אקו העוברי Murine

Summary

מוות עובר ולידה הוא תכונה נפוצה כאשר לומדים שינויים גנטיים המשפיעים על התפתחות לב. הדמית אולטרסאונד בתדר גבוה השתפרה רזולוצית 2-D ויכולה לספק מידע מצוין על התפתחות מוקדמת ולב היא שיטה אידיאלית כדי לזהות את ההשפעה על מבנה ותפקוד לב לפני המוות.

Abstract

עכברים הטרנסגניים מציגים ליקויים בהתפתחות ובתפקוד לבבי מייצגים כלי רב עצמה להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס הוא תפקוד לב וכלי דם נורמלי ובסיס pathophysiological של מחלות לב אנושיות. מוות עובר ולידה הוא תכונה נפוצה כאשר לומדים שינויים גנטיים המשפיעים על התפתחות ^1-3 לב. כדי ללמוד את התפקיד של שינויים גנטיים או תרופתיים בהתפתחות המוקדמת של תפקוד לב, הדמית אולטרסאונד של העובר החי הפכה לכלי חשוב לזיהוי מוקדם של מומים ואורך מעקב. הדמית אולטרסאונד פולשנית היא שיטה אידיאלית לאיתור ולומד מומים מולדים וההשפעה על תפקוד לב לפני המוות ^4. היא מאפשרת זיהוי המוקדם של מומים בעובר החי וההתקדמות של מחלה יכול להיות מלווה ברחם עם מחקרים ארוכי טווח ^5,6.עד לאחרונה, הדמיה של לב עכבר עוברי כרוכה לעתים קרובות בשיטות פולשניות. העובר היה צריך להקריב כדי לבצע מיקרוסקופיה תהודה מגנטית ומיקרוסקופ אלקטרונים או ניתוח נמסר למיקרוסקופיה קוף. יישום של בדיקות בתדירות גבוהה עם קונבנציונלי 2-D ופעם גל דופלר הדמיה הוכח לספק מדידות של התכווצות לב וקצב לב במהלך התפתחות עוברית עם מסדי נתונים של שינויים התפתחותיים נורמלים עכשיו ^6-10 זמינים. M-מצב הדמיה נוספת מספקת נתונים פונקציונליים חשובים, אם כי, מטוסי ההדמיה המתאימים הם לעתים קרובות קשים להשיג. הדמית אולטרסאונד בתדר גבוה של העובר השתפרה רזולוצית 2-D ויכולה לספק מידע מצוין על ההתפתחות המוקדמת של מבני לב ^11.

Protocol

1. הכנת עכברים לדימות

1. לפני מחקר ההדמיה, להרדים את הסכר (2-3% isoflurane) בתא האינדוקציה. הסר את הבהמה מתא האינדוקציה ולמקם את החוטם מייד בתוך חרוט אף המחובר למערכת ההרדמה. הסרת פרווה מרמת אמצע החזה לגפיים תחתונים (ראה תרשים 1) עם קוצץ שיער. הסרת שיער הגוף שנותר עם קרם הסרת שיער. קרם הסרת שיער עשוי לשמש גם ללא מספריים לשיער, ויש ביסודיות יש לשטוף את העור לאחר שימוש כדי למנוע גירוי.
2. הנח את העכבר מורדם במצב שכיבה על כרית חימום עם המוטבע א.ק.ג. מוביל על מנת לשמור על טמפרטורת גוף (איור 1). החל ג'ל האלקטרודה לארבע כפות הרגליים והקלטת אותם לאלקטרודות אק"ג.
3. השג רמת הרגעת מצב יציב לאורך כל ההליך (1.0% ל -1.5% isoflurane מעורבבים עם 100% O _2). הרמה של הרדמה יכולה להיות מותאמת למ 'aintain ריבית היעד של 450 ± לב 50 פעימות לדקה (BPM). תשומת לב צריכה להיות משולמת כדי למזער את המינון של משך isoflurane ושל הרגעה לפחות משעה אחת.
4. הכנס בעדינות בפי טבעת (לאחר שימון) לניטור טמפרטורת גוף באמצעות כרית החימום. זה חשוב כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בטווח צר (37.0 ° C ± 0.5 ° C). הרדמה מבוקרת וטמפרטורת גוף קבועה היא חיונית ליציבות המודינאמית של האם והעובר.

שיקולים טכניים

רכישת echocardiograms עובר יכולה להיות מאתגרת. נתונים שהתקבלו ממחקרים אלה יכולים בלבלו עקב התגובה ללחץ הוא מהסכר והעובר. באופן אידיאלי, טמפרטורת בעלי החיים צריכה להישמר באמצעות פלטפורמת הדמיה מחוממת, מחזור כרית חימום, חימום, מנורות חימום או שמיכות autoregulated. בנוסף, שימוש שגרתי של ג'ל אקוסטי המחומם מומלץ. אללמרות החשש העיקרי בנוגע לשליטה בטמפרטורת גוף הוא להימנע מהיפותרמיה, פיתוח של היפרתרמיה צריך להיות דאגה שווה. מנגנון חימום מבוקר כגון כרית חימום פשוטה או נוכחות של קרבה לתאורת הלוגן יכול לגרום להעלאה מהירה ומסוכנת של טמפרטורת גוף. מאז תנודות טמפרטורת גוף משמעותיות בשני הכיוונים מציבות חיה בסיכון, כל ניסיון צריך להיעשות כדי לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית.

Sonographer רוכש את התמונות צריך להימנע מלמקם לחץ מוגזם על החלל עם המתמר, שכן משקליו של המתמר לבד עלולים לגרום לתפקוד לב שונה. משך רכישה של תמונה גם חייב להישמר עד למינימום (רצוי פחות משעה) על מנת לצמצם את השינויים הפיסיולוגיים והמודינאמית הנובעים מהרדמה ממושכת. בנוסף, משך זמן והחשיפה לisoflurane לכל מחקר חייב להישמר לminimuמ 'בשל השפעות טרטוגניות פוטנציאליות של ¹² isoflurane.

2. זיהוי של עוברים

1. ההדמיה התחילה להשתמש שלפוחית ​​שתן של האם כציון הדרך, עם עוברים על קרני רחם ימניות והשמאליות שכותרתו L1, 2,3, וכולי (בצד שמאל) וR1, 2,3, וכולי (צד ימין) (ראה תרשים 1C). סימון מיקום של עובר שימושי לשליפה של דגימות לאחר הדמיה.
2. דגימות נמצאות עמוק מדי בבטן נסרקות כדי לתעד את נוכחותם, אך הם הוצאו מניתוח נתונים, כי ברזולוציה נמוכה. היכולת לסרוק עוברים סמוכים עשויה לסייע בעוברי מעקב (איור 2 א).
3. מטוסי סריקה שונים על ידי שינוי הכיוון של העכבר ביחס למישור הסריקה. תמונות מתקבלות ב2 מטוסים מאונכים לכל עובר (איור 2). נעשה מאמץ להשיג השקפותיהן דומות למטוסים הרוחביים, הקדמיים, או sagittal אלא שלometimes מוגבל למטוסים אלכסוניים על ידי העמדה של הרחם בחלל הבטן. סיבוב של ראש הסריקה גם יאפשר לשינוי האורינטציה מבלי להזיז את הסכר.

שיקולים טכניים

בעוד פעולת כף יד של החללית אינה ריאלית באקו עכבר הבוגר, תפעול ידני בתחום ההדמיה של עובר באינו מומלץ. זיהוי של עוברים הוא מסובך בגלל האופי המשתנה של מיקום רחם, tortuosity, ותנועה. כדי למזער את קשיים עם לוקליזציה עובר, שימוש מתמר נייח (איור 1) עם תנועה מינימאלית מעבר למישור האופקי של הסכר הוא חיוני.

3. הערכה של מבנה ותפקוד

1. תמונות סריקה ב-mode משמשות כדי לזהות מבני לב בסיסיים כמו אטרייה, מחץ interventricular, תאי חדרית, ושטחי יצוא ימין ועל שמאל (איור 2).
2. תמונת מצב M-זה מתקבל מתצוגת הציר הקצרה ומשמשים למדידת עובי הקיר של חדר וממדים קאמריים (איור 3). אם יישור נכון אין לקבלו בשל שקר עוברי, מדידות מתמונות ב-mode ניתן לכמת% קיצור שבר (FS). שינויים זמניים בין ממד LV סוף סיסטולי (LVESD) וממד LV סוף דיאסטולי (LVEDD) לאורך מחזור הלב משמשים לחישוב שבריר קיצור (FS), כדלקמן:
   FS% = [(LVEDD - LVESD) / LVEDD] x 100
3. חדרי הלב ימניים והשמאליים מזוהים על ידי סריקה מראש ועד זנב. צדדים ימניים ושמאליים צריכים להיות מתועדים. זרמי זרימה גלויים שנוצרו על ידי הדם עוברי echogenic מאפשרים מיקום מדויק של נפח דגימת דופלר בתוך פתח צניפי. מהירות זרימה של חדר שמאל מתקבלת ממסתם מיטרלי בקודקוד נוף ציר ארוך LV (איור 4, C) ארבע קאמריים ו. מדידות יצוא אב עורקים יכולות לשמש למדידת systoזמן הפליטה Lic (איור 4, ד '). קצב לב יכול להיות מחושב מהמדידה של מחזור זרימה אחד לזרימת המחזור הבא (איור 4, C ו-D). יש להקפיד ליישר את זרימת דם ודופלר הקורה כדי למזער את זווית דופלר. ערכים שנלקחו מעבר לזווית של 60 מעלות אינם מדויקים ויש להימנע.
4. תמונות סריקה ב-mode משמשות לזיהוי מומים מולדים מבניים נפוצים כגון פגמים במחיצת חדרית (איור 5). נפח דגימת דופלר בתוך חדרי הלב יכול לשמש כדי לזהות זרימה פני המחיצה חדרית. פרמטרים נוספים הנמצאים במעקב בקלות כוללים גודל עובר, קצב לב, מהירויות זרימה, השתפכויות קרום לב, וhydrops עובר. האבחנה הסופית של מומים לבביים ספציפיים דורשת הערכה נוספת על ידי נתיחה לאחר מוות והיסטופתולוגיה.

שיקולים טכניים

זיהוי של צ'אם ימין ועל שמאלbers יכול להיות קשה בהדמיית לב עוברית עקב הממדים הדומים של תאי חדרית במהלך התפתחות. אסטרטגיה אחת היא להקים אורינטציה עוברית ימין ועל שמאל בזמן אמת על ידי העברת פלטפורמת ההדמיה במישור האופקי. זיהוי של זרבובית, ניצני גפיים, עמוד שדרה ויסייע לזהות את הכיוון בוא / זכותו של העובר. במידת ההאפשר, מעקב אחר מסלול הבריחה לקשת או להדמיה של ההסתעפות העיקרית של עורק הריאה יאפשר זיהוי של מערכת חדר שמאל יצוא או מערכת ניקוז הנכונה בהתאמה. עבור כל עובר למד, חשוב לציין את הכיוון הנחוש של שמאל וימין בתמונות שנשמרו.

ניטור וטיפול בבעלי חיים שלאחר הדמיה

בעקבות השלמת ההדמיה, הסכר חזר לדיור ההולם ומעקב בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי מוסדי שלאחר הליך.שיכוך כאבים לאחר הליך הדמיה זה אינו נדרש. חידוש מלא של פעילות נורמלית יכול להיות צפוי בתוך חמש דקות.

4. נציג תוצאות של אקו העוברי

התפתחותם של בדיקות בתדירות גבוהה (מעל MHz 8), אפשרה לציוד echocardiographic מסחרי יש רזולוציה צירית של כ -0.2 מ"מ ברזולוצית רוחב של 0.3 מ"מ כאשר התמונה מוגדלת ורכשה בעומק של 1 סנטימטר. רוב המתמרים פותחו לאחרונה הם ליניארי שיש את היתרון של הימנעות ליד חפצים בשטח. תדירות גבוהה (30-50 MHz) בדיקות מכאניות פותחה לאחרונה שמספיקים לחזה העכברי וקצב לב, ומאפשר רזולוציה צירית של כ 50 מיקרומטר בעומק של 5-12 מ"מ. לאחרונה, בדיקות בתדירות גבוהה מכאניות אלה יש להוסיף יכולות דופלר צבע מאפשרות הערכה מלאה של חדרית ותפקוד valvular וזיהוי שלציד נגעים בלב של העובר. השיטות שתוארו כאן מבוצעות במערכת VisualSonics Vevo 770 ויכולות להיות מיושמות על כל מערכות כמעט מקבילות. המערכת הנוכחית זמינה מסחרי גבוהה במיוחד תדירות אולטרסאונד יכול לפעול ב 40 הרץ עם עומק הדמיה מקסימאלי של 7 עד 14 מ"מ, עם עד 50-100 רזולוציה צירית מ"מ (Vevo770, VisualSonics, Inc) 60 מ"מ ורוחב. זאת, לעומת 60 הרץ ועומק הדמיה 20 מ"מ, עם 50-100 מ"מ צירי ורזולוצית רוחב 200-500 מ"מ עם מערכת אולטרסאונד הקלינית Acuson סקויה.

בהתחשב בגודלו הקטן של לב העכבר העוברי, מחקרי אקו עובריים בעכברים מאתגרים מבחינה טכנית. בניגוד לאקו בעכברים בוגרים, sonographer חייב להשתמש במטוסי הדמית אולטרסאונד לא קונבנציונליים שהוגדרו על ידי צירי הגוף של העובר. Tortuosity של הרחם משפיע גם על נטייתו של העובר וחייבת להילקח בחשבון. בנוסף, המגבלה הטבועה בעומק של חדירת ultrתדירות גבוהה אולטרסאונד יכול להקשות על תמונה כל הדגימות בהריונות עם מספר גדול של עוברים.

אסטרטגית הדמית אולטרסאונד מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה למומים מולדים לב וכלי דם וextracardiac ^7. מעבר ללימוד שינויים גנטיים, טכניקה זו עשויה לשמש מסך לפגמים בתרופתי ומחקרי רעלים. מתודולוגיה זו יכולה לשמש גם ככלי להכוונה לטיפולים פולשניים כגון זריקות או מדידה של לחצי חדרית ^13.

הטבע לא פולשנית של אולטרסאונד העוברי הוא יתרון, לא רק משום שהיא מאפשרת תפקוד לב וכלי דם שייבדק בתנאים פיסיולוגיים, אלא גם משום שזו מספקת מידע קריטי הפנוטיפי בזמן אמת. בדיקת אורך של לב עוברי, אם כי מבחינה טכנית אפשרי, נותרת מאתגרת עבור כמה סיבות. בדיקת מספר סידורית של אותו העובר וIDEntification של אותו עובר בכל בחינה מאתגרת בהיעדר פגם מבני ברור. תנועה של הרחם והעובר יכול לשנות לחלוטין את הכיוון של דגימה ובכך להפוך את מעקב אורכים ומדידות מעקב קשה ^14.

למרות שאקו הוא טכניקה רבה עצמה לזיהוי של מומי לב, האבחון הספציפי של מומי לב מבניים דורש phenotyping מפורט יותר על ידי נתיחה לאחר מוות ^ו15 היסטופתולוגיה. מתאם של גנוטיפ ועובר מסוים מחייב עוברי קצירה ידי hysterotomy, רצוי מייד לאחר מחקר הד ואילו סכר הוא עדיין מורדם כדי למזער את השינויים באורינטציה ומיקום עובר.

ערכים נורמלים לממדים קאמריים ותפקוד דווחו לעכברים ומשתמשים עובריים של טכניקה זו מומלצת לבדוק את ההפניות שהובאו לערכים ^6-10 אלה. הערכהמורפולוגיה valvular מוגבל על ידי רזולוציית תמונה, אולם מדידות טבעתיות ממד ומדידות מהירות באמצעות הכולים העיקריים הן אפשריים אפילו בראשית ED 9.5. יש להקפיד לקבל יישור נאות עם זרימת דם ואת מתמר ^{10, 16.}

יודגש כי ממדי לב משתנים בהתאם לזני עכברים, מגדר וגיל, ומהירות לשנות בנקודות שונות בזמן עובריים וקצב לב. חשוב לוודא שקבוצות של עכברים מותאמות לפרמטרים אלה. הדמיה של עובר משתנית לפי זן עכבר גם כן. לדוגמה, סכר CD-1 באופן שגרתי בהריון מכיל יותר עוברים בהשוואה לC57/BL6 המתח ובכך עשוי להיות קשה יותר לדמיין את כל הדגימות. מסיבות אלה, שימוש בגיל ומתח ביקורת, שהותאמה לכל אחד מניסויים יש להשתמש במקום זאת בערכי ייחוס. בנוסף, מדידות של פרמטרים שונים, כגון ממד חדר שמאל בסוף דיאסטולי ואחוריעובי קיר עשוי להשתנות בעכברים עד 25% ⁸ רגילים.

איור 1. סקירה כללית של הגדרת שימוש במערכת 770 Vevo VisualSonics. () מערכת המשולבת VisualSonics מעקה עם יחידת ניטור פיזיולוגית. (ב) העכבר ממוקם כראוי ואיפוק על סיפון החימום. הארבעה הגפיים מוקלטים לתוך את האלקטרודות אק"ג. (C) סכמטי של עכבר ופריסה של עוברים בהריון. מספר העוברים בתוך כל קרן של הרחם יכול להשתנות באופן משמעותי, בנוסף לנטייה של העובר. (ד ') סכר ממוקם על פלטפורמת ההדמיה עם חצים המציינים את המטוסים של מניפולציה (ציר ה-X וציר Y) כדי להזיז הסכר להדמיה. Z-הציר מתייחס לתנועה של המתמר כלפי מעלה וכלפי מטה (כפי שמציין חץ בפנל B). B, שלפוחית ​​שתן, L, שמאל; R, ריght.

איור 2. תמונות מייצגות ב-mode. נתון זה מכיל תמונות ב-מצב מייצגים של 14.5 עובר היום עוברי. () ויזואליזציה של שני עוברים שכנים. תיבות מציינות מיקום של לב עובר. (ב ') אתרים אנטומיים בעובר להדריך אורינטציה. 14.5 יום לב עוברי בנוף נוף ארבעה חדרים (C), קצר ציר של חדרים השמאליים וימני (D), מערכת יצוא חדרית ימין ועורק ריאה (רש"פ) (ה), וטקט יצוא חדר השמאלי (LVOT) ואב עורקים (F).

איור 3. הערכת נציג תפקוד חדרים. נתון זה מכילה נציגתמונות של אקו 2D של הראייה הארוכה הציר של הלב ביום עוברי 14.5 (א), וארבעה חדרי תצוגה (B). (C) M-מצבו התווה בקווים המצביעים על הקוטר הפנימי של חדר שמאל וימין בדיאסטולה (R / LVIDd) והתכווצות (R / LVIDs) מתמונת המטוס הקאמרי 4. מחיצת Interventricular (עירוי) היא גם באופן חזותי.

איור 4. הערכת נציג דופלר. נתון זה מכילה תמונות מייצגות של אקו לב 2D של 14.5 יום עוברי בנוף קודקוד ארבעה קאמרי (). אטריום השמאל וחלל חדר שמאלי כבר התוו. (ב) השמת נציג של נפח פעימת גל דופלר מדגם להקלטה של זרימת צניפי. (ג) דפוסי זרימה דופלר צניפי שממנו מוקדם velocit הדיאסטוליy (מסומן "ה") והתכווצות פרוזדורים (מסומן "א"), מהירויות ניתן למדוד. (ד ') נציג אב עורקי דופלר צורת גל. אב עורקי דופלר מטוס יכול לשמש למדידת זמן פליטה (ET). קצב לב (HR) ניתן לחשב מהמדידה של מחזור זרימה אחד לזרימת המחזור הבא. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5. איתור נציג VSD. נתון זה מכיל תמונות ב-מצב מייצגים של 14.5 יום לב עוברי בארבעה קאמרי נוף קודקוד () עם חללי חדרית ימין ושמאל שהותוו ב( B). שים לב לנוכחות של מחיצת interventricular. (ג) סעיף רוחבי של לב הדמיה מוכתמת בhematoxylin וeosin.(ד) תמונת מצב B-של 14.5 יום לב עוברי עם מום עלה גביע חדרית (VSD) מצוינת על ידי החץ. (ה) חללי חדרית ימין ושמאל, המפורטות בהשמה גבי של נפח דגימת דופלר גל דופק להקלטה של זרימה על פני מחיצת interventricular. (F) סעיף רוחבי מוכתמים בhematoxylin וeosin לב הדמיה לאחר שליפת דגימה. (G) על גבי מיקום של נפח דגימת דופלר גל דופק להקלטה של זרימה על פני מחיצת interventricular. (ע) נציג דופלר העתקה מ( G) מדגים זרימה מהשמאל לחדר ימין. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

היכולת לבצע מדידות סידוריות וכדי לזהות עוברים מוטנטים עם מומי לב מדגישה את התועלת של אקו לב וכלי דם לחקר התפתחות נורמלית ולא נורמלית. ניתוח של מבנה ותפקוד לב in vivo הפך חלק בלתי נפרד בתיאור שינויים גנטיים והלא גנטיים להתפתחות עוברת נורמלית. הזמינות של 2D-מודרך דופלר מאפשר לעקוב אחר קצב לב ודפוסי זרימת דם בעת קבלת תמונות בזמן אמת. מומי לב התפתחותיים כגון פגמי חדרית מחיצה יכולים להיות נוכחים וזיהוי. למרות היכולות ברזולוציה הגבוהה של פלטפורמות הדמיה נוכחיות, רכישת מהירויות שיא יצוא ממשיכה להיות קשה, כמו חוסר זרימת הצבע דופלר ההדמיה על רוב המערכות להקשות כדי ליישר את נפח דגימת דופלר עם 2D תמונות ברזולוציה גבוהה. בנוסף, תנוחה עוברית בתוך רחם הקרן עלולה למנועכל המדידות או לייצר הדמיה הכי מוצלחת. המגבלה העיקרית של הדמית אולטרסאונד סריקת עומק שמגביל את היכולת לחזות את כל העוברים מסכר יחיד. אותו העובר יעבור במיקום בתוך הבטן של האם, ובכך סבך את מעקב אורך של אותו העובר. למרות מגבלות אלה, טכניקה לא פולשנית זו עשויה להיות יקרה כדי לפקח על המצב הפיזיולוגי של עוברים בהמלטה ולזהות ולעקוב אחר עוברים שבם ניתן לצפות מומי לב.

טכנולוגיות מתפתחות

VisualSonics 2100 מערכת Vevo, מערכת אולטרסאונד החדשה, יש שלבי מתמרי מערך ליניארי מצוידים להדמית זרימת צבע, ובכך הופכת אותו ניתן לספק יכולות צבע דופלר אפילו בעוברים בE10.5-11.5. מערכת זו גם אפשרויות מעקב הרבב שיכול לספק פונקציה לבבית אזורית מפורטת של פיתוח ¹⁷ שריר לב עוברי. כתמי אור מעקבהדמיה מבוססת על עיוות רקמות ומספקת אמת מידה נוספת להתכווצות שריר לב ותפקוד לבבי אזורי. העיקרון הבסיסי של מעקב הרבב הוא שהשתקפויות אולטרסאונד ליצור סדיר speckle דפוס שהוא ייחודי לכל מגזר בשריר לב. מגזרים אלה לאחר מכן ניתן לעקוב לאורך מחזור הלב ומשמשים לחישוב עקירת רקמות, מהירות אזורית, מתח, ושיעור זן לאורך מישורי רדיאלי, אורך, והיקפיים של הלב. מעבר לאולטרסאונד, שיטות מתפתחות כגון טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר), מייקרו-CT, ומייקרו-MRI, מיושמות להדמיה של עובר, ועשויות להציע הדמיה ברזולוציה גבוהה מתקדמת חינם לאקו ברזולוציה גבוהה ^17.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 770 Imaging System (Toronto, Canada)	VisualSonics
MHz transducer		RMV707B15-45
Isoflurane Vaporizer	Tec 3
Isoflurane			2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane