Undersøkelser på Endringer i Hippocampus Circuit Funksjon Etter mild traumatisk hjerneskade

Summary

En mangesidig tilnærming til å undersøke funksjonelle endringer i hippocampus kretsene er forklart. Elektrofysiologiske teknikker er beskrevet sammen med skaden protokollen, atferdsmessige testing og regional disseksjon metoden. Kombinasjonen av disse teknikker kan anvendes på lignende måte for andre områder av hjernen og vitenskapelige spørsmål.

Abstract

Traumatisk hjerneskade (TBI) rammer mer enn 1,7 millioner mennesker i USA hvert år, og selv mild TBI kan føre til vedvarende nevrologiske svekkelser ^en. To gjennomgripende og invalidiserende symptomer oppleves av TBI overlevende, minne underskudd og en reduksjon i krampeterskelen, antas å være mediert av TBI-indusert hippocampus dysfunksjon ^2,3. For å demonstrere hvordan endret hippocampus krets funksjon negativt påvirker atferd etter TBI i mus, ansetter vi lateral væske perkusjon skade, et vanlig dyr modell av TBI som gjenskaper mange funksjoner i menneskets TBI inkludert neuronal celle tap, gliosis, og ionisk perturbasjon ^{4 - 6.}

Her viser vi en kombinatorisk metode for å undersøke TBI-indusert hippocampus dysfunksjon. Vår tilnærming omfatter flere ex vivo fysiologiske teknikker sammen med dyrs adferd og biokjemisk analyse, for å analyserepost-TBI endringer i hippocampus. Vi begynner med den eksperimentelle skade paradigmet sammen med atferdsanalyse å vurdere kognitiv funksjonshemming etter hodeskader. Deretter har vi tre forskjellige ex vivo opptak teknikker: ekstracellulære felt potensielle opptak, visualisert hel-celle patch-klemming og spenning sensitive dye opptak. Endelig viser vi en metode for regionalt dissekere underregioner av hippocampus som kan være nyttig for detaljert analyse av nevrokjemiske og metabolske endringer etter TBI.

Disse metodene har blitt brukt til å undersøke endringer i hippocampus kretser etter TBI og å sondere motstanderens endringer i nettverket krets funksjon som oppstår i dentate gyrus og CA1 underregioner av hippocampus (se figur 1). Evnen til å analysere post-TBI endringer i hver underregion er nødvendig for å forstå de underliggende mekanismene som bidrar til TBI-indusert atferdsmessige og kognitive deficits.

Den mangesidig system beskrevet her tillater undersøkere å skyve fortiden karakterisering av fenomenologi indusert av en sykdomstilstand (i dette tilfellet TBI) og bestemme mekanismene som er ansvarlige for den observerte patologi assosiert med hodeskader.

Protocol

1. Lateral Fluid Perkusjon Injury

1. Anaesthetize musen med en blanding av ketamin og xylazin gitt intraperitonealt. Deretter forberede musen hode for innsnitt ved hjelp av en jod kratt.
2. Utfør en craniectomy over høyre parietal området ved hjelp av 3 mm (utvendig diameter) trephine.
3. Sikker Luer-loc nål hub (innvendig diameter 3 mm) over craniectomy hjelp cyanoarylate og dental akryl.
4. 24 timer senere, anaesthetize musen med isofluran via inhalasjon.
5. Gang normal pusting gjenopptas, men før musen blir følsom for stimulering, levere 20 msek puls av saltvann inn i kraniet via fluidet perkusjon skade enheten.
6. Umiddelbart etter skade fjerne hub, reanaesthetize musen med isofluran, og sy igjen hodebunnen lukket.
   Sham spaker vil motta et identisk prosedyre med trinn 1.5 utelatt.

2. Behavioral Analysis - Conditioned Fear Response

1. Håndtere mus på to påfølgende dager før betinget frykt respons (CFR) trening.
2. Sted mus i condition kammer for 3 min før administrering 1,5 mA etasje sjokk for 2 sek. Forlate musen i kammeret for ytterligere 30 sek.
3. Etter Forsinkelsesperioden (vanligvis 24 timer), returnere musen til condition kammer i 5 min. Vurdere iskaldt på 5 sek intervaller.
   Analyse består av å sammenligne den relative mengde av tid frysing i to populasjoner, i vårt tilfelle hjerne-skadde mus og skinn-opererte kontroller. Lavere frysing priser (i forhold til kontroll) indikerer manglende evne til å beholde tilknytningen mellom kontekst og gulvet sjokk, en indikasjon på svekket hukommelse og kognitiv dysfunksjon.

3. Forbereder Akutt hippocampus Slices

* Merk: Anesthetization ved hjelp av en Bell Jar kan bare gjennomføres for terminal prosedyrer (for eksempel hjernen disseksjon beskrevet).

1. 7 dager etterskade, gjør en L av kunstig cerebral spinal væske (aCSF) og 250 ml sukrose cutting løsning.
2. Bruk isen liberalt å sikre at alle instrumenter og løsninger som brukes under hjernen skive forberedelse er iskald.
3. Anaesthetize mus med isofluran. Raskt og forsiktig fjerne hjernen fra mus og sted i sukrose.
4. Trim hjernen og sted på snittflaten på en dråpe superlim foran en agar blokk.
5. Skjær 350 mikrometer tykke koronale skiver, bør du være i stand til å få 4 eller 5 stykker med intakt hippocampus krets.
6. Inkuber skiver for minst 1 time ved 37 ° C.

4. Ekstracellulære Felt Potential opptak

1. Trekk borosilicate glass elektroder til 2-5 MΩs med vertikal avtrekker.
2. Sted skive i kammeret og sett elektroden på elektrodeholderen.
3. Senk stimulerende elektrode inn skive i en aksonal skrift som perforant banen eller Schaffer collaterals. Nedre opptak elektrodei stilling mens overvåke utgangsfrekvens spor for å sikre at elektrodene er i samme z-nivå (dybde). Når en maksimal respons oppnås, holder stimulering dagens nivå konstant, elektroder er på samme z-nivå.
4. Den resulterende kurven består av tre komponenter: den presynaptiske fiber volley, feltet ekstracellulære postsynaptiske potensial (fEPSP) og postsynaptisk befolkningen pigg. Komponentene kan overlappe timelig i enkelte preparater gjør analyse vanskeligere. Hvis det er tvetydighet mellom hvorvidt responser er presynaptisk eller postsynaptisk, kan APV og CNQX bli tilsatt til badet for å blokkere eksitatoriske overføring, og alle gjenværende signaler vil være av presynaptisk opprinnelse.
5. Stimuleringsregimer varierer å produsere tre forskjellige eksperiment typer: input / output kurver, sammen puls innspillinger og langsiktige plastisitet eksperimenter.
   Analyse består vanligvis av målinger sammenligne skråningen av fEPSP over i både hjerne-skadet mus og humbugSpaker, kontrollere for innspill styrke ved å måle fiber volley.

5. Visualisert Patch-clamp opptak

1. Forbered skiver, elektroder og rigg å spille som tidligere beskrevet ovenfor frem til trinn 4.2.
2. Bare vurdere celler dypere enn 80 mikrometer i vevet som celler nærmere overflaten vil være død og / eller har redusert tilkobling. Tilnærming en celle med positivt trykk på elektroden for å sikre at den ikke blir tilstoppet som det beveger seg ned gjennom vevet. Når elektroden vidt berører cellen anvende undertrykk for å skape en "gigaseal 'mellom elektroden og plasmamembranen.
3. Påfør korte støt med undertrykk for å sprekke Plama membranen under elektroden og oppnå hel-celle konfigurasjonen.
4. Eliminere kapasitans transienter med forsterker og kompensere for seriemotstand. Kompensering for seriemotstanden av cellen er viktig å sikre enccurate målinger.
5. To moduser av encellede opptak kan utføres: strømtang (måling membran spenning) og spenning klemme (måling strømmen som går gjennom ionekanaler i membranen).
   Mulige typer analyser er mange, men i vårt tilfelle består for det meste av biofysisk analyse kvantifisere frekvensen og størrelsen på spontane synaptiske strømmer i begge hjerne-skadet mus og skinn-opererte kontroller.

6. Spenning Sensitive Dye Imaging (VSD)

1. Forbered skiver og rigg å spille som tidligere beskrevet ovenfor frem til trinn 4.2.
2. Forbered fargestoff lager ved å blande 1 mg di-3-ANEPPDHQ i 50 ul etanol, dispensere 2 pl alikvoter inn folie innpakket rør, lagre ved -20 ° C. Gjøre arbeidet fargeløsning daglig, ved å fortynne 1:200 i aCSF.
3. Inkuber stykke på aCSF fuktet filter papir og beis med 90 pl fargestoff for 16 min, skyll med aCSF og plasser i grensesnittet opptak kammer.
4. Juster lys stimulation intensitet før respons er sentrert i midten av kamera-serien. Bildene er typisk kjøpt med en hastighet på 500-1000 bilder per sekund.
5. Trigger skodde for lett stimulering 200 msek før elektrisk stimulering for å tillate første rask fotobleking å stabilisere seg. Alternative innhentingstider forsøk mellom elektrisk stimulert, og ikke-elektrisk stimulert, å tillate senere subtraksjon av ikke-stimulert bakgrunn. Record hvile lysintensitet (fluorescens lesing med skodde lukket) før du åpner lukkeren. Hver VSD rettssaken vil bli en x piksler x y piksler tid "film" av fluorescens målinger. Record 10-12 VSD forsøk i hver test tilstand.
6. Alle målinger utføres på den intra-pixel pre-elektrisk-stimulus normalisert fluorescens endring følger dF / F, som er beregnet som:
   Trekk fra hvile lysintensiteten fra VSD rå ervervet rettssaken. For hver piksel i hver studie, normalisere henhold til pre-elektriske-stimulus middelverdi for detrettssaken, og trekke enhet. Gjør dette for både elektrisk stimulert og ikke-elektrisk stimulert studier. Lag en gjennomsnittlig "bakgrunnsfluorescens" prøveversjon fra de ikke-elektrisk stimulert studier, og trekke denne bakgrunn prøveversjon fra de elektrisk stimulert studier. Videre analyser utføres typisk på gjennomsnittet av 10 til 12 slike forsøk, som også vanligvis er filtrert i rom og tid for å forbedre signal-til-støy-forhold.

7. Regionale disseksjoner for Biokjemiske analyser

1. Fjern hjernen fra musen som tidligere beskrevet.
2. Forbered skiver med vev helikopter.
3. Lay delen flat, microdissect området CA1 og DG.
4. Umiddelbart senkes i lyseringsbuffer inneholder proteasehemmer. Fryse i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C.

8. Representant Resultater

Våre eksperimenter begynner vanligvis med adferdsdata å bekrefte forventeed kognitiv svikt som finnes i hjerne-skadet mus. Vi benytter kontekstuell betinget frykt respons testing som det er en hippocampus avhengig atferd som er pålitelig og trenger bare én treningsøkt og en testøkt. Dataene som er avbildet i Figur 2 representerer atferdsmessige testing for å måle anterograd hukommelse, men kan testen også brukes til å måle retrograd minne hvis treningsøkten utføres før skaden.

Felt eksitatoriske postsynaptiske potensialer (fEPSPs) måles for å bestemme netto synaptiske effekt av en stor populasjon av celler (figur 3A). Vi vanligvis benytter tre ulike typer stimulering mønstre, hver affording sine egne resultater og konklusjoner. Først, ved å øke stimulering intensitet gjennom en rekke trinn, skaper vi en input / output kurve (figur 3B / C).

Neste, ved å levere to stimuleringer av samme intensitet separatd med en kort forsinkelse (vanligvis 50 millisekunder) vi undersøke mulige endringer i synaptiske vesicle utgivelse sannsynlighet;. I tillegg har vi ofte utfører langsiktig potensering (LTP) eksperimenter. Etter å etablere en grunnlinje respons, kort høyfrekvent stimulering (vanligvis 100 Hz) på samme intensitet er levert, forårsaker en intracellulær kaskade som fører til en Forsterket synaptisk respons når normal stimulering gjenopptas.

Elektrisk aktivitet fra hel-celle patch-festet celler kan registreres i to moduser. I spenning klemme modus styrer experimenter membranen spenning av patch-fastklemt celle i referanse til badekaret, via datamaskinen programvaren tilknyttet forsterkeren. I dette tilfellet strøm medierer postsynaptiske hendelser er registrert, gir informasjon om presynaptisk utgivelsen frekvens, antall postsynaptiske reseptorer aktiveres og vesikulær nevrotransmitter konsentrasjon (Figur 4A). I strømtang modus eksperimentatormanipulerer injisert strøm og måler spenningen respons. Dette kan være nyttig for å bestemme egenskapene til aksjonspotensialet eksempel aksjonspotensialet terskel og halv bredde. Disse egenskapene tillate for funksjonelle kategorisering av nevroner som eksitatoriske eller hemmende basert på deres aksjonspotensial firing mønstre (fig. 4B). For å bekrefte mobilnettet identitet vi anbefale å fylle celler med Lucifer Yellow etter opptak og visuelt bekrefter identitet ved tilstedeværelse eller fravær av dendrittiske spines. (Figur 4C, D).

Et eksempel på resultater fra et eksperiment ved hjelp spenningsfølsom fargestoff å måle endringer i membran spenning er vist i figur 5. I dette tilfellet, har en stimulerende elektrode blitt plassert i Schaffer sikkerheter sti og resulterende neuronal aktivitet i området CA1 er analysert. Spenningsfølsom fargestoff rapporterer ikke absolutte verdier av membran spenning, men heller tHan endring i spenning fra et utgangspunkt tilstand uten stimulering. Imidlertid, kan analyser sammenligne to betingelser (f.eks hjerne-skadd vs sham-opererte) brukes for å bestemme de Spatiotemporal parametre fysiologiske forandringer som ikke kan måles ved hjelp av fEPSPs eller hel-celle patch-clamp opptak.

Figur 1. Hippocampus kretsskjema. En horisontal snitt gjennom hippocampus. De store trasé gjennom hippocampus er vist i gult. Axons fra nevroner i entorhinal cortex prosjektet via perforant vei inn dentate gyrus danner synapser med dendritter av dentate gyrus granule celler. Granule celle axoner prosjektet via mosegrodd fiber veien til CA3 hvor de danner synapser med dendritter av CA3 nerveceller. Axons av CA3 nevroner prosjektet via Schaffer sivile vei bort på dendrites av CA1 pyramidale celler. Axons av CA1 pyramidale celler projisere ut av hippocampus gjennom subiculum. Merk: Også avbildet er CA3 pyramidale celler axon collaterals prosjektering til kontralaterale hippocampus via fimbria. (CA1: Cornu en Ammonis, CA2: Cornu 2 Ammonis, CA3: Cornu 3 Ammonis, DG: dentate gyrus, indikerer stiplet linje cellen kroppen lag, heltrukket linje angir strukturelle grenser.)

Figur 2. Representative Behavioral Data A:. Behavioral data som viser forskjellen i iskaldt priser mellom hjerne-skadet mus (FPI) og sham-spaker (humbug) i kondisjonert frykt respons paradigme. Trening skjedde den ^6. dagen etter skade, med testperioden forekommende 24 timer senere. (** Betegner p <0,01).

Figur 3. Representative ekstracellulær-data A:. Et eksempel på et felt eksitatoriske postsynaptiske potensial (fEPSP) opptak i området CA1. Den første nedadgående nedbøyningen stimulans artefakt, etterfulgt av den presynaptiske fiber volley og endelig fEPSP. B: Input / output kurver som viser en nedgang i netto synaptisk effekt i CA1 følgende væske perkusjon skade (FPI). C: Input / output kurver som viser en økning i netto synaptisk effekt i dentate gyrus (DG) etter FPI. (* Betegner p <0,05). Klikk her for å se større figur .

Figur 4. Representative Hel-celle Patch-clamp Data A:. Et eksempel spontaneksitatoriske postsynaptiske strøm (sEPSC) fra en CA1 pyramidal celle. B: Eksempler på aksjonspotensial tog fra en CA1 pyramidal celle (øvre spor) og en rask skyter CA1 interneuron (nedre spor). C: Eksempel på en Lucifer Yellow fylt CA1 hemmende interneuron. Legg merke til fraværet av dendrittiske spines (øvre panel). D: Eksempel på Lucifer Yellow fylt CA1 pyramidal neuron. Legg merke til tilstedeværelsen av dendrittiske spines (øvre panel). Klikk her for å se større figur .

Figur 5. Representative spenningsfølsom Dye Imaging Data A:. Mouse koronale hippocampus skive vises til å vise anatomi. (DG: dentate gyrus, CA1: Cornu Ammonis 1) B: gult til rødt piksler representerer eksitatoriske aktivitet i området CA1 14 msek etter afferent Schaffer sivile stimulering. Rød idicates mer depolarisering mens gul indikerer en lavere, men likevel betydelig depolarisering. C: Blå piksler som representerer områder av hemmende aktivitet i området CA1 56 msek etter samme afferent Schaffer sikkerhet stimulering vist i B. mørkere blå indikerer mer hyperpolariseringen.

Discussion

Hver teknikk som er skissert ovenfor bidrar til større forståelse av den underliggende mekanisme forårsaker observerte atferdsmessige underskudd. Ved å kombinere den unike informasjonen han fikk fra hver metode kan vi undersøke de biologiske mekanismene med mer presisjon.

Måle fEPSPs er nyttig for kvantifisering av netto synaptiske effekt av store, romlig definerte regioner av nerveceller. Det kan også gi informasjon om potensialet for en gruppe av celler til å gjennomgå synaptisk plastisitet, en neural korrelerer med læring og hukommelse. Det er en nyttig første punktet av elektrofysiologisk analyse som det er teknisk enkelt og gir informasjon om bredere mål på krets funksjon.

I motsetning til fEPSPs gir hel-celle patch-clamp innspilling detaljert informasjon om de elektrofysiologiske parametre av en enkelt celle. Det er en veldig variert teknikk som mange forskjellige parametere og types av synaptiske innganger kan måles avhengig av opptaksforholdene (farmakologiske agenter i pipetten eller bad, holder spenningen, opptaksmodus, osv.). For eksempel, kan hel-celle patch-clamp opptak benyttes for å skille de relative bidragene fra stimulerende og hemmende synaptisk transmisjon til en observert forskjell i netto synaptiske effekt som beskrevet av fEPSPs.

Spenningsstyrte dye bildebehandling eksperimenter øke kunnskapen av de mer tradisjonelle elektrofysiologiske teknikker beskrevet ovenfor ved å gi informasjon om de Spatiotemporal dynamikken i kretser endringer. Den Spatiotemporal profilen eventuelle forandringer kan brukes til å generere hypoteser om potensielle celletyper som kan være involvert i å generere krets dysfunksjon, som deretter kan analyseres gjennom mer målrettede tilnærminger, som hel-celle plasterfrie fastspenning.

I vårt tilfelle har vi og andre tidligere demonstrert subregipå bestemte endringer i netto synaptic effekt ^7-9, noe som førte til karakteriserer manglende evne til å generere LTP i CA1 etter TBI ^10. Videre studier ansatt en blanding av molekylærbiologiske teknikker og elektrofysiologiske å undersøke mekanismen bak den observerte ubalanse av eksitatoriske / hemmende synaptisk overføring ^11. Viktigere, disse studiene ansatt oppførsel ikke bare for å påvise en kognitiv svekkelse etter TBI, men også for å validere effektiviteten av et kosttilskudd behandlingsstrategi avledet fra resultatene oppnådd ved å bruke vår kombinatorisk tilnærming.

Ingenting om dette mangefasetterte systemet begrenser sin søknad til feltet av TBI eller sin region av interesse for hippocampus. Faktisk er kombinasjonen av dette settet med verktøy sannsynligvis føre til biomechanistic beskrivelser av observerte forskjellene i atferd i en rekke nevrologiske sykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices	AXOPATCH 200B	Patch-clamp rig
Digidata 1322A digitizer	Molecular Devices		Patch-clamp rig
MP-225 micromanipulator	Sutter	MP-225	Patch-clamp rig
DMLFSA microscope	Leica		Patch-clamp rig
Multiclamp 700B amplifier	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	Multipurpose (field) rig
Digidata 1440 digitizer	Molecular Devices		Multipurpos (field) rig
MPC-200 micromanipulator	Sutter	MPC-200	Multipurpose (field) rig
BX51WI microscope	Olympus	BX51WI	Multipurpose (field) rig
Axoclamp 900A amplifier	Molecular Devices	AXOCLAMP 900A	VSD rig
Digidata 1322 digitizer	Molecular Devices		VSD rig
Redshirt CCD-SMQ camera	Redshirt	NCS01	VSD rig
VT 1200S Vibratome	Leica	14048142066
P-30 Electrode puller	Sutter	P-30/P
cOmplete protease inhibitor	Roche	11697498001