rust lichtintensiteit (fluorescentie lezing met gesloten sluiter) voorafgaand aan de opening sluiter. Elke VSD proef zal een x pixels bij y pixels zijn door de tijd "film" van fluorescentie metingen. Record 10 tot 12 VSD proeven in verschillende testomstandigheden.
- Alle metingen worden uitgevoerd op de intra-pixel pre-elektrische stimulus-genormaliseerde fluorescentie verandering dF / F, die wordt berekend als volgt:
Trek de rust lichtintensiteit van de VSD ruwe verworven proces. Voor elke pixel in elke test normaliseren volgens de vooraf-elektrische stimulus-gemiddelde waarde voor dieproces, en aftrekken van eenheid. Doe dit voor zowel de elektrisch gestimuleerde en niet-elektrisch gestimuleerd proeven. Een gemiddelde "achtergrond fluorescentie" beproeving van de niet-elektrisch gestimuleerde trials, en aftrekken van deze achtergrond proces de elektrisch gestimuleerde trials. Verdere analyse wordt kenmerkend uitgevoerd op het gemiddelde van 10 - 12 deze proeven, die meestal ook worden gefilterd in ruimte en tijd van de signaal-ruisverhouding te verbeteren.
7. Regionale Dissections voor Biochemische analyses
- Verwijder de hersenen van de muis zoals eerder beschreven.
- Bereid plakjes met behulp van weefsel chopper.
- Leg gedeelte vlak, microdissect gebied CA1 en DG.
- Onmiddellijk onderdompelen in lysisbuffer die proteaseremmers. Bevriezen in vloeibare stikstof en bij -80 ° C.
8. Representatieve resultaten
Onze experimenten meestal beginnen met gedrags-gegevens naar de verwachten te bevestigened cognitieve stoornissen die er bestaan in de hersenen-verwonde muizen. We maken gebruik van contextuele airconditioning angstreactie testen want het is een hippocampus afhankelijk gedrag die betrouwbaar en vereist slechts een trainingssessie en een testsessie. De data weergegeven in Figuur 2 gedrag testing anterograde geheugen meten, maar de test kan ook worden gebruikt om retrograde geheugen meten of de training wordt uitgevoerd vóór de verwonding.
Field excitatoire postsynaptische potentialen (fEPSPs) gemeten die de netto synaptische werkzaamheid van een grote populatie van cellen (Figuur 3A) bepalen. We meestal hebben drie verschillende types van stimulatie patronen, elk affording zijn eigen resultaten en conclusies. Eerste, door het verhogen van de stimulatie-intensiteit door een reeks stappen, maken we een input / output curve (figuur 3B / C).
Vervolgens door het leveren van twee stimulaties van dezelfde intensiteit afzonderlijked door een korte vertraging (meestal 50 msec) hebben we de potentiële veranderingen te onderzoeken in synaptische blaasjes vrijkomen van waarschijnlijkheid;. Daarnaast hebben we vaak de site op lange termijn potentiëring (LTP) experimenten. Na vaststelling van een basislijn reactie korte hoogfrequente stimulatie (meestal 100Hz) met dezelfde intensiteit wordt geleverd, waardoor een intracellulaire cascade die leidt tot een versterkte reactie op normale synaptische stimulatie wordt hervat.
Elektrische activiteit van gehele-cel patch-cellen geklemd kan worden opgenomen in twee modi. In spanningsklem modus regelt de experimentator het membraan spanning van de patch-geklemd cel verwijzing naar het bad, via computer software die hoort bij de versterker. In dit geval stromen bemiddelen postsynaptische gebeurtenissen opgenomen, informatie over presynaptische vrijlating frequentie, aantal geactiveerde postsynaptische receptoren en vesiculaire neurotransmitter concentratie (Figuur 4A). In de stroomtang modus de experimentatormanipuleert geïnjecteerde stroom en meet de spanning reactie. Dit kan nuttig zijn de kenmerken van de actiepotentiaal zoals actiepotentiaal drempel en half-breedte te bepalen. Deze kenmerken zorgen voor de functionele indeling van neuronen als prikkelende of remmende gebaseerd op de actiepotentiaal afvuren (Figuur 4B). Om de cellulaire identiteit te verifiëren raden vullen cellen met Lucifer Yellow na de opname en visueel bevestigen identiteit door de aanwezigheid of afwezigheid van dendritische spines. (Figuur 4C, D).
Een voorbeeld van de resultaten van een experiment met spanningsgevoelige kleurstof veranderingen in membraan spanning te meten is weergegeven in figuur 5. In dit geval is een stimulerende elektrode geplaatst in de Schaffer collaterale route en de resulterende neuronale activiteit in gebied CA1 wordt geanalyseerd. Voltagegevoelige kleurstof niet aangeeft absolute waarden van membraan voltage, maar thij verandering in spanning van een referentietoestand zonder stimulatie. Echter, analyse waarin twee voorwaarden (bijvoorbeeld brain-versus gewonden schijn-geopereerde) worden gebruikt om de tijdruimtelijke parameters van fysiologische veranderingen die niet kunnen worden gemeten met fEPSPs of whole-cell patch-clamp opname te bepalen.
Figuur 1. Hippocampale schakelschema. Een horizontale doorsnede door de hippocampus. De belangrijkste paden door de hippocampus worden in geel weergegeven. De axonen van de neuronen in de cortex entorhinale project via de perforant pad in de dentate gyrus vormen synapsen met de dendrieten van dentate gyrus granule cellen. Korrel cel axonen project via de mosvezel weg naar CA3 waar ze synapsen vormen met de dendrieten van CA3 neuronen. De axonen van neuronen CA3 project via de Schaffer collaterale route op de Dendrites van CA1 pyramidale cellen. De axonen van CA1 pyramidale cellen projecteren van de hippocampus door de subiculum. Opmerking: Ook afgebeeld zijn CA3 piramidale cellen axon collateralen projecteren naar de contralaterale hippocampus via de fimbria. (CA1: Cornu Ammonis 1, CA2: Cornu Ammonis 2, CA3: Cornu Ammonis 3, DG: dentate gyrus, stippellijn geeft cellichaam laag, ononderbroken lijn geeft structurele grenzen.)
Figuur 2. Vertegenwoordiger Behavioral Data A:. Behavioral gegevens beeltenis van het verschil in de vrieskou tarieven tussen hersenen-verwonde muizen (FPI) en schijn-geopereerde controles (sham) in geconditioneerde angstreactie paradigma. Training vond plaats op de 6 e dag na de verwonding, met de testperiode die zich 24 uur later. (** Duidt p <0,01).
Figuur 3. Representatieve extracellulaire Data A:. Een voorbeeld van een veld exciterend postsynaptische potentiaal (fEPSP) opname in gebied CA1. De eerste afbuiging omlaag is de stimulus artefact, gevolgd door de presynaptische vezel volley en tenslotte de fEPSP. B: Input / output curven afbeelding van een daling van de netto synaptische werkzaamheid bij CA1 volgende vloeistof percussie letsel (FPI). C: Input / output curven afbeelding van een stijging van de netto synaptische werkzaamheid bij dentate gyrus (DG) na FPI. (* Duidt p <.05). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Vertegenwoordiger whole-cell patch-clamp Data A:. Een voorbeeld spontaneprikkelend postsynaptische stroom (sEPSC) van een CA1 pyramidale cel. B: Voorbeelden van actiepotentiaal treinen uit een CA1 pyramidale cel (bovenste curve) en een snelle stekelige CA1 interneuron (onderste spoor). C: Voorbeeld van een Lucifer Yellow gevuld CA1 remmende interneuron. Let op de afwezigheid van dendritische spines (bovenste paneel). D: Voorbeeld van Lucifer Yellow gevuld CA1 pyramidale neuron. Let op de aanwezigheid van dendritische spines (bovenste paneel). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. Vertegenwoordiger Voltage Sensitive Dye Imaging Data A:. Muis coronale hippocampus slice weergegeven om de anatomie. (DG: dentate gyrus, CA1: Cornu Ammonis 1) B: Geel tot rode pixels die excitatoire activiteit in het gebied CA1 14 msec na afferente Schaffer onderpand stimulatie. Roodfect meer depolarisatie terwijl geel wijst op een lager, maar nog steeds aanzienlijk depolarisatie. C: Blauw pixels die sites van remmende activiteit in het gebied CA1 56 msec na dezelfde afferente Schaffer onderpand stimulatie getoond in B. Donkerder blauw geeft meer hyperpolarisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elke techniek hierboven geschetste draagt bij aan het beter begrip van de onderliggende mechanisme waardoor de geobserveerde gedrag tekort. Door de unieke informatie uit elke methode kunnen we de biologische mechanismen nauwkeuriger te onderzoeken.
Meten fEPSPs is nuttig voor het kwantificeren van de netto synaptische werkzaamheid van grote ruimtelijk gedefinieerde gebieden van neuronen. Het kan ook informatie over de mogelijkheden van een groep cellen aan synaptische plasticiteit ondergaan bieden, een neurale correlaat van leren en geheugen. Het is een nuttige eerste punt van elektrofysiologische analyse zoals het is technisch eenvoudig en geeft informatie over bredere maatregelen van het circuit functie.
In tegenstelling tot fEPSPs, whole-cell patch-clamp-opname geeft gedetailleerde informatie over de elektrofysiologische parameters van een enkele cel. Het is een zeer divers techniek als een groot aantal verschillende parameters en types van synaptische inputs kan worden gemeten, afhankelijk van de opnameomstandigheden (farmacologische middelen in de pipet of bad, houdspanning, opnamemodus, etc.). Bijvoorbeeld kan whole-cell patch-clamp-opname worden gebruikt om de relatieve bijdragen van exciterende en inhiberende synaptische transmissie differentiëren tot een waargenomen verschil in netto synaptische werkzaamheid zoals beschreven door fEPSPs.
Spanning gevoelige kleurstof imaging experimenten vergroten van de kennis die is opgedaan door de meer traditionele elektrofysiologische technieken hierboven beschreven door het verstrekken van informatie over de spatio-temporele dynamiek van circuits veranderingen. De spatiotemporele profiel van elke wijziging kan worden gebruikt om hypotheses over de mogelijke celtypes die betrokken kunnen zijn bij genereerschakeling dysfunctie, die vervolgens kunnen worden geanalyseerd door meer gerichte benaderingen, zoals whole-cell patch-klem genereren.
In ons geval hebben we eerder aangetoond en anderen subregiop specifieke veranderingen in de netto synaptische doeltreffendheid 7-9, die aan het karakteriseren van de onmogelijkheid om LTP genereren in CA1 leidde na TBI 10. Verdere studies gebruik van een mix van moleculaire biologische technieken en elektrofysiologische het mechanisme achter de waargenomen onevenwichtigheid van exciterende / remmende synaptische transmissie 11 onderzoeken. Belangrijk is dat deze studies gebruikt gedrag niet alleen een cognitieve stoornissen tonen na TBI, maar ook de doeltreffendheid van een dieetbehandeling strategie uit de resultaten die bij het gebruik van onze combinatorische benadering te valideren.
Niets van deze veelzijdige systeem beperkt de toepassing ervan op het gebied van TBI of de regio van belang zijn voor de hippocampus. Inderdaad, het combineren van dit instrumentarium waarschijnlijk leiden tot biomechanistic beschrijvingen van waargenomen verschillen in gedrag in een aantal neurologische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken Bourgeois voor zijn technische bijstand Elliot. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health subsidies R01HD059288 en R01NS069629.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | AXOPATCH 200B | Patch-clamp rig |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | Patch-clamp rig | |
| MP-225 micromanipulator | Sutter | MP-225 | Patch-clamp rig |
| DMLFSA microscope | Leica | Patch-clamp rig | |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Multipurpose (field) rig |
| Digidata 1440 digitizer | Molecular Devices | Multipurpos (field) rig | |
| MPC-200 micromanipulator | Sutter | MPC-200 | Multipurpose (field) rig |
| BX51WI microscope | Olympus | BX51WI | Multipurpose (field) rig |
| Axoclamp 900A amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 900A | VSD rig |
| Digidata 1322 digitizer | Molecular Devices | VSD rig | |
| Redshirt CCD-SMQ camera | Redshirt | NCS01 | VSD rig |
| VT 1200S Vibratome | Leica | 14048142066 | |
| P-30 Electrode puller | Sutter | P-30/P | |
| cOmplete protease inhibitor | Roche | 11697498001 |
References
- Faul, M., Xu, L., Wald, M. M., Coronado, V. G. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits Hospitalizations and Deaths 2002-2006. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , (2010).
- McAllister, T. W. Neuropsychiatric sequelae of head injuries. Psychiatr. Clin. North Am. 15, 395-413 (1992).
- Pierce, J. E., Smith, D. H., Trojanowski, J. Q., McIntosh, T. K. Enduring cognitive, neurobehavioral and histopathological changes persist for up to one year following severe experimental brain injury in rats. NSC. 87, 359-369 (1998).
- Dixon, C. E., et al. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. J. Neurosurg. 67, 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
- Carbonell, W. S., Grady, M. S. Regional and temporal characterization of neuronal, glial, and axonal response after traumatic brain injury in the mouse. Acta Neuropathol. 98, 396-406 (1999).
- Toth, Z., Hollrigel, G. S., Gorcs, T., Soltesz, I. Instantaneous perturbation of dentate interneuronal networks by a pressure wave-transient delivered to the neocortex. J. Neurosci. 17, 8106-8117 (1997).
- D'Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R., Janigro, D. Selective loss of hippocampal long-term potentiation, but not depression, following fluid percussion injury. Brain Res. 786, 64-79 (1998).
- Witgen, B. M. Regional hippocampal alteration associated with cognitive deficit following experimental brain injury: A systems, network and cellular evaluation. Neuroscience. 133, 1-15 (2005).
- Schwarzbach, E., Bonislawski, D. P., Xiong, G., Cohen, A. S. Mechanisms underlying the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury. Hippocampus. 16, 541-550 (2006).
- Cole, J. T. Dietary branched chain amino acids ameliorate injury-induced cognitive impairment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 366-371 (2010).
