Summary
Mikroskopiske organismer som den fritsvømmende nematode
Abstract
Jordbunden og vandområder, mikroskopiske organismer lever og opfører sig i en kompleks tre-dimensionelle miljø. De fleste undersøgelser af mikroskopisk organisme adfærd, derimod, er blevet udført med mikroskop tilgange, som begrænser bevægelse og adfærd til en smal, næsten todimensional fokal felt. 1 Vi præsenterer en ny analytisk tilgang, der giver real-time analyse af frit svømning C. elegans i en kuvette uden afhængighed af mikroskop-baseret udstyr. Denne fremgangsmåde består i at spore den tidsmæssige periodicitet diffraktionsmønstre genereret ved at lede laserlys gennem kuvetten. Vi måler oscillationsfrekvenser for frit svømning nematoder.
Analyse af de fjernfelts diffraktionsmønstre afslører fingerpeg om bølgeformerne af nematoder. Diffraktion er processen med lys bøjning omkring en genstand. I dette tilfælde lys er diffrakteres af organismerne. De lysbølger blande sig og kan danne annonceiffraction mønster. En langt-feltet, eller Fraunhofer, diffraktionsmønster dannes, hvis skærm-til-objekt afstanden er meget større end den diffrakterende objekt. I dette tilfælde kan diffraktionsmønstret beregnes (modellerede) under anvendelse af en Fourier transformation. 2
C. elegans er fritlevende jordboende nematoder, der navigerer i tre dimensioner. De bevæger sig begge på en fast matrix som jord eller agar i en sinusformet motorisk mønster kaldet kravle og i væske i et andet mønster kaldet svømning. 3 Rollerne spilles af sensoriske oplysninger fra mechanosensory, chemosensory, og thermosensory celler, der regulerer plastik ændringer i bevægelsesadfærd mønstre og afbrydere i mønstre er kun lige begyndt at blive belyst. 4 Vi beskriver en optisk metode til måling af nematode bevægelse i tre dimensioner, som ikke kræver et mikroskop, og vil gøre os i stand til at begynde at udforske de komplekse nematode bevægelse under forskellige cold.
Protocol
1. C. elegans Forberedelse til Video Analyse
- Flyt 10-20 drægtige voksne nematoder til friske NGM agar-fyldte petriskåle ved hjælp af en tynd, flad platintråd pick. De Petriskåle fyldt med NGM agar indeholder en lille rund plet af E. coli (en vækst begrænset stamme, OP50, giver de bedste resultater) for nematoder at spise. Lad nematoderne at lægge æg i 3-5 timer og derefter fjerne de voksne, således at der skabes en lille, udviklingsmæssigt synkroniseret kultur af 50-150 nematoder. Tillad nematoderne at stige til tidlige voksenalder ved inkubation af petriskåle ved 20 ° C i 4-5 dage. Disse dyrkningsmetoder er baseret på kendte procedurer (Stiernagle 2006). 5
- På dagen af video-analyse, skylle en plade af unge voksne nematoder med 1 ml deioniseret, destilleret vand, således at indsamle 50-150 orme fra den synkroniserede kultur. En pufferopløsning såsom M9 eller PBS kan også anvendes. Brug en mikrocentrifuge til at dreje worms til bunden af røret, eller at kunne etablere sig ved hjælp af tyngdekraften i ca 15 min. Fjerne hovedparten af vandet fra røret og erstatte det med 1 ml deioniseret, destilleret vand for at vaske eventuelle klæbende bakterier fra nematoder.
- Overfør nematoder i vand eller puffer til en kvartskuvette under anvendelse af en mikropipette. Det er vigtigt at arbejde med et lille antal, omkring 5-10 nematoder i alt på én gang eller endnu færre således at en nematode ad gangen kan forventes at blive belyst af laseren. Hvis antallet af nematoder på dyrkningspladerne er for stor, fortynde orme i vand eller puffer, indtil en ønsket densitet er nået. Det er også muligt at plukke individuelle nematoder til en dråbe vand eller puffer på en frisk agarplade at vaske dem og overføre individuelle orme til kuvetten. I vores undersøgelse har vi brugt 1 mm, 2 mm og 5 mm kuvette størrelser for at undersøge virkningerne af fysiske begrænsninger på svømning adfærd.
2. Optisk installationsprogrammet til Video analysis
- Udfør setup som vist i figur 1 ved hjælp af en 543 nm (grøn) Helium-neon (HeNe) laser, to front-overflade aluminium spejle, en Kuvetteholderen, et lærred, og en high-speed kamera (Casio High Speed Exilim), som kan at filme på ~ 240 fps. De to spejle anvendes til at styre laserstrålen gennem kuvetten. Forskellige størrelser af kuvetter kan anvendes afhængigt af undersøgelsen. Som et eksempel har vi anvendt kuvetter, der er 5 mm tyk til at vise virkningerne af rumlige begrænsninger på svømning frekvenser. Laserstrålen skal opfylde kravene til oversampling. Dvs bør organismen hindrer ikke mere end en tredjedel af laserstrålen. For C. elegans, skal laserstrålen være omkring 2 mm i diameter når det vekselvirker med en nematode. Laserstrålen må ikke være større end 5 mm i diameter, eftersom diffraktionsmønstret vil være vanskeligt at lokalisere. Afstanden fra diffrakterende organisme til skærmen skal være meget større endorganismen selv.
- Sted parafilm over toppen af kuvetten og bland det at blande nematoderne i vandsøjlen. Anbring kuvetten i en kuvette holder, så orme er indledningsvis nær toppen af cuvetten. Ved hjælp af spejle, laserstrålen styre gennem midten af cuvetten. Fordi nematoder er tungere end vand, vil de langsomt falder til bunden af kuvetten, mens den på samme tid svømme i vandsøjlen.
- På projektionsskærmen, farve stedet svarer til den transmitterede laserstråle sort for at reducere spredning, som den transmitterede stråle møder projektionsskærmen (figur 2). Alternativt sættes en åbning i projektionsskærmen for at tillade den transmitterede stråle at passere gennem sigten. Eliminere eller reducere spredning fra den transmitterede stråle holder CCD-array af kameraet fra mætte grund af den transmitterede stråle.
- For at fange et mål for størrelsen af afbøjningsmønsteret, tegne en linie afomkring 5 cm på projektionsskærmen siden af den transmitterede laserstrålepletten uden at forstyrre det diffrakterede lys billedet.
- Start optagelsen med kameraet mens Værelset lys er tændt, så 5 cm linje er på samme optagelser som diffraktion billeder. Sluk for rumbelysning slukket. Optag diffraktion billeder på skærmen med kameraet som orme passerer gennem laserstrålen.
3. Video forberedelse af data
- Installer video-analyse-program (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) på computeren. Importer videoen til videoanalyse program
- Indstil oprindelsen til at falde sammen med det transmitterede laserpunktet. Indstille skalaen med 5 cm linje på projektionsskærmen.
- Spore den vinkelmæssige forskydning af diffraktion billede dannet af hver nematode hjælp af video-analyse-softwaren (Figur 3)
- For at finde den Angular forskydning ved at tage arctan (y / x), kopiere og indsætte data i et regneark (Excel), og der tilsættes 180 deg eller π for alle negative vinkler til at producere en kontinuerlig kurve (figur 4).
4. Real Time Data Acquisition for Instant Observation af Swimming Frekvenser
- Brug samme opsætning som for video-analyse, placere en fotodiode (DET10A fra Thorlabs) med et lille område (~ 1 mm 2) off-center i diffraktionsmønstret lige foran projektionsskærmen.
- Slut fotodiode til den digitale oscilloskop (PicoScope lavet af Pico Technology), der forbinder til computeren via USB-porten. Overhold prygle mønstre på computerskærmen.
- Gem erhvervede datasæt i ASCII eller tekst-format.
5. Dataanalyse
- Importere dataene erhvervet ved hjælp af video eller fotodioden til en dataanalyse program er i stand til montering kurveformer ved hjælp af chi-square minimering. Programmet bruges her er Origin ( http://www.originlab.com/ ). Montere en sinusformet kurve til at bestemme Prygl frekvens (figur 4 og 5).
- Gennemsnitlige svømning frekvenser fra forskellige prøver og bestemme variansen. Til denne undersøgelse blev data analyseret statistisk under anvendelse af en enkelt-faktor ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligninger test. En p-værdi på <0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
6. Model diffraktionsmønstrene bruger Mathematica som et eksempel
Bemærk: diffraktionsmønstre kan modelleres ved hjælp af mange forskellige beregningsværktøjer. Denne procedure vil variere for forskellige beregningsværktøjer som MatLab, Excel, oprindelse osv.
- Opret Billede: Tag billeder af nematoder på et objektglas ved hjælp af en traditionel mikroskop.
- Binarize billede: Importer ormen billedet 'Worm' into Mathematica ved at trække billedet ind i Mathematica. Konverter billedet til et sort-hvidt billede (binarize). Dette kan opnås med 'Binarize' kommandoen i Mathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [Worm]. Billedet kan betragtes som en sort-hvidt billede.
Alternativt kan du bruge 'EdgeDetect' kommandoen til at oprette en BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], hvor de to bageste tal styrer grovheden af de resulterende kanter. - Konverter billedet til en matrix af nuller og ettaller: Dette kan opnås med 'ImageData' kommandoen i Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage].
- Fouriertransformation matrix: Brug »Fourier 'kommandoen i Mathematica til Fouriertransformation matricen ved hjælp af de angivne FourierParameters: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
- Square modulus af matrix for at opnå diffraktion matrix og forbedre kontrasten i billedet: Square den absolutteVærdien af matrixen og se det resulterende billede, som er diffraktionsmønster, der svarer til det oprindelige billede. Også bruge 'log' funktionen til at skalere billedets kontrast: ImageContrast = Image [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
- Resize billede for nem visning: Beskær det centrale diffraktionsmønster og ændre størrelse som ønsket: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
- Sammenligne de modellerede diffraktionsmønstre med diffraktionsmønstre opnået fra frit svømmende orme. (Fig. 6)
Representative Results
Som et eksempel undersøgte vi C. elegans i en kvartskuvette 1 cm brede, 5 mm tykke og 4 cm høj kuvette. Prøveudtagning en enkelt snekke med video-analyse, den gennemsnitlige svømning frekvensen opnået fra video-analyse i en 5 mm tyk kuvette er omkring 2,5 Hz (figur 4). Tilsvarende prøveudtagning en enkelt snekke med realtid datafangst fremgangsmåde, fås en swimming frekvens på omkring 2,7 Hz (fig. 5) ved anvendelse af digitalt oscilloskop (PicoScope). Denne procedure kan gentages for mange orme. En detaljeret undersøgelse af frit svømning orme afslørede en gennemsnitlig svømning frekvens på 2,37 Hz i et 5 mm kuvette. 6 Som forventet svømning frekvensen er højere end for en kravlende orm (~ 0,8 Hz). 3 Brug denne diffraktion metode, gennemsnitlige svømning frekvenser af et C. elegans, som er begrænset til et mikroskopobjektglas, har vist sig at matche den tidligere publicerede værdi på 2 Hz. 1,7
ve_content "> Efter procedurer 3). og dernæst 6.) giver mulighed for modellering af svømning diffraktionsmønstre ved hjælp af orm billeder opnået med en konventionel mikroskop. det modellerede diffraktionsmønstre bruges til at simulere en svømmetur cyklus af C. elegans ( Figur 6). En vellykket model består af fysisk mulige successive svømme mønstre matcher de svømning frekvenser. Ormen bør være i den samme form ved afslutningen af et svømme-cyklus, som det var i begyndelsen af en svømmetur cyklus.
Figur 1. En grøn HeNe laser blev brugt til at skabe en dynamisk diffraktionsmønster brug af live C. elegans. Dette diffraktionsmønster blev filmet på 240 fps.
Figur 2. Dra wing en sort prik forøger absorptionen af den udsendte stråle. Mætning af kameraet på grund af spredt lys reduceres, og diffraktionsmønstret bliver synlig.
Figur 3. Screen shot af video-analyse software (Logger Pro) med en orm diffraktionsmønster, der kan spores. Klik her for at se større figur .
Fig. 4. Video data svarende til svømme cyklus af en nematode i en 5 mm kuvette. Kurvetilpasningen afslører en swimming frekvens på ~ 2,5 Hz.
"/>
Figur 5. Real time data svarende til svømme cyklus af en nematode i en 5 mm kuvette. Kurvetilpasningen afslører en swimming frekvens på ~ 2,7 Hz.
Fig. 6. Den øverste række repræsenterer de faktiske diffraktionsmønstre og er tilpasset til de modellerede diffraktionsmønstre i den nederste række. De modellerede diffraktionsmønstre blev fremstillet under anvendelse orme på et objektglas (midterste række).
Discussion
Vi har udviklet en ny metode til real-time måling af bevægelse og enkle bevægelsesmæssigt adfærd i mikroskopiske organismer som nematoder, der ikke kræver anvendelse af mikroskoper. 8 Denne metodiske fremgangsmåde kan også anvendes til at studere en lang række mikroskopiske organismer som protister. Denne fremgangsmåde er kun begrænset af bølgelængden af anvendte lys. Organismen bør ikke være mindre end bølgelængden af lyset. Ud over den omkostningsbesparelser og overføre det nødvendige udstyr, er en vigtig fordel ved denne fremgangsmåde mulighed for at måle adfærd i realtid og i tre dimensioner, uden at de smalle begrænsninger af billedplaner under et mikroskop. Det er også muligt med denne teknik til at undersøge påvirkninger af tyngdekraften eller talrige andre betingelser for adfærd, der ikke kan studeres ved hjælp af mikroskop tilgange. 9 Således kan vi opnå en bedre forståelse af mikroorganisme naturlige bevægelsesmæssigt Behaviors befriet for rammerne af objektglas dråber eller specialiserede mikrofluidenheder kamre (Park et al, 2008). 10
Manglen på faseinformation i et diffraktionsmønster ikke tillader direkte udtagning af billedet der svarer til den diffrakterende objektet siden fjernfelts diffraktionsmønster er proportional med kvadratet på den absolutte værdi af Fouriertransformationen. Vi har derfor beregning diffraktionsmønstre fra orm billeder, således at de kan blive matchet med diffraktionsmønstrene af frit svømmende nematoder (figur 6).
Denne metode har givet resultater for virkelig frit svømning C. elegans og kan anvendes på enhver mikroskopiske arter, manøvrer i en optisk transparent miljø som vand eller mange forskellige ioniske opløsninger. Konventionelle mikroskoper tillader kun undersøgelser med en fokal dybde af størrelsesordenen mikrometer. 11 Dette skyldes den begrænsededybdeskarphed, når der fokuseres lys:
hvor f-N har en gensidig forhold til strølyscirkel (c) således at en kort brændvidde er forbundet med et stort c. 12,13 Mens denne diffraktion metode er bestemt ikke en erstatning for konventionel mikroskopi, det er i stand at levere kvantitative resultater hurtigt, så arter også kan manipuleres i realtid til en lav pris. Diffraktionsmønstrene kan opnås med enhver laser pointer. Diffraktionsmønstrene kan optages ved en reduceret tidsmæssig opløsning under anvendelse af en almindelig digitalkamera. Mens brugeren ikke kan have et mikroskop eller fotodiode let tilgængelige, kan centrale dele af dette forsøg, såsom måling Prygl frekvenser og evaluering af diffraktionsmønstrene være afsluttet ved ekstremt lave omkostninger.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello og Karl Spühler for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (ursi), Lucy Maynard Salmon Research Fund og NASA prisen # NX09AU90A, National Science Foundation Center for Forskning Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) tildeling # 0.630.388 og NSF Prisen # 1.058.385.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 543 nm HeNe Laser | Melles Griot | LGX1 | Any laser in the visible range with less than 5 mW can be used. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| High Speed Exilim Camera | Casio | ||
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
| LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
| Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ |
References
- Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J. Exp. Biol. 210, (2007).
- James, J. F. A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , Cambridge Univ. Press. (1995).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).
- Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue. Nature. 440, 684-687 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, W. ormB. ook, , (2006).
- Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction. O. J. Biphys. , (2012).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).
- Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).
- Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment. PLOS One. 3, e2550 (2008).
- Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).
- Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
- Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).
