Summary
En mångsidig strategi för att undersöka funktionella förändringar hippocampus kretsar förklaras. Elektrofysiologiska tekniker beskrivs tillsammans med skadan protokollet beteendetestning och regional dissekeringsmetod. Kombinationen av dessa tekniker kan tillämpas på liknande sätt för andra hjärnregioner och vetenskapliga frågor.
Abstract
Traumatisk hjärnskada (TBI) drabbar mer än 1,7 miljoner människor i USA varje år och även lindrig TBI kan leda till ihållande neurologiska nedskrivningar 1. Två genomgripande och handikappande symtom som upplevs av TBI överlevande, underskott minne och en minskning av kramptröskeln, tros vara medierad av TBI-inducerad hippocampus dysfunktion 2,3. För att visa hur förändrad hippocampus krets fungerar negativt påverkar beteende efter TBI hos möss, använder vi i sidled skada vätska slagverk, en ofta använd djurmodell för TBI som återskapar många funktioner i människans TBI inklusive neuronal cell förlust, glios, och joniska störning 4 - 6.
Här visar vi ett kombinatoriskt sätt för att undersöka TBI-inducerad hippocampus dysfunktion. Vårt tillvägagångssätt innehåller flera ex vivo fysiologiska tekniker tillsammans med djurens beteende och biokemiska analyser, för att analyseraefter TBI förändringar i hippocampus. Vi börjar med den experimentella skador paradigm tillsammans med beteendeanalys för att bedöma kognitiva funktionshinder efter TBI. Därefter har vi tre olika ex tekniker vivo inspelning: extracellulär fältpotential inspelning, visualiseras helcells-patch-klämma och spänning känsligt färgämne inspelning. Slutligen visar vi en metod för regionalt dissekera subregioner av hippocampus som kan vara användbar för detaljerad analys av neurokemiska och metabola förändringar efter TBI.
Dessa metoder har använts för att undersöka förändringar i hippocampus kretsar efter TBI och att sondera de motstående förändringar i nätverk kretsfunktion som inträffar i gyrus dentatus och CA1 subregioner av hippocampus (se figur 1). Förmågan att analysera efter TBI förändringar i varje underområde är viktigt att förstå de bakomliggande mekanismerna som bidrar till TBI-inducerad beteende och kognitiv deficits.
Den mångfasetterade system som beskrivs här ger utredarna att driva förbi karakterisering av fenomenologi inducerad av ett sjukdomstillstånd (i detta fall TBI) och fastställa de mekanismer som är ansvariga för den observerade patologin associerad med TBI.
Protocol
1. Lateral Fluid Percussion Injury
- Bedöva musen med användning av en blandning av ketamin och xylazin intraperitonealt. Sedan förbereda musens huvud för snitt med en jod scrub.
- Utför en kraniektomi över höger parietala området med hjälp 3 mm (ytterdiameter) trefin.
- Säker Luer-loc nålnav (innerdiameter 3 mm) över kraniektomi med cyanoarylate och tandvård akryl.
- 24 timmar senare bedöva musen med isofluran via inandning.
- När normal andning återupptas, men innan musen blir känslig för stimulering, leverera 20 ms puls av saltlösning i skallen via fluidet slagverk skada enheten.
- Omedelbart efter skada bort navet, reanaesthetize musen med isofluran och sy hårbotten stängd.
Skenopererade kontrollerna kommer att få en identisk procedur med steg 1,5 utelämnas.
2. Beteendeanalys - Konditionerat Fear RespOnse
- Hantera möss på två på varandra följande dagar före betingade rädsla svar (CFR) utbildning.
- Placera musen i konditionering kammare 3 minuter före administrering 1,5 chock mA golv för 2 sek. Låt musen i kammaren under ytterligare 30 sek.
- Efter fördröjningsperioden (vanligtvis 24 timmar), återvänder musen till konditioneringskammaren under 5 min. Utvärdera frysning vid 5 sek intervaller.
Analys består i att jämföra den relativa mängden tid frysa i två populationer, i vårt fall brain-skadade möss och skenopererade kontroller. Lägre frysning priser (jämfört med kontroll) visar oförmåga att behålla sambandet mellan sammanhanget och golvet chock, en indikation på minnesförsämring och kognitiv dysfunktion.
3. Förbereda Akut hippocampus skivor
* OBS: bedövning med en glaskupa kan endast genomföras för terminal procedurer (t.ex. hjärnan dissekering beskrivna).
- 7 dagar efterskada, göra 1 liter artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) och 250 ml sackaros lösning för kapning.
- Använd is frikostigt för att säkerställa att alla instrument och lösningar som används under hjärnans skiva beredning är iskall.
- Söva musen med isofluran. Snabbt och försiktigt bort hjärnan från mus och plats i sackaros.
- Trim hjärna och placera på skärande yta på en droppe superlim framför en agar blocket.
- Skär 350 im tjocka koronala skivor, bör du kunna få 4 eller 5 skivor med den intakta hippocampus krets.
- Inkubera segment under minst 1 timme vid 37 ° C.
4. Extracellulär fältpotential inspelning
- Dra borosilikatglas elektroder till 2-5 MΩs med vertikal avdragare.
- Placera skiva i kammare och sätt elektrod på elektrodhållaren.
- Sänk stimulerande elektroden i skiva i en axonal tarmkanalen såsom perforant väg eller Schaffer säkerheter. Lägre inspelning elektrodpå plats medan övervakning utgående spår att elektroderna är på samma z-nivå (djup). När ett maximalt svar uppnås, håller stimulering strömnivå konstant, elektroder ligger på samma Z-nivå.
- Den resulterande kurvan består av tre delar: det presynaptiska fibrer volley, fältet extracellulära postsynaptiska potentialen (fEPSP) och postsynaptiska befolkningen spik. Komponenterna kan överlappa tillfälligt i vissa preparat, vilket gör analysen svårare. Om det finns tvetydighet mellan huruvida svaren är presynaptiska eller postsynaptiska kan APV och CNQX tillsättas till badet för att blockera excitatorisk överföring, och alla återstående signalerna kommer att vara av presynaptiska ursprung.
- Stimuleringsprotokoll varierar för att producera tre olika experiment typer: input / output kurvor, parade inspelningar puls och långtidsförsök plasticitet.
Analys består typiskt av mätningar som jämför lutning fEPSP över i både hjärnan skadade möss och simulerad-Drivs som omfattar kontroll av den ingående styrka genom att mäta fiber volley.
5. Visualiseras patch-clamp inspelning
- Förbered skivor, elektroderna och rigg för att spela in såsom tidigare beskrivits ovan upp till steg 4,2.
- Endast överväga celler djupare än 80 um i vävnaden som celler närmare ytan kommer att vara död och / eller har nedsatt anslutning. Närma sig en cell med positivt tryck på elektroden för att säkerställa att det inte blir igensatta när den rör sig nedåt genom vävnaden. När elektroden vidrör cellen tillämpa undertryck i syfte att skapa en "gigatätning" mellan elektroden och plasmamembranet.
- Applicera korta skurar av negativt tryck för att bryta Plama membranet under elektroden och uppnå hel-cellkonfiguration.
- Eliminera kapacitans transienter med förstärkare och kompensera för serieresistans. Kompensera för serieresistans hos cellen är viktigt att säkerställa enccurate mätningar.
- Två typer av encelliga inspelningar kan utföras: strömtång (mätning membran spänning) och spänning klämma (mätströmmen passerar genom jonkanaler i membranet).
Möjliga typer av analys är många, men i vårt fall främst består av biofysikalisk analys kvantifiera hastigheten och storleken av spontana synaptiska strömmar i både hjärnan skadade möss och skenopererade kontroller.
6. Spänning känsligt färgämne Imaging (VSD)
- Förbered skivor och rigg för att spela som tidigare beskrivits ovan upp till steg 4,2.
- Förbered färgämne lager genom att blanda 1 mg di-3-ANEPPDHQ i 50 ul etanol, fördela 2 il alikvoter i folie förpackade rör, förvara vid -20 ° C. Gör arbeta färglösningen dagligen genom utspädning 1:200 i ACSF.
- Inkubera skiva på aCSF fuktat filterpapper och fläckar med 90 pl färgämne för 16 minuter, skölj med aCSF och plats i gränssnittet inspelning kammare.
- Justera ljus stimulatioN intensitet tills svar centrerad i mitten av kamerans räckvidd. Bilder vanligtvis förvärvas med en hastighet av 500-1000 bilder per sekund.
- Trigger slutare för ljus stimulering 200 msek före elektrisk stimulering för att initialt snabb fotoblekning att stabiliseras. Alternativa förvärv försök mellan elektriskt stimulerad, och icke-elektriskt stimuleras för att tillåta senare subtraktion av icke-stimulerade bakgrund. Rekord vila ljusintensitet (fluorescens läsning med slutaren stängd) innan du öppnar luckan. Varje VSD studie kommer att vara ett x bildpunkter gånger y bildpunkter med tiden "film" av fluorescens avläsningar. Rekord från 10 till 12 VSD försök i varje test skick.
- Alla mätningar utförs på inom pixlar före el-stimulans normaliserad fluorescens förändring följer dF / F, som beräknas enligt följande:
Subtrahera den vilande ljusintensiteten från VSD fått rå rättegång. För varje bildpunkt i varje försök, normalisera enligt före-elektriska-stimulans medelvärdet för deträttegång, och subtrahera enhet. Gör detta för båda de stimulerade elektriskt stimulerade och icke-elektriskt prövningar. Skapa en genomsnittlig "bakgrundsfluorescens" rättegång från de stimulerade icke-elektriskt prövningar och subtrahera denna bakgrund studie från de elektriskt stimulerade försök. Ytterligare analys utförs typiskt på genomsnittet av 10 till 12 sådana försök, som också vanligtvis filtreras i tid och rum för att förbättra signal-brusförhållandet.
7. Regionala Dissektioner för biokemiska analyser
- Avlägsna hjärna från mus som tidigare beskrivits.
- Förbered skivor med vävnad chopper.
- Lägg avsnitt platt, microdissect område CA1 och GD.
- Omedelbart doppas i lysbuffert innehållande proteashämmare. Frysa i flytande kväve och förvara vid -80 ° C.
8. Representativa resultat
Våra experiment börjar vanligtvis med beteendedata att bekräfta förväntared kognitiva brister som finns i hjärnan skadade möss. Vi använder kontextuella betingade testning rädsla svar eftersom det är en hippocampus beroende beteende som är tillförlitlig och kräver endast en träningspass och en test session. De data som visas i figur 2 representerar beteendemässiga tester för att mäta anterograd minne, men kan testet också kunna användas för att mäta retrograd minnet om träningspasset utförs innan skadan.
Field excitatoriska postsynaptiska potentialer (fEPSPs) mäts för att bestämma netto synaptiska effekten av en stor population av celler (Figur 3A). Vi använder ofta tre olika typer av stimulering mönster, var ger sina egna resultat och slutsatser. Först, genom att öka stimuleringen intensitet genom en serie steg, skapar vi en in / ut-kurvan (Figur 3B / C).
Därefter genom att leverera två stimuleringar av samma intensitet separatad med en kort fördröjning (vanligtvis 50 ms) undersöker vi möjliga förändringar i synaptisk vesikel Release sannolikhet,. Dessutom har vi ofta utföra långsiktig potentiering (LTP) experiment. Efter upprättande av en baslinje respons, korta högfrekvent stimulering (vanligtvis 100 Hz) vid samma intensitet levereras, orsakar en intracellulär kaskad som leder till en potentierade synaptisk respons när normal stimulering återupptas.
Elektrisk aktivitet från helcells-patch-fastklämd celler kan spelas in i två lägen. I spänningsklämma läget styr försöksledaren membran spänningen av plåstret-fastklämda cellen i förhållande till badet via mjukvara associerad med förstärkaren. I det här fallet strömmar förmedlar postsynaptiska händelser registreras och ger information om presynaptiska Release frekvens, antal postsynaptiska aktiverade receptorer och blåsorna signalsubstansen koncentration (Figur 4A). I strömtång läge försöksledarenmanipulerar inducerad ström och mäter spänningen svaret. Detta kan vara användbart för att bestämma egenskaper hos aktionspotentialen, såsom aktionspotential tröskel och halv bredd. Dessa egenskaper gör det möjligt att funktionella kategorisering av nervceller som excitatoriska eller inhibitoriska baserat på deras insatser potentiella bränning mönster (Figur 4B). För att kontrollera den cellulära identitet rekommenderar vi att fylla celler med Lucifer Yellow efter inspelning och visuellt bekräfta identiteten genom närvaron eller frånvaron av Dendritutskotten. (Figur 4C, D).
Ett exempel på resultat från ett experiment med användning av spänningskänsliga färgämne att mäta förändringar i membranets spänning visas i figur 5. I det här fallet har en stimulerande elektrod placerats i Schaffer säkerheter vägen och den resulterande neuronal aktivitet i området CA1 analyseras. Spänning känsligt färgämne rapporterar inte absoluta värden för membran spänning, utan than ändra på spänning från en ursprungliga tillståndet utan stimulering. Däremot kan analyser jämförs två förhållanden (t.ex. hjärnan skadade vs skenopererade) användas för att bestämma de Spatiotemporal parametrarna för fysiologiska förändringar som inte kan mätas med fEPSPs eller helcells-patch-clamp inspelning.
Figur 1. Hippocampus kopplingsschema. En horisontell sektion genom hippocampus. De stora vägarna genom hippocampus visas i gult. Axonerna från neuroner i entorhinal cortex projektet via perforant väg in i gyrus dentatus bildar synapser med dendriter av dentate celler gyrus granul. Granulat cell axoner projekt via den mossiga fiber vägen till CA3 där de bildar synapser med dendriter av CA3 nervceller. De axoner av CA3 nervceller projekt via Schaffer säkerheter vägen på dendrites av CA1 pyramidala celler. Axonerna av CA1 pyramidala celler skjuter ut från hippocampus genom subiculum. Obs: Även avbildas är CA3 pyramidala celler axon släktingar utskjutande till den kontralaterala hippocampus via fimbria. (CA1: Cornu Ammonis 1, CA2: Cornu Ammonis 2, CA3: Cornu Ammonis 3, GD: dentate gyrus, visar streckad linje lager cellkroppen, heldragen linje indikerar strukturella gränser.)
Figur 2. Representativa beteendedata A:. Beteendedata skildrar skillnaden i frysning priser mellan hjärnan skadade möss (FPI) och skenopererade kontroller (sken) i konditionerat rädsla svar paradigm. Utbildningen skedde den 6: e dagen efter skada, med testperioden inträffar 24 timmar senare. (** Betecknar p <.01.)
Figur 3. Representativa Extracellulära Inspelning Data A:. Ett exempel på ett fält excitatorisk postsynaptisk potential (fEPSP) inspelning i området CA1. Den första nedåtriktade avböjningen är den stimulans artefakt, följt av presynaptiska fibern volley och slutligen fEPSP. B: Ingång / utgång kurvor visar en minskning netto synaptisk effekt i CA1 efter vätska slagverk skada (FPI). C: Input / Output kurvor som visar en ökning i netto synaptisk effekt i dentate gyrus (GD) efter FPI. (* Betecknar p <0,05). Klicka här för att se större bild .
Figur 4. Representativa Hela-cell patch-clamp Data A:. Ett exempel spontanexcitatorisk postsynaptisk ström (sEPSC) från en CA1 pyramidal cell. B: Exempel på åtgärder potentiella tåg från en CA1 pyramidal cell (övre kurvan) och en snabb spikning CA1 interneuron (lägre spår). C: Exempel på en Lucifer Yellow fyllde CA1 hämmande interneuron. Notera frånvaron av Dendritutskotten (övre panelen). D: Exempel på Lucifer Yellow fyllde CA1 pyramidal neuron. Notera förekomsten av Dendritutskotten (övre panelen). Klicka här för att se större bild .
Figur 5. Representativa spänningskänsliga Dye bilddata A:. Mus koronalt hippocampus skiva visas för att visa anatomin. (GD: dentate gyrus, CA1: Cornu Ammonis 1) B: gul till röd pixel representerar excitatorisk aktivitet i området CA1 14 ms efter afferent Schaffer säkerheter stimulering. Röd idicates mer depolarisation medan gult tyder på en lägre, men ändå betydande depolarisation. C: Blå pixlar som representerar områden av hämmande aktivitet i området CA1 56 ms efter samma afferenta Schaffer säkerheter stimulering som visas i B. mörkare blå visar mer hyperpolarisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Varje teknik beskrivs ovan bidrar till större förståelse av den underliggande mekanismen som orsakar den observerade beteendemässiga underskottet. Genom att kombinera den unika information som erhålls från varje metod kan vi undersöka de biologiska mekanismer med mer precision.
Mätning fEPSPs är användbart för att kvantifiera netto synaptiska effekten av stora, geografiskt definierade områden av nervceller. Det kan också ge information om potentialen hos en grupp av celler att genomgå synaptisk plasticitet, en neural korrelation av inlärning och minne. Det är en bra första punkt elektrofysiologiska analys som det är tekniskt enkelt och ger information om bredare mått på kretsens funktion.
I motsats till fEPSPs ger helcells-patch-clamp inspelning detaljerad information om elektrofysiologiska parametrarna i en enda cell. Det är en mycket varierad teknik som många olika parametrar och types av synaptiska ingångar kan mätas beroende på inspelningsförhållandena (farmakologiska medel i pipetten eller bad, hålla spänning, inspelningsläge, etc.). Till exempel, kan hel-cell patch-clamp inspelning användas för att skilja de relativa bidragen från excitatoriska och inhiberande synaptisk överföring till en observerade skillnad i netto synaptiska effekten som beskrivs av fEPSPs.
Spänning känsligt färgämne imaging experiment förstärka kunskap som de mer traditionella elektrofysiologiska tekniker som beskrivs ovan genom att tillhandahålla information om de Spatiotemporal dynamiken i kretsarna förändringar. Den Spatiotemporal profil eventuella ändringar kan användas för att generera hypoteser om de potentiella celltyper som kan vara inblandade i kretsen dysfunktion, som sedan kan analyseras genom mer riktade strategier, som helcells-patch-fastspänning.
I vårt fall har vi och andra visat tidigare subregipå specifika förändringar i netto synaptisk effekt 7-9, vilket ledde till att karakterisera oförmåga att generera LTP i CA1 efter TBI 10. Ytterligare studier använde en blandning av molekylärbiologiska tekniker och elektrofysiologi att utreda mekanismen bakom den observerade obalansen i excitatoriska / hämmande synaptisk transmission 11. Det är viktigt att dessa studier användes beteende inte bara att visa en kognitiv nedsättning efter TBI, men också att validera effektiviteten av en diet behandlingsstrategi som härrör från de resultat som erhållits från att använda vår kombinatoriska tillvägagångssätt.
Ingenting om detta mångfacetterade systemet begränsar dess tillämpning på området TBI eller sin region av intresse för hippocampus. Faktum är att kombinera denna uppsättning av verktyg kan leda till biomechanistic beskrivningar av observerade skillnader i beteende i ett antal neurologiska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Elliot Bourgeois för hans tekniskt bistånd. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag R01HD059288 och R01NS069629.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | AXOPATCH 200B | Patch-clamp rig |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | Patch-clamp rig | |
| MP-225 micromanipulator | Sutter | MP-225 | Patch-clamp rig |
| DMLFSA microscope | Leica | Patch-clamp rig | |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Multipurpose (field) rig |
| Digidata 1440 digitizer | Molecular Devices | Multipurpos (field) rig | |
| MPC-200 micromanipulator | Sutter | MPC-200 | Multipurpose (field) rig |
| BX51WI microscope | Olympus | BX51WI | Multipurpose (field) rig |
| Axoclamp 900A amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 900A | VSD rig |
| Digidata 1322 digitizer | Molecular Devices | VSD rig | |
| Redshirt CCD-SMQ camera | Redshirt | NCS01 | VSD rig |
| VT 1200S Vibratome | Leica | 14048142066 | |
| P-30 Electrode puller | Sutter | P-30/P | |
| cOmplete protease inhibitor | Roche | 11697498001 |
References
- Faul, M., Xu, L., Wald, M. M., Coronado, V. G. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits Hospitalizations and Deaths 2002-2006. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , (2010).
- McAllister, T. W. Neuropsychiatric sequelae of head injuries. Psychiatr. Clin. North Am. 15, 395-413 (1992).
- Pierce, J. E., Smith, D. H., Trojanowski, J. Q., McIntosh, T. K. Enduring cognitive, neurobehavioral and histopathological changes persist for up to one year following severe experimental brain injury in rats. NSC. 87, 359-369 (1998).
- Dixon, C. E., et al. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. J. Neurosurg. 67, 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
- Carbonell, W. S., Grady, M. S. Regional and temporal characterization of neuronal, glial, and axonal response after traumatic brain injury in the mouse. Acta Neuropathol. 98, 396-406 (1999).
- Toth, Z., Hollrigel, G. S., Gorcs, T., Soltesz, I. Instantaneous perturbation of dentate interneuronal networks by a pressure wave-transient delivered to the neocortex. J. Neurosci. 17, 8106-8117 (1997).
- D'Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R., Janigro, D. Selective loss of hippocampal long-term potentiation, but not depression, following fluid percussion injury. Brain Res. 786, 64-79 (1998).
- Witgen, B. M. Regional hippocampal alteration associated with cognitive deficit following experimental brain injury: A systems, network and cellular evaluation. Neuroscience. 133, 1-15 (2005).
- Schwarzbach, E., Bonislawski, D. P., Xiong, G., Cohen, A. S. Mechanisms underlying the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury. Hippocampus. 16, 541-550 (2006).
- Cole, J. T. Dietary branched chain amino acids ameliorate injury-induced cognitive impairment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 366-371 (2010).
