Yerli, Fibröz Uzun Aralığı ve Bölümlere Uzun Aralığı Kollajen in vitro sentezi olarak

Summary

Basit ve tekrarlanabilir prosedürler ortak bir ticari Tip I kollajen monomer üç yapısal olarak ayrı kollajen derlemeler yapmak için tarif edilmiştir. Yerli tip fibröz uzun aralıklı veya segmental uzun boşluklar kolajen 300 nm uzunluğunda ve 1,4 nm çaplı monomer yapı taşı maruz hangi koşullarda değişen tarafından inşa edilebilir.

Abstract

Kollajen fibrillerin yapı iskele ve mekanik güç sağlamak için hayvan dokusu ekstrasellüler matrikste bulunan. Bunlar doğal kolajen fibriller ~ 67 nm arasında bir karakteristik bantlama periyodiklik sahiptir ve uzunluğu ve çapı 1,4 nm içinde 300 nm, tip I kolajen monomerlerin hiyerarşik montaj yoluyla in vivo olarak oluşur. In vitro olarak, hangi için koşullar değiştirilerek monomer yapı blokları maruz kalanlar, 50 mikron kadar uzunluk ölçüleri arasında değişen özgün yapılarıyla yerel tür fibrillerin sadece dahil olmak üzere, inşa, ama aynı zamanda fibröz uzun boşluklar ve segmental uzun aralıklı kollajen. edilebilir Bu yazıda, ortak bir ticari kollajen monomerlere üç farklı kollajen yapılar oluşturan prosedürleri sunuyoruz. Biz ve diğerleri, bu üç tip için geçmişte yayınlanan olduğu protokolleri kullanarak tipik olarak yapı karışımlarına yol açmaktadır. Özellikle, unbanded fibrillerin yaygın f ididoğal Kollagen yaparken ise kullanınız ve fibröz uzun aralıklı kollajen yaparken yerli fibrillerin çoğu mevcuttu. Bu yeni işlemler hemen hemen sadece arzu edilen fibril tipi kollajen üretme avantajına sahiptir. İstenen yapıların oluşumunu bir atomik kuvvet mikroskopu kullanılarak görüntüleme ile teyit edilmektedir.

Introduction

Kollajen üç polipeptid zincirinin oluşan bir üçlü sarmal yapıya sahip yapısal bir protein sınıfıdır. Bu üçlü sarmal monomerlerin fazla giderek daha büyük yapıları oluşturmak üzere bir hiyerarşik şekilde monte edin. ¹ tespit edilmiştir en az 28 genetik olarak farklı kollajen türleri vardır. Kombine, kollajen tüm kolajen proteinleri ^2% 90 kadar ben baskın formu muhasebe yazın ile hayvanlarda bulunan toplam proteinin% 30 oluşturmaktadır. Tip I kollajen deri, bağ, tendon ve kemiklerde fibrillous yapılar olarak bulunmuştur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve elektron mikroskobu (EM) ben yerli kolajen lifleri genelde ~ 67 nm ^3-5 (genellikle D-bantlama olarak anılacaktır) karakteristik bir süre ile bantlanma Tip görüntüleri.

I kollajen monomerinin iki özdeş α1 (I) zincirler ve bir α2 (I) zinciri, bir daha her fazla oluşan bir üçlü sarmal heterotrimer olduğunu yazınUzun bin amino asitler. Uzun ve uzunluğu ve çapı 1.4 nm 300 nm boyutlarında ince. Kollajen monomerinin kolayca doğal olarak oluşan yüksek mertebeden yapıları ⁶ parçalayarak elde edilebilir ben yazın. Biz ⁷ ve diğerleri ^8-10, bu çözünür monomer yapı taşları sonra in vitro olarak D-bantlı fibril (Şekil 1) yeniden kurmak için kullanılabileceğini göstermiştir.

Doğal kolajen fibriller ilave olarak, iki başka yüksek dereceden kollajen yapılar aynı monomer yapı bloğu kullanılarak in vitro olarak oluşturacak şekilde tespit edilmiştir. Iki yapı fibröz uzun boşluk (FLS) ve segmental uzun boşluk (SLS) kolajen (Şekil 1). Kollajen monomer α1-asit glikoprotein ile kombine edildiğinde FLS kollajen doğal kolajen gibi bir fibrillous yapıdır, ama yerel kollajen ^11. In vitro daha büyük bir bantlama periyodiklik ile karakterize, FLS kollajen oluşturur 13, hem de in vivo olarak gözlenmiştir. Monomerlerin bir kristal kafes ¹⁴ de benzer kayıt hizalanır, çünkü kolajen SLS kristalitlerin olarak tarif edilir. Kollajen monomer adenozin trifosfat (ATP) ¹⁵ ile birlikte olduğunda SLS kollajen oluşturur. Doğal olarak ortaya çıkan SLS kollajen fibroblast kültür ortamında gözlenen ancak çıkarılan doku örneklerinde, olasılıkla küçük boyutu ve ayırt topografik özellikleri ¹⁶ eksikliği nedeniyle. Olmuştur

Bu yazının amacı, iyi FLS ve hatta en deneyimsiz araştırmacı üretebileceği SLS kollajen gibi doğal kollajen fibrillerin yapmak için ayrıntılı yordamlar sunmaktır. Piyasada bulunan gelişmiş başlangıç ​​maddeleri kullanarak, mümkün olduğunca basit protokoller yapmak için çalıştık ve hala güvenilir bir iş var. Nasıl farklı kollajen yapısı karakterize bir AFM kullanmak Biz de ayrıntılıyapılmaktadır s. Bu çalışma bu yüksek mertebeden kollajen yapılar bir veya daha fazla çalışma ve / veya diğer uygulamalarda öncüleri olarak kullanmak isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir, ancak şu anda uzmanlık eksikliği ya da sadece doku örnekleri ile çalışmak istemiyorum edecektir.

Protocol

NOT: Tüm protokoller kullanılan su direnci> 18 var MΩ.cm.

1. Yerli kollajen fibrillerin

1. Su ve 6 ul, 200 mM 20 ul ₂ HCl ve bir mikrofüj tüpü ve karışımı 400 mM KCl 10 ul ile pH 7'ye ayarlanmış HPO ₄ Na birleştirin.
2. Mikrofüj tüpü ve karışım, kolajen monomer (0.01 N HCI içinde yaklaşık 3 mg / ml), 4 ul ekle. Çözelti, berrak ve renksiz olmalıdır.
3. 37 ile önceden ısıtılmış olan bir ısıtma bloğu içinde reaksiyon karışımını ihtiva eden mikrofüj tüpü yerleştirin ° C'de ve 3-4 saat bekletin. Bu noktada, çözelti hafifçe bulanık olabilir ve çoğunlukla doğal kolajen fibriller içermelidir.

2. Fibröz Uzun Aralığı Kolajen

1. Oda sıcaklığında 24 saat arasında bir süre boyunca su dört kez değişen su, 400 ml karşı 12-14 kDa MWCO membranı kullanılarak kolajen monomer (0.01 N HCI içinde yaklaşık 3 mg / ml), 1 ml Dialyze. Diyalizlenmiş collaghemen kullanılmaz en monomer 4 ° C ileride kullanılmak üzere saklanabilir.
2. Su 20 ul, su içinde 3 mg / ml 'α1-asit glikoprotein 20 ul ve bir mikrofüj tüpü içinde diyalize kolajen monomer 20 ul birleştirin. Çözelti, berrak ve renksiz olmalıdır.
3. 30 dakika için oda sıcaklığında reaksiyon karışımını ihtiva eden mikrofüj tüpü bırakın. Bu noktada, çözelti bulanık olabilir ve çoğunlukla FLS kollajen fibrillerin içermelidir.

3. Segmental Uzun Aralığı Kolajen

1. 67 ul su, pH 3.3 'de 100 mM glisin-HCI tamponu 60 ul ve bir mikrofüj tüpü ve karışım su içinde 10 mg / ml, 40 ul ATP birleştirin.
2. Mikrofüj tüpü ve karışım, kolajen monomer (0.01 N HCI içinde yaklaşık 3 mg / ml) 33 ul ekle. Çözelti, berrak ve renksiz olmalıdır.
3. 2 saat için oda sıcaklığında reaksiyon karışımını ihtiva eden mikrofüj tüpü bırakın. Bu noktada, çözüm hala net görünür, ancak gerektiği olacakçoğunlukla SLS kollajen içerir.

4. AFM Karakterizasyonu

1. Cleave yapışkan bant bir parça ile mika yüzeyini kaplayarak ve sonra uzak soyulması bir AFM substrat bağlı mika parçasının yüzeyi. Mika bütün bir tabaka yüzeyinde düzensizliklere azaltmak ve mika tekrar alınması durumunda eski bir numune çıkarılır sağlamak üzere parçalanabilen olduğunu teyit etmek için daha sonra bant kontrol edin.
2. Taze yarılan mika alt tabaka için telcik kolajen çözeltisi 20 ul uygulanır. 5 dakika bekletin.
3. Yavaşça su ile kollajen fibril çözüm durulayın. Bu, direkt olarak mika substrat üzerine merkez ancak kenarında su uygulamak için ve örnek üzerinde akmasına izin vermek için tavsiye edilir.
4. Azot gazı, yumuşak bir akışı altında yüzeyi kurulayın. Bu, mika alt tabakanın merkezinde kenarında doğrudan akım ile değil tavsiye edilir.
5. 200 × büyütmede bir optik mikroskop altında,yerli ve FLS kollajen fibrillerin örnekleri kümeleri göstermek gerekir. SLS kollajen görünür olmayacaktır.
6. Üç farklı kollajen yapıların benzersiz özellikleri AFM gözlenebilir. Genellikle, silikon AFM problar kullanılarak temassızlığı modunda bir AFM ile biz görüntü yerli kollajen fibrillerin, FLS ve SLS kollajen kontak modda bir AFM ile biz genellikle görüntü silisyum nitrür AFM problar kullanılarak fibrillerin ise. Biz çünkü zaman ve maliyet konuları bunu. Silikon AFM probları genellikle görüntüleme yerli kollajen fibrillerin dar bantı yapısı için özellikle yararlı hale silisyum nitrür AFM probları, daha keskindir. Ancak, silikon AFM problar silisyum nitrür AFM soruşturmalardan daha kollajen örnekleri ile kontaminasyona daha yatkındır ve sık sık değiştirilmesi gerekir. Bu nedenle, biz çoğunlukla çözünürlüğü büyük bir zorunluluktur görüntüleme yerli kollajen fibrillerin için silikon AFM probların kullanımı tutuyoruz ve biz Prol kesintili iletişim modunda çalışırkullanışlılığı ong yaşamları.

Biz en azından birkaç kollajen yapıları göstermesi gerekir bir ilk 100 × 100 mikron ² tarama öneririz. Orada, yakınlaştırma itibaren 10 Boyutlar × 10 mikron ² ve sonra 2 × yerli ve FLS kollajen veya SLS kollajen ince özellikleri bantlama periyodiklik gözlemlemek için 2 mikron ² taramak için. Aynı zamanda ilk taramaları temsilcisi olduğunu doğrulamak için kollajen numune üzerinde en az iki diğer bölgelere kontrol etmek iyi bir fikirdir.

Representative Results

Yerli kollajen

100 mM fosfat içinde ~ 0.3 mg / ml kolajen monomer ve 37 sola pH'ı 7 olan 100 mM KCl Reaksiyon karışımı, 3-4 ° C'de saat süre ile açık ~ 67 nm D-bant ile yerli tip kolajen ihtiva eden bir çözelti fibriller elde edilir, unbanded fibrillerin olmadan.

200 × büyütmede bir optik mikroskop altında, birçok fibrillerinin kümeleri normal diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskobu (Şekil 2) tarafından izlendi özellikle mika yüzey görülebilir. Tipik bir örnek olarak, bir rasgele 100 × AFM tarafından 100 mikron ² taraması genellikle uzun 5-50 mikron, en azından bir kaç fibrillerin gösterecektir (Şekil 3a-c). Bireysel, ayrılmış kollajen fibrillerin kolayca bu aşamada tespit edilebilir. 512 × 512 piksel ² resim taraması ile, 10 × 10 mikron ² tarama boyutu yakınlaştırmayı tüm fibriller bantlı olduğunu göstermektedir (Şekil 3d-f 2 tarama boyutu (Şekil 3g-i) yakınlaştırmak için en iyisidir.

Periyodiklik Bantlama sadece ölçme ve birkaç zirveleri ya vadiler arasındaki uzunlamasına mesafe ortalaması alınarak tespit edilebilir. AFM yazılımı sağlar, alternatif olarak, bir tek boyutlu Fourier de kullanılabilir enine kesit uzunlamasına bir boyunca dönüşümü. Şekil 4, bir telcik ve karşılık gelen bir uzunlamasına kesit bir AFM boy görüntü gösterir.

FLS kollajen

1 mg / ml μ1-asit glikoprotein ve 30 dakika için oda sıcaklığında kalan su içinde ~ 1 mg / ml kolajen monomerin reaksiyon karışımı FLS, kollajen fibrillerin bir çözelti elde edilir.

Doğal kolajen halinde görülmektedir ne benzer fibrillerin kümeleri, kolaylıkla 200 bir optik mikroskop altında × m mika alt tabaka üzerinde görülebiliragnification. Tipik bir örnek olarak, AFM ile rastgele 100 × 100 mikron ² taraması genellikle en az birkaç fibrillerin gösterecektir. 512 × 512 piksel ² resim tarama boyutu ile, bantlama dönemsellik gösteren bir 10 × daha doğru 10 mikron ² tarama (Şekil 5a) veya 2 × 2 mikron ² tarama (Şekil 5b). Şekil 5c içine büyüterek ölçülebilir FLS bir telcik uzunlamasına bir enine kesitini göstermektedir.

SLS kollajen

2 mg / ml ATP ve reaksiyon karışımı, pH 3.3 'de 100 mM glisin-HCI tamponu içinde ~ 0.5 mg / ml kolajen monomer 2 saat boyunca oda sıcaklığında bırakılır SLS kollajen bir çözelti elde edilir.

Genellikle, SLS kristalden bir optik mikroskop altında görülebilir olmayacak. Bir AFM SLS kristalden varlığını doğrulamak için gereklidir. Tipik bir örnek olarak, AFM ile rastgele 100 × 100 mikron ² taraması genellikle birçok gösterecektirnoktalar. 10 × 10 mikron ² tarama içine yakınlaştırma genellikle birkaç SLS kristalden (Şekil 6a) gösterecektir. Ve 2 × 2 mikron ² tarama (Şekil 6b) bir SLS kristalit arasında ince yapısını gösterir.

Şekil 1. Kollajen monomer in vitro olarak oluşturulabilir kollajen fibrillerin üç yapısal olarak farklı biçimlerde. AFM görüntüleri hepsi aynı boyutta ölçek (2 × 2 mikron ²⁾ kollajen monomerinin ve üç yüksek mertebeden kolajen yapılarını tasvir.

Şekil 2. Mika üzerinde yerli kollajen fibrillerin optik DIC mikroskobu (a) el değmemiş ve (b) t eşiklenir ve bilenmiş tarafından ~ 200 × büyütmede Dijital görüntüfibriller vurgulamak o.

Mika üzerinde yerli kollajen fibrillerin Şekil 3. AFM görüntüleri. Aralıklı kontak modda AFM genlik görüntüler gösterilir.

Şekil 4,. (A) 0.5 x 1 mikron ² aralıklı temas şeklinde AFM boy görüntü (dikey ölçek = 100 nm) ile bir doğal kolajen fibril (b) uzunlamasına kesiti.

Şekil 5. Mika FLS kollajen fibrillerin AFM görüntüleri. (A) 10 × 10 mikron ² kontak modda AFM sehim görüntüsü, (b) 2 × 2 mikron ² kontak modda AFM sehim görüntüsü ve (c) BoyunaBir FLS kollajen fibril kesiti.

Şekil 6. Mika SLS kollajen AFM görüntüleri. Aralıklı kontak modda AFM genlik görüntüler gösterilir.

Discussion

Kollajen monomer Saflaştırılmış düşük pH ve sıcaklıkta kararlı olan ve doğal kolajen fibril oluşumunun esasen kolajen monomer çözeltisinin pH ve sıcaklık yükseltme içerir. Monomerlerin bantlı kollajen fibrillerin sulandırılması için prosedürler fazla 50 yıl boyunca var olmuştur. 15 yıl önce kollajen ile ilk çalışmalarda kullanılan laboratuvar ⁷ prosedürleri dayandığını prosedürü 1986 ¹⁰ yılında Chapman ve arkadaşları tarafından özetlenmiştir. Daha önceki çalışmalar içinde kollajen fibril oluşumu için koşullar 34 nolu Na ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ (I = 0.2, pH 7.4) tampon içinde 0.18 mg / ml kolajen monomer ° C idi Bu ve biz denedim diğer prosedürlerin dezavantajı istenilen bantlı fibril birlikte oluşan her unbanded fibrillerin olmasıdır. Yeni koşullar ~ pH 7'de 100 mM fosfat ve 100 mM KCl içinde 0.3 mg / ml kolajen monomer 3-4 saat boyunca 37 ° C'de bırakılır. Procedure yerli kollajen fibrillerin yapmak için önceki yordamı her yönüyle farklıdır burada tarif. Ama en belirgin, biz tampon konsantrasyonu yükselterek ve 100 mM KCl ekleyerek iyonik gücü iki katına çıkardık. Münhasıran bantlı kollajen fibrillerin daha tutarlı oluşumunda iyonik kuvvet sonuçlarında artış.

Kollajen monomer çözeltisi kullanımı üreticinin önerdiği tarihe geçmiş iken bizim deneyimlerimize göre, bu prosedürü doğal türü kollajen üretilen olmadığını sadece zaman oldu. Bu durumda, ne tüm hala gözlenen birçok fibrillerin için unbanded ama çoğunlukla unbanded edilmektedir az fibrillerin gelen aralıkları görülmektedir. Aşımına uğramış kolajen monomer genellikle hala başarılı bir doğal kolajen yapmak için kullanılabilir, fakat başarısız olduğunda, yeni kolajen monomer kesinlikle satın alınması gerektiğini not edin.

FLS birinci Highberger ve arkadaşları tarafından tespit edilmiştir. Kolajen preparatlar içinde ¹⁷ Orekhovic yatırılırh ve ark. ^18. Ileri çalışmalara Highberger ve Schmitt bunu FLS ¹² oluşumunu teşvik α1-asit glikoprotein olduğu sonucuna götürdü. Daha sonra ticari olarak temin kolajen monomer ve düşük pH değerlerinde α1-asit glikoprotein, birleştirme ve yavaşça pH 24 saat ¹¹ için suya karşı diyaliz ile karışım artmasına izin verilmesi ile FLS kollajen yapımı için işlem çoğaltmak için mümkün. Şimdi, ilk olarak suya karşı diyaliz ve kollajen monomer sadece FLS kolajen oluşturmak için suda α1-asit glikoprotein ile birleştirerek Bu prosedürün bir modifikasyonu sunulmaktadır. Burada anlatılan FLS kollajen montaj koşulları çok daha az zaman alıcı vardır. Kollajen monomer hala su karşı önceden diyalizlenmiş olması gerekir, ancak toplu olarak yapılır ve ardından ° C stably kullanılıncaya kadar 4 saklanabilir. Bu yeni prosedür verimleri çoğunlukla bantlı kollajen fibrillerin FLS.

Bizim deneyim, α1-asit glikodüşük bir kombine protein ve su içeriği ile protein ve çıkarsama yüksek şeker içeriği ile, başarıyla FLS fibrillerin yapmak için kritik öneme sahiptir. Biz genellikle bizim kullandığımız α1-asit glikoprotein lot 82 veya daha az bir kombine% protein ve su içeriğine sahip olduğu üreticisine başvurun. Ve çok eski yerli kollajen sentezi, kollajen monomer için prosedür olarak da FLS kolajen üretmek için başarısızlıkla sonuçlanabilir. Buna ek olarak, diyaliz için kullanılan suyun saflığını bu işlem çok önemlidir. Örneğin, hatta karşı kolajen monomer ~ 8 MΩ.cm yerine FLS kolajen oluşturmayan bir kolajen çözeltisi içinde> 18 MΩ.cm su sonuç diyaliz.

Üç kollajen fibril tipleri ki, kazanmak için en kolay SLS kolajen. SLS erken hazırlanması Schmitt ve co-workers ¹⁵ tarafından tarif edilmiştir. Biz piyasada satılan argo kullanarak SLS kollajen yapımı için 12 yıl önce bu prosedürü bir adaptasyon yayınladıagen ^14. Prosedür, sadece 2 mg / ml ATP ve% 0.05 'de 0.5 mg / ml kolajen monomer (v / v) pH 3.5 asetik asit birleştirerek, ve gece boyunca oda sıcaklığında karışım bırakarak neden oldu.

Bizim deneyim, kontrol edilmesi gereken SLS montaj kritik yönü reaksiyon çözeltisinin pH değeri. SLS kristalden toplulaştırılmış kümeleri daha temel koşulları (~ pH 3,6-3,9) sonuçları toplandı. Daha asidik koşullarda (~ pH 2,9-3,2) pH 3,3-3,5 arasında ideal koşullar altında montajı olanlar daha ince, daha ayrılmış kristalden sonuçları. Bu aralığı (<2.8 ve> 4) dışında Reaksiyon pH herhangi SLS kollajen verim yok. Geçmişte, asetik asit ilave edilerek reaksiyon karışımının pH değeri ayarlanır. Daha da prosedürü basitleştirmek için, bu makalede, pH değerini kontrol etmek bir glisin-HCI tamponu tanıttı.

Yukarıda tarif edilen protokollere oluşan üç farklı yapılara kolajen karakterO istik özellikler sadece nanometre çözünürlük yeteneğine sahip araçlar tarafından ayırt edilebilir. Doğal ve FLS kolajen ~ 67 nm ve ~ 270 nm periyotlarda bandı ile karakterize edilir. SLS kollajen uzun boyutu sadece ~ 360 nm. Biz üç farklı kollajen yapıları karakterize bir AFM nasıl kullandıklarını özellikle nitelendirdiler. Ancak, herhangi bir AFM probu <10 nm yarıçaplı olan temas veya aralıklı temasta modunda herhangi AFM işletim Ayrıca görüntü bu kolajen yapılarını gerekir. Buna ek olarak, elektron mikroskobu olabilir ve bunlar kolajen yapılar ¹⁹ karakterize etmek için kullanılmaktadır.

Bu işlemlerin büyük avantajı istenilen kolajen inşa ağırlıklı üretmek. Bu reaksiyonlar bulunan kollajen sadece diğer formu genellikle AFM görüntüleri arka plan görülebilir başlangıç ​​monomer vardır. Doğal ve FLS kolajen durumunda, bunlar kolaylıkla unrea çoğu ayrılabilirsu ile ortaya çıkan, doğal veya FLS, kolajen pelet tekrar santrifüj ve yıkanması yoluyla cted monomer.

Biz gelişmiş, ticari olarak mevcut başlangıç ​​materyalleri kullanarak yerel, FLS ve SLS kollajen yapmak için basit ve güvenilir prosedürler sundu. Bütün bu işlemlerde kullanılan kollajen monomer saflaştırılmış bir formda ticari olarak temin edilebilmektedir. α1-Asit glikoprotein ve ATP ticari de mevcuttur her ikisi de.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl)	Inamed Advanced Biomatrix	5409 5005-B	Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1)
ATP	Research Biochemicals International	A-141	Lot FBJ-1194A
α1-acid glycoprotein from bovine plasma	Sigma-Aldrich	G3643	Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content)
a1-acid glycoprotein from human plasma	Sigma-Aldrich	G9885	Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content)
mica	Ted Pella	53
Pointprobe - Silicon SPM-Sensor	Nanoworld	NHC	Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode
Veeco Nanoprobe Tips	Veeco (now Bruker AFM probes)	NP-S	Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode