Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

Summary

L'articolo descrive il protocollo per sito-specifica di transfezione criptato sequenza di siRNA in una coltura cellulare di mammifero aderente utilizzando una matrice di microelettrodi (MEA).

Abstract

La scoperta della via di RNAi in eucarioti e il conseguente sviluppo di agenti RNAi, come siRNA e shRNA, hanno raggiunto un metodo efficace per mettere a tacere i geni specifici ^1-8 per la genomica funzionale e terapie. Una sfida importante coinvolto in studi basati su RNAi è la consegna di agenti RNAi alle cellule bersaglio. Tradizionali non virali tecniche di parto, come l'elettroporazione di massa e metodi di trasfezione chimici spesso non hanno il controllo spaziale necessaria su consegna e permettere l'efficienza di trasfezione poveri ^9-12. I recenti progressi nei metodi di trasfezione chimici come lipidi cationici, polimeri cationici e nanoparticelle hanno portato ad efficienze di trasfezione altamente avanzate ^13. Tuttavia, queste tecniche ancora non riescono a offrire un controllo preciso dello spazio sulla consegna che possono beneficiare immensamente miniaturizzata tecnologie high-throughput, studi cella singola e le indagini di interazioni cellula-cellula.

nt "> I recenti progressi tecnologici nella consegna del gene hanno permesso alta produttività trasfezione di cellule aderenti ^14-23, la maggioranza dei quali utilizzano elettroporazione microscala. elettroporazione Microscale offre spazio-temporale preciso controllo di consegna (fino a singole cellule) ed è stato dimostrato per ottenere alte efficienze ^{19, 24-26.} Inoltre, approcci basati elettroporazione non richiedono un lungo periodo di incubazione (tipicamente 4 ore) con complessi siRNA e DNA come necessario in metodi di trasfezione base chimica e causare l'immissione diretta di siRNA nudo e DNA molecole nel citoplasma cellulare. Di conseguenza espressione genica può essere ottenuto fino a sei ore dopo la trasfezione ^27. nostro laboratorio ha precedentemente dimostrato l'utilizzo di matrici di microelettrodi (MEA) per sito-specifica trasfezione aderenti in colture cellulari di mammifero ^17-19. Nell'approccio basato MEA, la consegna del carico utile genetica avviene tramite localizzato micro-scala electroporatisu di cellule. Una applicazione di impulsi elettrici agli elettrodi selezionati genera locale campo elettrico che conduce alla elettroporazione di cellule presenti nella regione degli elettrodi stimolati. Il controllo indipendente delle micro-elettrodi fornisce controllo spaziale e temporale sopra trasfezione e permette anche esperimenti di trasfezione multipli basati da eseguire sulla stessa cultura aumentando la produttività e riducendo sperimentale cultura a cultura variabilità.

Qui si descrive l'apparato sperimentale e il protocollo per la trasfezione mirata di aderenti cellule HeLa con una fluorescente tag criptato siRNA sequenza usando elettroporazione. Lo stesso protocollo può essere utilizzato anche per la trasfezione di vettori plasmidici. Inoltre, il protocollo qui descritto può essere facilmente estesa ad una varietà di linee cellulari di mammifero con modifiche secondarie. Disponibilità commerciale degli accordi ambientali multilaterali con i modelli di elettrodi sia predefiniti e personalizzati rendono questa t accessibile tecnicala maggior parte dei laboratori di ricerca o con attrezzature di base di coltura cellulare.

Protocol

1. MEA Preparazione

1. MEA per l'uso negli esperimenti di elettroporazione possono essere fabbricati usando la tecnica standard di fotolitografia come descritto in precedenza ¹⁸ o acquistati direttamente da fornitori di produttori MEA come i sistemi multicanale (http:/www.multichannelsystems.com/) e Alpha MED Scientific, Inc. ( http://www.MED64.com) . Le MEA utilizzati nei nostri esperimenti sono stati realizzati in-house presso l'impianto camera pulita in Arizona State University, che è gestito dal Centro per la Ricerca Elettronica dello Stato Solido (CSSER). I MEA utilizzati nei nostri esperimenti avuto 32 elettrodi indio ossido di stagno in un 8 del 4 array con dimensioni elettrodi diametro 50-200 micron all'interno di un vetro 1 cm di diametro interno bene. Bene il vetro è stato incollato sul usando MEA polidimetilsilossano (PDMS).
2. Sterilizzare il MEA in autoclave prima cella seeding. Altri metodi di sterilizzazione come un ammollo in 70% etanolo, trattamento UV e trattamento con acqua calda come descritto altrove può anche essere utilizzato fintanto che non compromettere l'integrità del MEA.
3. Trasferire il autoclavato MEA di una cappa a flusso laminare e metterla in un piatto polistirene standard sterile Petri. Prima della semina di cellule sulla MEA, sterilizzare la cappa a flusso laminare per accendere la luce UV per 20 min. Se la MEA è sensibile alla luce UV coprire la piastra Petri contenente la MEA con foglio di alluminio sterile mentre la cappa a flusso è sotto illuminazione UV.

2. Cellule semina sul MEA

1. Cellule raccolto da una linea cellulare di esecuzione aderenti cellule di mammifero usando Tripsina / EDTA e alzarle una concentrazione di 100-200 cellule / microlitro in media ml 1 cella per placcatura. Nei nostri esperimenti abbiamo avuto successo nella coltura delle cellule NIH 3T3 fibroblasti linea, linea di cellule HeLa e primari neuroni corticali e ippocampali sulla MEA.
2. 2 ore dopo la semina delle cellule trasferire la capsula di Petri con la MEA dall'incubatore a cappa a flusso laminare e aggiungere delicatamente 400-500 microlitri di pre supporti riscaldati (37 ° C) al MEA bene. Controllare al microscopio per assicurare che le cellule siano ancora attaccato e distribuito uniformemente sulla superficie MEA. Trasferire il MEA per l'incubatrice. Il periodo di attesa 2 ore prima dell'aggiunta di supporto assicura tempo sufficiente per le cellule di aderire alla superficie MEA. Aggiunta del supporto delle cellule troppo presto dopo la semina le cellule possono lavare via le cellule. Se le cellule non aderiscono sulla MEA, la sua superficie può essere trattata con fattori di adesione cellulare quali aspolylysine, fibronectina e laminina per migliorare l'adesione delle cellule. Nei nostri esperimenti sulle cellule HeLa che di solito trattare la superficie con MEA fibronectin (10 pg / ml) per 1-2 ore.
3. 8-12 ore dopo la semina delle cellule, eseguire 1-2 lavaggi con PBS per rimuovere le cellule morte. Medie cellulare può sostituire ogni 24-48 ore, se necessario. In un tipico esperimento, le cellule sono pronte per la trasfezione di solito 24-48 ore dopo la semina. Per mantenere la coerenza in termini di efficienza elettroporazione si consiglia di attendere fino a quando la cultura è almeno l'80% confluenti prima di elettroporazione.

3. Specifici per un sito trasfezione di siRNA

1. Preparare una soluzione di acido nucleico. Per la trasfezione siRNA, preparare una soluzione di 1-2 siRNA pM elettroporazione in tampone ghiacciato elettroporazione per ottenere un volume finale di 200-400 microlitri. In questo articolo il video che dimostrano la trasfezione di cellule HeLa con Alexa 488 coniugato strapazzate sequenza di siRNA.
2. Trasferire il MEA con le cellule dal termostato a cappa sterile a flusso laminare. Rimuovere il supporto delle cellule del MEA ed eseguire un lavaggio con PBS. Successivamente, aggiungere 200-400 microlitri della ice freddo 1 pM elettroporazione soluzione siRNA al pozzo.
3. Applicare anodici impulsi quadri elettrici agli elettrodi mirati (Fare riferimento al punto 4 per la determinazione dei parametri ottimali di impulso elettrico). Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato un Instruments pragmatiche 2414A generatore di forme d'onda per generare impulsi elettrici e un sistema dual-inline-package (DIP) 16 clip passante di entrare in contatto con i rilievi dei titoli di MEA. Il generatore di forme d'onda può essere connesso alla clip DIP demultiplexor tramite una scheda a circuito stampato per fornire selettività dei singoli elettrodi. Per l'elettrodo di riferimento, posizionare un catodo di acciaio nei media cella. Riducendo l'elettrodo di riferimento acciaio nei media è estremamente importante assicurare che non fa contatto con la superficie MEA. Al contatto, può causare danni alle cellule e il MEA. Si raccomanda di ridurre l'elettrodo di riferimento a una posizione di 1 mm sopra le celle. Un distanziatore con un'altezza di 1 mm può essere posizionato nel pozzo per assistere nel posizionamento del refrimento elettrodo. Un approccio alternativo utilizzando un elettrodo di riferimento esterno è utilizzare elettrodi adiacenti come catodo-anodo coppie.
4. Subito dopo l'applicazione degli impulsi elettrici agli elettrodi mirati sulla MEA, trasferire il ritorno alla MEA l'incubatrice. Dopo un periodo di incubazione di 5 minuti, delicatamente sostituire il 75% del tampone di elettroporazione con pre-riscaldato (37 ° C) supporti cellulari. Successivamente, l'imaging fluorescente può essere fatto per confermare la consegna di siRNA fluorescenti etichettato alle cellule.

4. Elettroporazione dei parametri di ottimizzazione

1. Per determinare i parametri ottimali di impulsi elettrici per esperimenti di design elettroporazione, elettroporazione per un intervallo di valori di ampiezza dell'impulso, durata dell'impulso, e il numero di impulsi. Nella nostra esperienza con cellule HeLa, abbiamo osservato che un singolo impulso di tensione di ampiezza da 3 V a 9 V, e la durata di 1 msec a 10 msec per una dimensione di 100 pm elettrodo portato a elettroporazione successo con mila morte delle cellule Nimal. È nostra raccomandazione che un parametro variabile a un tempo e altri sono mantenute costanti. Per quantificare l'efficienza di elettroporazione per ciascuno dei parametri di impulso, usiamo ioduro di propidio (PI), un colorante impermeant cella macchie materiale nucleico, e la metodologia basata assay vivo, come descritto nelle fasi 4,2-4,5.
2. Stabilire una coltura cellulare sulla MEA seguendo le indicazioni riportate ai punti 1 e 2.
3. Prima di preparare una elettroporazione 300-500 microlitri di 30 ug / ml soluzione PI in tampone ghiacciato elettroporazione e 400 pl di 4 um calcien AM soluzione in PBS.
4. Trasferire la MEA dall'incubatore alla cappa a flusso laminare. Rimuovere il supporto delle cellule del MEA ed eseguire un lavaggio con PBS. Successivamente, aggiungere 300-500 microlitri del tampone freddo elettroporazione ghiaccio con PI.
5. Applicare impulsi elettrici con ampiezza di pulsazione desiderata e la durata agli elettrodi mirati (Le attrezzature utilizzate nei nostri esperimenti per la generazione e l'applicazione del eletimpulso tric al MEA è descritto nel passaggio 3.3). Per l'elettrodo di riferimento o abbassare un elettrodo di acciaio nel buffer elettroporazione nel MEA pozzo o utilizzare l'elettrodo vicino come riferimento. Selettivamente applicando impulsi di ampiezza variabile o durate di elettrodi diversi esperimenti multipli può essere eseguita sul dispositivo stesso. Per esempio, su un elettrodo MEA 32, 8 esperimenti possono essere eseguiti suddividendo i 32 elettrodi in 8 gruppi, ognuno composto da 4 elettrodi. Ciascuno degli 8 gruppi possono essere stimolato da un singolo impulso rettangolare di durata tensione 5 msec con ampiezze diverse in 3 V-6 gamma V in incrementi di 0,5 V e un gruppo può essere utilizzato come controllo.
6. Immediatamente dopo l'applicazione di impulsi di tensione trasferire il MEA per l'incubatore per 5 min. Successivamente, rimuovere delicatamente il 75% del tampone di elettroporazione dal MEA pozzo e sostituirlo con supporti cellulari caldi. Trasferire il MEA per l'incubatrice.
7. Dopo un periodo di incubazione di 2-4 hrsostituzione del supporto di cella nella MEA bene con 300-500 ml di 4 mM calceina AM soluzione in PBS. Trasferire il MEA di incubatrice per altri 30 min.
8. Dopo l'incubazione delle cellule con calceina AM, sostituire la calceina AM soluzione nel MEA bene con PBS dopo due lavaggi con PBS. Ottenere immagini fluorescenti di cellule utilizzando con un microscopio ottico con filtri per la PI (eccitazione / emissione - 535 nm/617 nm) e calceina AM (eccitazione / emissione - 490 nm/520 nm). L'assorbimento di PI, a causa di elettroporazione, induce le cellule a fluorescenza rossa e la AM Calcein induce le cellule che sono vivi a fluorescenza verde. Tre possibili scenari che si possono osservare sono: 1) cellule elettroporate e vivo (si fluorescenza sia rosso e verde), 2) cellule vive, ma non elettroporate (sarà solo fluorescenza verde) e 3) le cellule morte a causa di elettroporazione (sarà solo fluorescenza rossa) . La vitalità cellulare è stata calcolata come percentuale del numero totale di cellule vive sull'elettrodo e l'eff elettroporazioneiciency è stata calcolata come percentuale del numero totale di cellule caricate con PI / siRNA.

5. Risultati rappresentativi

La figura 1 mostra il sito-specifica caricamento di cellule HeLa con PI. Si può osservare che le cellule solo sull'elettrodo dimostrano un assorbimento di PI (Figura 1B). Un test dal vivo eseguita elettroporazione messaggio è stato utilizzato per valutare la vitalità delle cellule (Figura 1A). L'efficienza elettroporazione e la vitalità cellulare per l'esempio mostrato nella figura 1 sono 81,8% e 96,1% rispettivamente. Vitalità cellulare ed efficienza elettroporazione può essere ottenuto ottimizzando i parametri di impulso di elettroporazione. Sito-specifica trasfezione di cellule HeLa con siRNA fluorescente etichettato per un impulso di elettroporazione ottimizzato (8 V, 1 msec) è mostrato in Figura 2. L'efficienza elettroporazione per il siRNA a 8 V, 1 msec è risultato essere 74,4 ± 16,0% evitalità cellulare è risultato essere 87,9 ± 8,4% (tutti i dati rappresentati come media ± deviazione standard, N = 5).

Figura 1. Sito-specifica consegna di PI in cellule HeLa su un elettrodo 200 micron (6 V, 5 msec). A) Calcien saggio basato vivo eseguita due ore dopo l'elettroporazione. Cellule vive sono indicati con fluorescenza verde. B) Red fluorescenza dimostra l'assorbimento da parte delle cellule del PI sull'elettrodo. C) Una immagine sovrapposta di A e B. Le frecce bianche indicano cellule che sono elettroporata e vivo. Le frecce nere indicano cellule che sono morti. Il cerchio bianco in A, B e C indica la sagoma dell'elettrodo.

Figura 2. Trasfezione di cellule HeLa con scrambl fluorescente etichettatoLa sequenza di siRNA. A) Immagine di cellule HeLa su un elettrodo di 100 um trasfettate con Alexa 488 siRNA tag (8 V, 1 msec). B) Immagine di nuclei di cellule colorate con DAPI. Il cerchio bianco segna il bordo dell'elettrodo.

Discussion

In questo articolo il video che dimostrano l'uso di MEA per il sito-specifica trasfezione di cellule HeLa con strapazzate sequenza di siRNA. Uno dei vantaggi di questa tecnologia è la sua applicabilità a diverse linee cellulari incluse linee cellulari primarie. Il nostro laboratorio ha già dimostrato l'uso di questa tecnologia per il sito-specifica trasfezione di colture primarie neuronali dell'ippocampo di ratto E18 dal giorno di vita e NIH-3T3 strapazzate con sequenze siRNA e GFP plasmide ^{18, 19.} Abbiamo anche avuto successo nella fornitura di siRNA funzionale contro un bersaglio endogena in cellule HeLa (dati non pubblicati). Un tipico MEA disponibile in commercio è compatibile con imaging ottico (microscopio in posizione verticale), che consente una valutazione quantitativa dell'impatto funzionale di silenziamento genico, utilizzando tecniche immunostaining fluorescenti. Inoltre, i microelettrodi in MEA può essere utilizzato per monitorare l'attività elettrica delle cellule, come i neuroni primari, in risposta alla perturbazione genetica. Ilnatura unica di MEA permette esperimenti simultanei multipli su una singola coltura cellulare, aumentando così la produttività sperimentale. Attualmente una limitazione importante con il sistema basato MEA è la grande quantità di siRNA necessario per trasfezione (400 pl di 1 pm siRNA), che è alto rispetto agli approcci convenzionali trasfezione base chimica e limita quindi l'efficacia dei costi del sistema. Questo può essere in parte superato incorporando mircofluidics con il sistema basato MEA per ridurre il volume totale di soluzione siRNA elettroporazione a meno di un paio microlitri. Inoltre, i microfluidica può consentire la consegna di serie di molecole siRNA diverse, in tal modo migliorando notevolmente il throughput della tecnologia MEA based. In alternativa, molecole siRNA possono essere individuati i microelettrodi prima semina cellulare e quindi le molecole siRNA possono essere trasfettati in cellule mediante elettroporazione inverso ^{15, 23.} Ulteriore sviluppo di questa tecnologia offre un nuovo high-tmetodo del costo hroughput, efficaci ea basse per gli studi di manipolazione genetica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.