Kvantitativ Locomotion Study of frittsvømmende Micro-organismer ved hjelp av laser diffraksjon

Summary

Mikroskopiske organismer som frittsvømmende nematode

Abstract

Jord og vann mikroskopiske organismer lever og oppfører seg i en kompleks tredimensjonalt miljø. De fleste studier av mikroskopiske organismer atferd, i motsetning, har vært utført med mikroskop tilnærminger, som begrenser bevegelse og atferd til en smal, nesten to-dimensjonale brennvidde feltet. ^En Vi presenterer en ny analytisk tilnærming som gir real-time analyse av frittsvømmende C. elegans i en kyvette uten avhengighet av mikroskop-basert utstyr. Denne tilnærmingen består av å spore timelige periodisitet av diffraksjon mønstre genereres ved å rette laserlys gjennom kyvetten. Vi måler svingning frekvenser for frittsvømmende nematoder.

Analyse av langt-feltet diffraksjon mønstre avslører ledetråder om bølgeformer av nematoder. Diffraksjon er prosessen av lys bøying rundt et objekt. I dette tilfellet lys er diffracted av organismene. Lysbølgene forstyrre og kan danne annonseiffraction mønster. En langt-feltet, eller Fraunhofer, diffraksjon mønster dannes hvis skjermen til objekt avstanden er mye større enn diffracting objektet. I dette tilfellet kan diffraksjonsmønster beregnes (modellert) ved hjelp av en Fourier-transform. ²

C. elegans er frittlevende jord-bolig nematoder som navigerer i tre dimensjoner. De beveger seg både på en fast matriks som jord eller agar i en sinusformet motorisk mønster som kalles krypende og i flytende i et annet mønster kalt svømming. ³ Rollene spilles av sensorisk informasjon fra mechanosensory, chemosensory, og thermosensory celler som styrer plast endringer i motorisk mønstre og brytere i mønstre er bare begynnelsen for å bli belyst. ⁴ Vi beskriver en optisk tilnærming til måling nematode locomotion i tre dimensjoner som ikke krever et mikroskop, og vil gjøre oss i stand til å begynne å utforske kompleksiteten i nematode locomotion under forskjellige conditions.

Protocol

1. C. elegans Forberedelse til Video Analysis

1. Flytt 10-20 gravid voksen nematoder til ferske NGM agar-fylt Petri plater ved hjelp av en tynn, flat platinatråd hakke. De petriskåler fylt med NGM agar inneholder en liten sirkulær flekk av E. coli (en vekst begrenset belastning, OP50, gir de beste resultatene) for nematoder å spise. Tillat nematoder for å legge egg for 3-5 timer og deretter fjerne de voksne, og dermed etablere en liten, utviklingshemmede-synkronisert kultur av 50-150 nematoder. Tillat nematoder å vokse til tidlig voksen ved inkubering Petri platene ved 20 ° C i 4-5 dager. Disse kultur metoder er basert på etablerte prosedyrer (Stiernagle 2006). ⁵
2. På dagen for den videoanalyse, spyle en plate av unge voksne nematoder med 1 ml avionisert, destillert vann, og således samle 50-150 ormer fra synkroniserte kulturen. En bufferløsning som M9 eller PBS kan også brukes. Bruk en mikrosentrifuge å snurre wOrms til bunnen av røret, eller tillate dem å løse ved tyngdekraften i ca 15 minutter. Fjerne mesteparten av vannet fra røret og erstatte den med en ml avionisert, destillert vann for å vaske eventuelle fulgte bakterier fra nematoder.
3. Overfør nematoder i vann eller buffer til en kvarts kyvette med en mikropipette. Er det viktig å arbeide med et lite antall, ca 5-10 nematoder totalt på en gang eller enda færre, slik at en nematode gangen er sannsynlig å bli opplyst av laseren. Hvis antallet av nematoder på kultur platene er for stor, fortynne ormer i vann eller buffer inntil en ønsket tetthet er nådd. Det er også mulig å plukke individuelle nematoder til en dråpe vann eller buffer på en fersk agarskål å vaske dem og overføre individuelle ormer til kyvetten. I vår studie har vi brukt 1 mm, 2 mm og 5 mm kyvette størrelser for å undersøke effekten av fysiske begrensninger på svømming atferd.

2. Optisk oppsett for Video analysis

1. Utfør oppsett som vist i Figur 1 ved hjelp av en 543 nm (grønn) Helium-Neon (HeNe) laser, to front-overflate aluminium speil, en kyvetteholderen, en projeksjon skjerm og en høyhastighets kamera (Casio High Speed ​​Exilim) i stand av filming på ~ 240 fps. De to speil er brukt til å styre laserstrålen gjennom kyvetten. Forskjellige størrelser av kyvetter kan brukes avhengig av innholdet av studien. Som et eksempel har vi brukt kyvetter som er 5 mm tykk for å vise effekten av romlige begrensninger på svømming frekvenser. Laserstrålen må oppfylle kravene for oversampling,. Dvs. bør organismen hinder ikke mer enn en tredjedel av laserstrålen. For C. elegans bør laserstrålen være ca 2 mm i diameter når den kommuniserer med en nematode. Laserstrålen bør ikke være større enn 5 mm i diameter ettersom diffraksjonsmønster vil være vanskelig å finne. Avstanden fra diffracting organisme til skjermen bør være mye større ennselve organismen.
2. Plass Parafilm over toppen av kyvetten og invertere det å blande nematoder i vannsøylen. Plasser kyvette i en kyvette holderen slik at ormer er utgangspunktet nær toppen av kyvetten. Bruke speilene, styre laserstrålen gjennom sentrum av kyvetten. Fordi nematoder er tyngre enn vann, vil de langsomt falle til bunnen av kyvetten, mens på samme tid bading innenfor vannsøylen.
3. På projeksjonsskjermen, farge spot tilsvarende overført laserstrålen svart for å redusere spredning som fjernkontrollstrålen oppfyller projeksjonsskjermen (figur 2). Alternativt sette en åpning i projeksjonsskjermen å tillate fjernkontrollstrålen å passere gjennom skjermen. Å eliminere eller redusere spredning fra Fjernkontrollstrålen vil holde CCD array av kameraet fra mette grunnet fjernkontrollstrålen.
4. Å fange et mål på størrelsen på diffraksjon mønster, tegne en linje avca 5 cm på lerretet ved siden overført laserstrålen sted uten å forstyrre diffracted lys bilde.
5. Start opptak med kameraet mens rommet lyser slik at 5 cm linjen er på samme opptakene som diffraksjon bilder. Slå på rommet lyset. Record diffraksjon bilder på skjermen med kameraet som ormer passerer gjennom laserstrålen.

3. Videodata Forberedelse

1. Installer videoanalyse program (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) på datamaskinen. Importere video til videoanalyse program
2. Still opprinnelsen å sammenfalle med den overførte laserpunktet. Still skalaen med 5 cm linje på lerretet.
3. Spor vinkelutslag av diffraksjon bilde dannet av hver nematode bruke videoanalysesoftware (figur 3)
4. Å finne angular forskyvning ved å ta arctan (y / x), kopiere og lime inn data i et regneark (Excel) og legge 180 grader eller π for alle negative vinkler for å produsere en sammenhengende graf (Figure. 4).

4. Real Time Data Acquisition for Instant Observasjon av Swimming Frekvenser

1. Med samme oppsett som for videoanalyse, plassere en fotodiode (DET10A fra ThorLabs) med et lite område (~ 1 mm ²⁾ utenfor senter i diffraksjonsmønsteret rett foran projeksjonsskjermen.
2. Koble photodiode til den digitale oscilloskop (PicoScope laget av Pico Technology) som kobles til datamaskinen via USB-porten. Observere sprellende mønstre på skjermen.
3. Lagre ervervet datasett i ASCII-eller tekstformat.

5. Dataanalyse

1. Importere data ervervet ved hjelp av video eller PHOTODIODE i en dataanalyse program som kan montering kurveformer ved hjelp av chi-kvadrat minimering. Programmet som brukes her er Origin ( http://www.originlab.com/ ). Monter en sinusformet kurve for å bestemme juling frekvens (figur 4 og 5).
2. Gjennomsnittlig svømming frekvenser fra ulike prøver og bestemme varians. For denne studien ble data analysert statistisk ved hjelp av en enkelt-faktor ANOVA etterfulgt av Bonferroni multippel sammenligninger test. En p-verdi på <0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

6. Modell Diffraksjonsmønster med Mathematica som et eksempel

Merk: Diffraksjonsmønster kan modelleres ved hjelp av mange forskjellige dataverktøy. Denne fremgangsmåten vil være forskjellig for ulike dataverktøy som MatLab, Excel, opprinnelse osv.

1. Opprett Bilde: ta bilder av nematoder på et objektglass med en tradisjonell mikroskop.
2. Binarize bilde: Importer ormen bilde 'Worm' into Mathematica ved å dra bildet i Mathematica. Konvertere bildet til en svart og hvitt bilde (binarize). Dette kan oppnås med "Binarize 'i Mathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [Worm]. Bildet kan da sees som en svart og hvitt bilde.
   Alternativt kan du bruke 'EdgeDetect' kommando for å opprette en BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], der de to etterfølgende tall kontrollere grovheten av de resulterende kanter.
3. Konverter bildet til en matrise av nuller og enere: Dette kan oppnås med "ImageData 'i Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. Fourier transform matrix: Bruk «Fourier 'i Mathematica til Fourier transform matrisen ved hjelp av angitte FourierParameters: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
5. Square modulus av matrise for å få diffraksjon matrise og forbedre kontrasten i bildet: Square den absolutteverdi av matriksen og vise den resulterende bildet, som er den diffraksjonsmønster tilsvarer det opprinnelige bildet. Du kan også bruke "Logg"-funksjonen for å skalere kontrasten i bildet: ImageContrast = Image [logg [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
6. Endre størrelsen på bildet for enkel visning: Crop den sentrale diffraksjon mønster og endre størrelsen som ønsket: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
7. Sammenligne modellerte diffraksjon mønstre med diffraksjon mønstre hentet fra frittsvømmende mark. (Figur 6)

Representative Results

Som et eksempel, studerte vi C. elegans i en kvarts kyvette 1 cm brede, 5 mm tykk og 4 cm høy kyvetten. Prøvetaking av en enkeltpakning orm ved hjelp av video-analyse, er den gjennomsnittlige svømming frekvensen oppnådd fra videoanalyse i en 5 mm tykk kyvette ca 2,5 Hz (figur 4). Tilsvarende, prøvetaking av en enkeltpakning orm med sanntids datainnsamling metoden, får vi en svømming frekvens på ca 2,7 Hz (Figur 5), ved hjelp av den digitale oscilloskop (PicoScope). Denne prosedyren kan gjentas for mange ormer. En detaljert studie av frittsvømmende ormer avslørte en gjennomsnittlig svømming frekvens på 2,37 Hz i en 5 mm kyvette. ⁶ Som ventet er svømming frekvens høyere enn for en krypende ormen (~ 0,8 Hz). ³ Ved hjelp av denne diffraksjon metoden, gjennomsnittlig svømming frekvenser en C. elegans, som er begrenset til et objektglass, har blitt funnet å matche den tidligere publiserte verdi av 2 Hz. ^1,7

ve_content "> følge fremgangsmåter 3.) og deretter 6.) tillater for modellering av svømming diffraksjon mønstre ved hjelp av snekke images oppnådd med en konvensjonell mikroskop. De modellerte diffraksjon mønstre benyttes for å simulere en svømmetur syklus av C. elegans ( Figur 6). En vellykket modell består av fysisk gjennomførbare påfølgende svømme mønstre som samsvarer med svømming frekvenser. Ormen bør være i samme form på slutten av en svømmetur syklus som det var i begynnelsen av en svømmetur syklus.

Figur 1. En grønn HeNe laser ble brukt til å skape en dynamisk diffraksjon mønster ved hjelp levende C. elegans. Dette diffraksjonsmønster ble filmet på 240 fps.

Figur 2. Dra ving en svart prikk øker absorpsjonen av den overførte stråle. Metning av kameraet på grunn spredt lys er redusert og diffraksjonsmønster blir synlig.

Figur 3. Skjermbilde av video analyse programvare (Logger Pro) med en orm diffraksjon mønster som spores. Klikk her for å se større figur .

Figur 4. Videodata tilsvarende bade syklus av en nematode i et 5 mm kyvette. Kurven passer avslører en svømming frekvens ~ 2,5 Hz.

"/>
Figur 5. Sanntidsdata tilsvarende bade syklus av en nematode i et 5 mm kyvette. Kurven passer avslører en svømming frekvens ~ 2,7 Hz.

Figur 6. Den øverste raden representerer de faktiske diffraksjon mønstre og passer til de modellerte diffraksjon mønstre i den nederste raden. De modellerte diffraksjon mønstre ble produsert ved hjelp ormer på et objektglass (midterste rad).

Discussion

Vi har utviklet en ny tilnærming til sanntid måling av bevegelse og enkle motorisk atferd i mikroskopiske organismer som nematoder som ikke krever bruk av mikroskop. ⁸ Denne metodiske tilnærmingen kan også benyttes for å studere en rekke mikroskopiske organismer som protister. Denne metoden er kun begrenset av bølgelengden til lyset som brukes. Organismen bør ikke være mindre enn bølgelengden til lyset. I tillegg til den reduserte kostnader og portabilitet av utstyret som trengs, er en viktig fordel med denne tilnærmingen evnen til å måle atferd i sanntid og i tre dimensjoner, uten de smale begrensninger av image flyene under et mikroskop. Det er også mulig med denne teknikken for å undersøke påvirkning av tyngdekraften eller en rekke andre forhold på atferd som ikke kan studeres ved hjelp av mikroskop tilnærminger. ⁹ Dermed kan vi oppnå en bedre forståelse av mikroorganisme naturlig motorisk Behaviors frigjort fra rammene objektglass dråper eller spesialiserte microfluidic kamre (Park et al, 2008). ¹⁰

Mangelen på faseinformasjon i diffraksjonsmønster ikke tillater direkte gjenfinning av bildet som svarer til objektet diffracting siden langt-feltet diffraksjonsmønster er proporsjonal med kvadratet av den absolutte verdien av Fourier transform. Vi er derfor beregne diffraksjon mønstre fra ormen bilder slik at de kan bli matchet med diffraksjon mønstre av frittsvømmende nematoder (figur 6).

Denne metoden har gitt resultater for virkelig frittsvømmende C. elegans og kan påføres eventuelle mikroskopiske arter som manøvrer i en optisk transparent miljø som vann eller mange forskjellige ioniske løsninger. Konvensjonell mikroskop tillater bare studier med en brennvidde dybde av størrelsesorden mikrometer. ¹¹ Dette er på grunn av begrensetdybdeskarphet når du fokuserer lys:

der f-nummeret N har et gjensidig forhold til kretsen av forvirring (c) slik at en kort brennvidde er forbundet med et stort c.. ^12,13 Mens denne diffraksjon metoden er absolutt ikke en erstatning for konvensjonell mikroskopi, er det i stand å levere kvantitative resultater raskt slik at arter kan også manipuleres på sanntid til lave kostnader. Diffraksjon mønstre kan fås med noen laserpeker. Diffraksjon mønstre kan være filmet med redusert temporal oppløsning ved hjelp av et vanlig digitalkamera. Mens brukeren ikke kan ha et mikroskop eller en fotodiode lett tilgjengelig, kan viktige deler av dette eksperimentet som måling thrashing frekvenser og evaluere diffraksjon mønstre fullføres ved ekstremt lav kostnad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
543 nm HeNe Laser	Melles Griot	LGX1	Any laser in the visible range with less than 5 mW can be used.
2 Front Surface Aluminum Mirrors	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera	Casio
Quartz Cuvette	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernier		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/