Summary
पृथक hippocampi से तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से astrocytes और में न्यूरॉन्स की एक साथ electrophysiological रिकॉर्डिंग की तैयारी
Abstract
Astrocytes एक साथ न्यूरॉन्स त्रिपक्षीय synapses साथ फार्म है, जहां वे एकीकृत और neuronal गतिविधि मिलाना. दरअसल, astrocytes उनके आयन चैनल और neurotransmitter रिसेप्टर्स की सक्रियण के माध्यम से neuronal आदानों भावना, और भाग में गतिविधि पर निर्भर gliotransmitters की रिहाई के माध्यम से प्रक्रिया की जानकारी. इसके अलावा, astrocytes glutamate के लिए मुख्य तेज प्रणाली का गठन, पोटेशियम स्थानिक buffering के योगदान, GABA निकासी के लिए अच्छी तरह से. इन कोशिकाओं को इसलिए लगातार synaptic गतिविधि पर नजर रखने, और synaptically जारी ग्लूटामेट, GABA और कोशिकी पोटेशियम के स्तर में परिवर्तन के लिए इस तरह से संवेदनशील संकेतक हैं. इसके अतिरिक्त, astroglial तेज गतिविधि या buffering के क्षमता में परिवर्तन neuronal कार्यों पर गंभीर प्रभाव हो सकते हैं और जब physiopathological स्थितियों या पीटा चूहों निस्र्पक अनदेखी हो सकती है. इसलिए दोहरी neuronal और astroglial गतिविधियों की रिकॉर्डिंग में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका हैअन्तर्ग्रथनी शक्ति astroglial तेज और buffering क्षमता में परिवर्तन सहगामी जुड़े. यहाँ हम वर्णन कैसे hippocampal स्लाइस, परत radiatum astrocytes की पहचान के लिए, और एक साथ neuronal और astroglial electrophysiological प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड करने के लिए कैसे तैयार करने के लिए. इसके अलावा, हम वर्णन कैसे pharmacologically synaptically पैदा astroglial धाराओं को अलग करने के लिए.
Protocol
1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव और Intracellular समाधान की तैयारी
- प्रयोग शुरू करने से पहले, एक पैच दबाना रिकॉर्डिंग, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हिप्पोकैम्पस तैयारी के लिए कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के लिए आंतरिक समाधान तैयार करने की जरूरत है. आप इसके अलावा एक विच्छेदन शल्य कैंची से काटना और ठीक आईरिस कैंची, दो spatulas और संदंश (ललित विज्ञान उपकरण) से मिलकर किट की आवश्यकता होगी एक गिलास बक डिवाइस (माइक्रो फिल्टर मोमबत्ती, ROBU जर्मनी) और ऊतक ग्रिड (मच्छरदानी या तंग नायलॉन); के रूप में के रूप में अच्छी तरह से superglue (Uhu सेंध). इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी टुकड़ा पैच सेटअप के विन्यास Finkel और बूकमेन, एक 2001 में वर्णित किया गया है.
- आंतरिक समाधान के लिए, भंग (मिमी): 105 कश्मीर gluconate, 30 KCl, 10 HEPES और विआयनीकृत पानी में 0.3 EGTA (अंतिम मात्रा 70-80%). 4 डिग्री सेल्सियस समाधान शांत और जोड़ने (मिमी): 4 एटीपी मिलीग्राम, 0.3 GTP-Tris और 10 phosphocreatine. 7.4 KOH और भरण यू के साथ पीएच समायोजितअंतिम मात्रा विआयनीकृत पानी के साथ पी. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). इस समाधान (ताकना आकार 0.2 सुक्ष्ममापी) फ़िल्टर. 3-4 सप्ताह के लिए स्थिर Aliquoted समाधान है - 20 डिग्री सेल्सियस एक दिन के लिए प्रयोगात्मक, ~ आंतरिक समाधान के 1 मिलीग्राम की जरूरत है.
- जबतक अन्यथा न कहा गया हो, हिप्पोकैम्पस और CA1 क्षेत्र में तैयारी कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया ACSF, (मिमी): 119 NaCl, KCl 2.5, 2.5, 2 CACL, 1.3 MgSO 4, 1 नहीं 2 पीओ 4, 26.2 NaHCO 3 और 11 ग्लूकोज. Carbogen (95% ओ 2 और 5% सीओ 2) के साथ - विआयनीकृत (~ 320 osmolarity mOsm) पानी और आक्सीजन के साथ मिलना इस समाधान में कम से कम 10 मिनट (पीएच 7.4 ~ 7.3) के लिए इन लवण भंग. प्रयोग प्रति समाधान के कम से कम 1 लीटर तैयार. Hippocampal ऊतक कि हिप्पोकैम्पस के CA3 क्षेत्र में प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की तैयारी के लिए विशेष रूप से ध्यान रखा जाना चाहिए. दरअसल, इस क्षेत्र में गतिविधि और बाद में neuronal मौत epileptiform प्रवण है. इस प्रकार synaptआईसी गतिविधि जोरदार टुकड़ा की तैयारी के दौरान कम किया जाना चाहिए, और यह बहुत ठंडा sucrose युक्त समाधान में हिप्पोकैम्पस विच्छेदन (मिमी) का प्रदर्शन द्वारा इस हासिल की है: 87, NaCl 2.5 KCl, 0.5 2 CACL, 7 2 MgCl, 1 नहीं 2 4 पीओ , 25 3 NaHCO, 10 ग्लूकोज और 75 सूकरोज. इस समाधान में, कम सोडियम, कम कैल्शियम और उच्च मैग्नीशियम सांद्रता के संयोजन व्यापक presynaptic फायरिंग और रिलीज की संभावना है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पोस्टसिनेप्टिक NMDA रिसेप्टर गतिविधि को कम करने के लिए, इस प्रकार सहज गतिविधि और कोशिका मृत्यु को कम. तैयार हो जाने के बाद, hippocampal CA3 क्षेत्र से कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया स्लाइस संशोधित ACSF के साथ perfused हैं, 4 मिमी CACL 2 और 4 4 MgSO युक्त polysynaptic गतिविधि को कम करने.
2. एक्यूट hippocampal स्लाइस तैयारी
- ~ टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष के लिए ACSF के 300 मिलीग्राम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयारी के लिए शांत हो जाओ, जबकि लगातार साथ oxygenatingcarbogen. ACSF साथ कमरे के तापमान (आर टी) टुकड़ा भंडारण, जो भी carbogen (स्कीम चित्रा 1) के साथ oxygenated है के लिए एक छोटे से बीकर तैयार.
- एक छोटे से कागज 1 मिलीलीटर isoflurane कि पिंजरे में जोड़ा है साथ लथपथ तौलिया के साथ एक डाकू के तहत माउस anesthetize.
- बाद माउस गहरा anesthetized है, सिर काट दिया और यह सीधे ठंडा oxygenated ACSF के साथ एक छोटे पकवान में जोड़ने. एक छोटे से कैंची से काटना के साथ खोपड़ी निकालें और बाद के चरणों के लिए ऊतक पर सिर हस्तांतरण. हिप्पोकैम्पस टुकड़े करना शुरू करो, के रूप में सचित्र और चित्रा 1 में वर्णित है.
- (3 सुक्ष्ममापी / सेक) कम गति और बर्फ के ठंडे में 70 हर्ट्ज के कंपन आवृत्ति में 300-400 सुक्ष्ममापी मोटी अनुप्रस्थ स्लाइस काटें ACSF oxygenated, और उन्हें एक गोदाम में स्थानांतरित कर सकते हैं. कम से कम 1 घंटा पूर्व रिकॉर्डिंग के लिए आरटी पर स्लाइस आराम करने दो.. स्लाइस CA3 प्रयोगों के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट में संग्रहित कर रहे हैं और आरटी में कम से कम 30 मिनट, टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया से ठीक करने के लिए. 3. पैदा Astroglial धाराओं और Neuronal फील्ड क्षमता की दोहरी रिकॉर्डिंग
- लगातार oxygenated ACSF (1.5-2 मिलीग्राम / मिनट, आरटी) के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष छिड़कना, 100 सुक्ष्ममापी (GABA एक प्रतिपक्षी) picrotoxin उत्तेजक प्रतिक्रियाओं को अलग करने के लिए शामिल है. (1.5 से 3 मिलीग्राम / एमएल) लेपित coverslip पाली एल lysine पर एक टुकड़ा स्थानांतरण, तरल सोख करने के लिए एक अच्छा टुकड़ा आसंजन को प्राप्त करने और टुकड़ा के शीर्ष पर ASCF की एक बूंद जोड़ें. रिकॉर्डिंग चेंबर में coverslip रखें. Picrotoxin द्वारा निरोधात्मक संचरण की नाकाबंदी epileptiform गतिविधि में, यानी सहज, neuronal आबादी के तुल्यकालिक फायरिंग कर सकते हैं, जो पैदा की घटनाओं की माप बिगाड़ना जाएगा. इस प्रकार, लिए epileptiform गतिविधि को रोकने, एकCA1 और CA3 क्षेत्रों के बीच फ्लैट कट (केवल सतह) Schaffer collaterals (2a चित्रा में संकेत) के माध्यम से प्रचार - प्रसार को रोकने के लिए.
- स्ट्रेटम radiatum astrocytes उनके छोटे सोम (~ 10 सुक्ष्ममापी) आकार और तारामय प्रक्रिया विधानसभा से पहचाना जा सकता है. टुकड़ा सतह के नीचे कम से कम 20-30 सुक्ष्ममापी एक सेल चुनें. चांदी के तार कि प्रोत्साहन अलगाव बॉक्स से जुड़ा है और स्नान (बस कांच विंदुक के आसपास 2 चांदी के तार लपेटकर द्वारा) के लिए जमीन पर एक कांच उत्तेजना इलेक्ट्रोड (टिप प्रतिरोध ~ MΩ 1) माउंट. Schaffer संपार्श्विक क्षेत्र में उत्तेजना इलेक्ट्रोड प्लेस के रूप में चुना astrocyte से 200-300 मीटर दूर की दूरी पर चित्रा 2A में संकेत दिया है. एक chlorinated चांदी एम्पलीफायर के headstage से जुड़े तार पर पर्वत क्षेत्र रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (~ MΩ 2-5). दोनों इलेक्ट्रोड ACSF साथ पहले से भर रहे हैं. मोड मैं = 0, जो बाहरी कॉम अक्षम multiclamp में चुनेंमांग इनपुट और इलेक्ट्रोड ~ 50 सुक्ष्ममापी परत radiatum क्षेत्र में astrocyte (2A चित्रा) से दूर रखें. 2 से 10 लाभ और एक 2 kHz Bessel फिल्टर के साथ फिल्टर के साथ प्रतिक्रियाओं रिकार्ड. मस्तिष्क टुकड़ा में इलेक्ट्रिक वर्तमान इंजेक्शन आसपास Schaffer संपार्श्विक presynaptic टर्मिनलों पर और बाद में ट्रांसमीटर रिहाई axons में कार्रवाई क्षमता को चलाता है कि परियोजना postsynaptic CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के लिए. जारी ट्रांसमीटरों postsynaptic ionotropic रिसेप्टर्स के माध्यम से कोशिकाओं में सकारात्मक प्रभारी प्रवाह है, जो औसत दर्जे का एक छोटे से नकारात्मक संभावित रूप extracellularly ट्रिगर किया जाएगा. इस क्षेत्र उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी संभावित (fEPSP) एक साथ सक्रिय न्यूरॉन्स के एक समूह की गतिविधियों को एकीकृत, जबकि निरोधात्मक संचरण pharmacologically अवरुद्ध है. कुछ परीक्षण दालों (0.1 मिसे अवधि) को लागू करने के लिए एक fEPSP आह्वान, उत्तेजना इलेक्ट्रोड के कुछ repositioning fEPSP को बढ़ाने में मदद कर सकता है. एक ठेठ CA1 परत radiatउम fEPSP चित्रा 2B में सचित्र है. इसके अलावा स्थिति और प्रतिक्रिया waveforms पर विवरण युआन एट अल में पाया जा सकता है 2003 2. एक स्वस्थ hippocampal टुकड़ा में fEPSP आयाम आमतौर पर दो बार के रूप में फाइबर वॉली के आयाम के रूप में बड़ा से अधिक होना चाहिए. सटीक मात्रा का ठहराव के लिए का fEPSP आयाम या ढलान, प्रतिक्रिया पैदा monosynaptic हो, गतिविधि के रूप polysynaptic (एक बहु - पीक प्रतिक्रिया के रूप में detectable) synaptic गतिविधि का संकेत बिजली की उत्तेजना है, जो hyperexcitability के लिए एक संकेत हो सकता है की स्वतंत्र चाहिए. हिप्पोकैम्पस के CA3 क्षेत्र में प्रदर्शन प्रयोगों के लिए, उत्तेजना और रिकॉर्डिंग pipettes चित्रा 3C में सचित्र के रूप में तैनात हैं. स्पष्ट रूप से काई से भरा फाइबर आदानों, जो दृढ़ता की सुविधा है बनती नाड़ी (50 मिसे interpulse अंतराल) उत्तेजना कुछ सेकंड के लिए और 1 हर्ट्ज उत्तेजना की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर शुरू में कम आयाम पैदा fEPSP responses.At अंत बढ़ाने के लिए लागू कर रहे हैंका प्रयोग, DCGIV, एक mGluR2 / 3 रिसेप्टर प्रतिपक्षी, आगे सत्यापित करें कि वास्तव में काई से भरा फाइबर आदानों प्रेरित थे में धोया जा सकता है. इस विरोधी के अनुप्रयोग ~ 90 रिसेप्टर्स mGluR2 / 3, काई से भरा फाइबर BOUTONS से बाधा presynaptic रिहाई की उच्च अभिव्यक्ति के लिए कारण% द्वारा fEPSP कम करना चाहिए.
- फ़िल्टर्ड आंतरिक समाधान के साथ एक पैच विंदुक (~ MΩ 2-5) भरें और इसे एक chlorinated चांदी के 2 headstage जुड़े तार पर माउंट करने के लिए, एक सिरिंज, जो अपने विंदुक धारक को टयूबिंग के माध्यम से जुड़ा हुआ है के साथ सकारात्मक दबाव लागू. लगातार 10 mV की एक 20 मिसे परीक्षण पल्स लागू करते हैं और ऊतकों में विंदुक कदम जब तक आप कोशिका की सतह तक पहुँचने और झिल्ली में एक विक्षेपन दिखाई हो जाता है. शून्य ऑफसेट विंदुक, सकारात्मक दबाव को दूर करने के लिए, और झिल्ली लगाएँ - 80 mV. एक gigaseal (कम से कम 1 GΩ) (यह अब कई सेकंड से नहीं लेना चाहिए) तक पहुँच जाता है जब तक रुको. कुछ नकारात्मक दबाव के कोमल आवेदन एजी तक पहुँचने में मदद कर सकता हैigaseal. सेल में तोड़ नकारात्मक दबाव की एक छोटी आवेदन द्वारा हासिल की है या multiclamp में जैप समारोह का उपयोग कर. Schaffer fEPSP और वोल्टेज दबाना में astroglial प्रतिक्रिया (-; आवृत्ति 0.1 हर्ट्ज, Bessel फिल्टर 2 kHz, 10 लाभ 80 mV Vhold) पैदा संपार्श्विक के एक साथ रिकॉर्डिंग शुरू. astroglial वर्तमान प्रतिक्रिया Biphasic है: 1 आप एक तेजी क्षणिक जावक वर्तमान, बगल पिरामिड कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न fEPSPs को दर्शाती जाएगा. यह धीरे धीरे बढ़ रहा है और खस्ताहाल आवक वर्तमान (neuronal प्रतिक्रियाओं की समाप्ति के बाद बने कई (> 10 सेकंड) सेकंड) द्वारा पीछा किया जाता है. यह वर्तमान astrocytes में पोटेशियम प्रविष्टि के लिए मुख्य रूप से कारण है depolarized postsynaptic टर्मिनलों आसपास रिलीज के बाद,. एक साथ सक्रिय तेजी क्षणिक ग्लूटामेट वर्तमान ट्रांसपोर्टर (GLT), presynaptic ग्लूटामेट रिहाई के द्वारा ट्रिगर पोटेशियम वर्तमान से छिपा हुआ है. astrocyte, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पैच के उपयोग प्रतिरोध की होल्डिंग क्षमता मो होना चाहिएप्रयोग भर nitored और भिन्न हो सकते हैं, नहीं होना चाहिए ~ 20% से अधिक रिकॉर्डिंग परिस्थितियों में बदलाव के कारण astroglial reponses की गलत निगरानी से बचने के. एक प्रारंभिक धारण क्षमता -70 mV के साथ केवल astrocytes स्वस्थ कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए जांच की जानी चाहिए.
- वोल्टेज से वर्तमान दबाना स्विच क्रम में पैदा astrocytic झिल्ली विध्रुवण रिकॉर्ड. Glial ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर (GLT) ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर अवरोधक kynurenic एसिड (5 मिमी) का छिड़काव द्वारा वर्तमान को अलग करने के लिए, जब तक fEPSP और पूरी तरह से अवरुद्ध है GLT आयाम एक पठार तक पहुँच गया है. स्पष्ट रूप से पहचान GLT वर्तमान विशिष्ट प्रतिपक्षी डीएल threo β-Benzyloxyaspartatic एसिड (डीएल TBOA, 200 सुक्ष्ममापी) लागू. 2 गुना 5 गुना उत्तेजना शक्ति अलग synaptic ताकत पर neuronal और astroglial प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड है, और दो निकट दूरी उत्तेजनाओं (50 मिसे अंतराल) को लागू करने के लिए बनती नाड़ी उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं की जांच बढ़ाएँ. श्रृंखला r की स्थिरताglial सेल की esistance और झिल्ली क्षमता रिकॉर्डिंग भर में निगरानी की जानी चाहिए.
- कल्पना करने के लिए अंतर - जंक्शन की हद तक astroglial नेटवर्क मध्यस्थता, डाई युग्मन प्रयोगों वर्तमान क्लैंप मोड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, किसी भी मौजूदा इंजेक्शन के बिना, कम आणविक (<1.5 केडीए) sulforhodamine बी जैसे रंजक, निष्क्रिय प्रसार सक्षम, अंतराल के जंक्शन चैनलों के माध्यम से. आसपास के ऊतकों में डाई spillover को कम करने के लिए, सकारात्मक दबाव पैच विंदुक माध्यम से लागू किया जाना चाहिए जब ऊतक में प्रवेश करने और जितनी जल्दी हो सके पैच तक पहुँच जाना चाहिए.
हम यहाँ वर्णन कैसे रिकॉर्ड करने के लिए astroglial और neuronal प्रतिक्रियाओं, यानी प्रतिक्रियाओं एक बाह्य इलेक्ट्रोड का उपयोग afference उत्तेजना के माध्यम से synapse सक्रियण द्वारा प्रेरित synaptically - पैदा.
Representative Results
पैदा astroglial synaptically - और neuronal प्रतिक्रियाओं के एक प्रतिनिधि एक साथ हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में रिकॉर्डिंग (fEPSPs) चित्रा 2 एबी में दिखाया गया है. पैदा astroglial वर्तमान biphasic है, यानी यह एक क्षणिक जावक वर्तमान और धीरे धीरे खस्ताहाल आवक वर्तमान (> 10 सेकंड) (चित्रा 2B) के होते हैं. जावक वर्तमान पैदा fEPSP को दर्शाता है, और kynurenic एसिड (अंधेरे ग्रे ट्रेस, चित्रा 2B) 3 से ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की निषेध के बाद अवरुद्ध है. धीमी गति से आवक वर्तमान के बहुमत astrocyte निम्नलिखित postsynaptic विध्रुवण में पोटेशियम प्रविष्टि को दर्शाता है, क्योंकि यह भी kynurenic एसिड, (चित्रा 2B और चित्रा 2C 1) जो postsynaptic ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर गतिविधि रोकता 3-6, मुख्य प्रतिनिधित्व करते हैं के लिए जाना जाता है के द्वारा समाप्त कर दिया है पोटेशियम 7 रिलीज के स्रोत (80%). शेष तेजी से एक बढ़तीघ खस्ताहाल आवक वर्तमान GLT प्रतिपक्षी डीएल TBOA (हल्के भूरे रंग के निशान, चित्रा 2B और चित्रा 2C 2) से हिचकते है. Kynurenic एसिड (अंधेरे ग्रे ट्रेस) में वर्तमान से शेष TBOA (प्रकाश ग्रे ट्रेस) में धीमी गति से वर्तमान के घटाव के बाद अस्थायी शुद्ध astroglial ग्लूटामेट वर्तमान ट्रांसपोर्टर (काले ट्रेस), के अलगाव के रूप में चित्रा 2C 2 सचित्र की अनुमति देता है. लगातार धीरे kynurenic एसिड में वर्तमान खस्ताहाल और (हल्के भूरे रंग के निशान, चित्रा 2B और चित्रा 2C 2) TBOA TTX (नहीं दिखाया डेटा) द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, और सबसे अधिक संभावना कोशिकी कश्मीर के संचय को दर्शाता है + presynaptic अभिवाही 3 फायरिंग के दौरान जारी की. मध्यम एकल उत्तेजना Schaffer collaterals के छोटे पैदा विध्रुवण एक ही सेल (चित्रा 2 डी) में दर्ज की तुलना में एक अपेक्षाकृत बड़े synaptically पैदा astroglial वर्तमान लाती है. इस की वजह से हैastrocytes कम झिल्ली प्रतिरोध. Synaptically पैदा astroglial झिल्ली क्षमता गतिशीलता की रिकॉर्डिंग, के रूप में चित्र 2d में सचित्र, स्थानीय कोशिकी पोटेशियम 8 स्तरों के एक सीधा उपाय है. पैदा अंतर्निहित neuronal गतिविधि astroglial प्रतिक्रियाओं के विभिन्न प्रयोगों की प्रत्यक्ष तुलना, सामान्य रूप में हाल ही में 6 दिखाया अनुमति देता है. इसके अलावा में Astroglial धाराओं बहुत मज़बूती से उत्तेजक संचरण में परिवर्तन की निगरानी कर सकते हैं, के रूप में कुल synaptically पैदा astroglial वर्तमान linearly में वृद्धि fEPSP (चित्रा 2E) इस प्रकार है. Astroglial धाराओं भी अल्पकालिक synaptic plasticity प्रतिबिंबित करती हैं, क्योंकि वे बताते हैं, न्यूरॉन्स के रूप में रखा नाड़ी सरलीकरण (चित्रा 2 एफ). बनती एक CA1 पिरामिड सेल और एक astrocyte के पूरे सेल रिकॉर्डिंग depolarizing नाड़ी के जवाब में न्यूरॉन प्रदर्शन कार्रवाई की क्षमता के बाद से दोनों प्रकार के सेल में बहुत अलग electrophysiological व्यवहार, पता चलता है,जबकि पड़ोसी astrocyte चुप है (चित्रा 3A-B). हालांकि, Schaffer collaterals के उदारवादी उत्तेजना के साथ एक तेजी से CA1 पिरामिड सेल और आसन्न astrocyte (3B चित्रा 2) में एक तेजी से जावक और धीमी गति से आवक धाराओं में उत्तेजक posynaptic संभावित पैदा कर सकते हैं. दोहरी synaptically पैदा neuronal और astroglial प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग भी हिप्पोकैम्पस के CA3 क्षेत्र में दर्ज किया जा सकता है, के रूप में चित्र 3C में दिखाया गया. दरअसल, CA3 काई से भरा फाइबर की एक उत्तेजना बेसल परिस्थितियों में बहुत छोटे neuronal प्रतिक्रिया, स्थानीय fEPSPs, छोटे astrocytes में तेजी जावक और धीमी गति से आवक धाराओं (चित्रा 1 3 डी) के लिए जुड़े के रूप में दर्ज की गई उदाहरण भी देते हैं. इसके विपरीत, 1 हर्ट्ज उत्तेजना कुछ सेकंड के लिए CA3 काई से भरा फाइबर की दृढ़ता fEPSP potentiates, जबकि यह केवल मामूली astroglial प्रतिक्रिया (चित्रा 2 3 डी) बढ़ जाती है.
1. हिप्पोकैंपस अलगाव चित्रा आड़ा स्लाइस तैयार. मस्तिष्क टुकड़े करना, midline (क) के साथ छोटा डाँड़ में कटौती. घ्राण बल्ब (ख) के स्तर पर और बाद में सेरिबैलम (ग) के स्तर पर एक राज्याभिषेक कटौती. ध्यान से एक संदंश (घ) की मदद से छोटा डाँड़ निकालने के लिए, दो गोलार्द्धों एक ब्लेड (ई) के साथ अलग, और उन्हें ठंड oxygenated ACSF (च) में एक छोटा चम्मच पर स्थानांतरित. ~ 5 मिनट संतुलन के बाद, सूखी ऊतक पर ऊपर औसत दर्जे का सतह (छ) के साथ एक गोलार्द्ध जगह है. दो चम्मच की मदद के साथ diencephalon (HJ) को हटा दें. हिप्पोकैम्पस अब दिख रहा है, के रूप में धराशायी लाइनों (कश्मीर) द्वारा सचित्र. एक चम्मच के साथ हिप्पोकैम्पस काटना, झल्लरी से शुरू, सफेद संरचना (एल एम) के रूप में दिखाई देता है. ठंड ACSF में हिप्पोकैम्पस वापस स्थानांतरण. एक छोटे agarose ब्लॉक, नाली पक्ष के साथ दो hippocampi स्थिति और उदर hippocamp तैयारहमें अगर ब्लॉक के किनारे का सामना करना पड़ रहा है, और ध्यान से सभी तरल दूर सोख अगर (एन) के लिए एक अच्छा लगाव की अनुमति. गोंद हिप्पोकैम्पस उदर भाग (ओ) पर अगर ब्लॉक करने के लिए जुड़ा हुआ है.
चित्रा 2 युगपत neuronal और astroglial हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में पैदा synaptically प्रतिक्रियाओं. ए) hippocampal टुकड़ा उत्तेजक इलेक्ट्रोड की व्यवस्था illustrating, Schaffer (SC) collaterals, पैच विंदुक इलेक्ट्रोड, को सक्रिय करने के लिए astrocytic धाराओं रिकॉर्ड, और बाह्य इलेक्ट्रोड, योजना fEPSP रिकॉर्ड करने के लिए, hippocampal में अनुसूचित जाति उत्तेजना के द्वारा पैदा की CA1 क्षेत्र. बी) के प्रतिनिधि fEPSPs के युगपत रिकॉर्डिंग (ऊपरी पैनल) और अनुसूचित जाति में उत्तेजना presenc द्वारा पैदा synaptically astrocytic धाराओं (कम पैनल) निशानऔषधीय दवाओं के ई. प्रतिक्रियाएं पहले एक उत्तेजक प्रतिक्रियाओं को अलग करने के लिए एक रिसेप्टर (picrotoxin, 100 सुक्ष्ममापी, काले निशान) अवरोधक GABA की उपस्थिति में दर्ज कर रहे हैं. एक ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर अवरोधक (kynurenic एसिड, 5 मिमी, काले भूरे रंग के निशान) के बाद आवेदन, fEPSP और लंबे समय तक चलने वाले astroglial वर्तमान का प्रमुख हिस्सा रोकता है, एक छोटे और तेज astrocytic वर्तमान प्रतिक्रिया के क्षणिक घटक है, जो है अनमास्किंग एक ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर अवरोधक (TBOA, 200 सुक्ष्ममापी, हल्के भूरे रंग के निशान) के प्रति संवेदनशील है. स्केल बार, 0.1 mV fEPSP, astrocytic वर्तमान देहात 15, 10 मिसे. सी) 1. Astroglial वर्तमान पोटेशियम (1-2), जो वर्तमान kynurenic एसिड (2) में कुल वर्तमान से शेष घटक subtracting द्वारा पैदा की प्रतिक्रिया, बी (कम पैनल, काले ट्रेस) में दिखाया गया है, से अलग किया जा सकता है का नमूना ट्रेस ( ) 1. स्केल बार, देहात 20, 1 सेकंड. 2 सी) ग्लूटामेट वर्तमान ट्रांसपोर्टर (2-3), TBOA मैं के घटाव द्वारा प्राप्त की नमूना ट्रेसkynurenic एसिड (2) में वर्तमान से nsensitive धीमी घटक (3). स्केल बार, 2.5 देहात, 25 मिसे. डी) नमूना एक आवक वर्तमान के निशान (कम पैनल) वोल्टेज दबाना और इसी झिल्ली (ऊपरी पैनल) वर्तमान दबाना SC उत्तेजना द्वारा एक astrocyte में प्रेरित में दर्ज विध्रुवण में दर्ज की गई. स्केल बार, 1.5 एमवी, वोल्टेज दबाना PA 5, 1 सेकंड वर्तमान दबाना. ई) इनपुट, आउटपुट presynaptic फाइबर (इनपुट) गलौज और कुल astroglial वर्तमान (उत्पादन) के बीच संबंध illustrating घटता SC (n 6 =) उत्तेजना के जवाब में एक साथ दर्ज की गई. बढ़ फाइबर गलौज के साथ रैखिक astroglial वर्तमान neuronal fEPSP के रूप में बढ़ जाती है. एफ) neuronal (fEPSP) प्रतिक्रिया और astrocytic वर्तमान का नमूना निशान बनती नाड़ी उत्तेजना के लिए एक 40 मिसे interpulse अंतराल पर दिखाए जाते हैं. synaptically पैदा astroglial वर्तमान प्रदर्शन, न्यूरॉन्स, सुविधा बनती नाड़ी की तरह. स्केल बार, 0.1 mV, PA 5, 20 मिसे.
चित्रा 3 हिप्पोकैम्पस की CA1 और CA3 क्षेत्रों में synaptically प्रेरित neuronal और astroglial प्रतिक्रियाओं की दोहरी रिकॉर्डिंग. ए) एक CA1 पिरामिड साथ sulforhodamine - बी (लाल, 0.1%) और एक fluorescein dextran (हरा, 0.1%) से भरा है, पूरे सेल पैच - दबाना तकनीक का उपयोग astrocyte इंजेक्शन सेल के पुनर्निर्माण. स्केल बार, 10 सुक्ष्ममापी. 1 बी) झिल्ली एक CA1 पिरामिड सेल और एक आसन्न astrocyte से वर्तमान दबाना में दर्ज क्षमता के साथ - साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि बताते हैं. Neuronal कार्रवाई संभावित फायरिंग (काले ट्रेस), एक 20 वर्तमान नाड़ी depolarizing पीए के इंजेक्शन के द्वारा पैदा की, आसन्न astrocyte ग्रे (ट्रेस) में कोई प्रतिक्रिया उदाहरण भी देते हैं. स्केल बार, 20 mV, देहात 10, 100 मिसे. 2 बी) वर्तमान क्लैम में एक CA1 पिरामिड सेल की दोहरी पूरे सेल रिकॉर्डिंग का नमूना निशान(100 सुक्ष्ममापी) picrotoxin की उपस्थिति में अनुसूचित जाति उत्तेजना के बाद पी और वोल्टेज दबाना में पड़ोसी astrocyte. SC उत्तेजना एक उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी संभावित (EPSP, काले ट्रेस), एक छोटे और लंबे समय तक चलने वाले मौजूदा astrocytic ग्रे (ट्रेस) जुड़े उदाहरण भी देते हैं. स्केल बार, 5 एमवी, देहात 10, 100 मिसे. सी) hippocampal टुकड़ा की योजना दांतेदार गाइरस (डीजी) और CA3 उत्तेजक इलेक्ट्रोड की व्यवस्था के क्षेत्रों में चित्रण करने के लिए काई से भरा फाइबर, पैच विंदुक इलेक्ट्रोड (ग्रे), लिए astrocytic धाराओं रिकॉर्ड, और बाह्य इलेक्ट्रोड, सक्रिय रिकॉर्ड fEPSP, CA3 काई से भरा फाइबर उत्तेजना के द्वारा पैदा की. डी, ई) CA3 fEPSPs की बनती रिकॉर्डिंग (ऊपरी पैनलों, 1 डी और 2 डी में काला निशान) और astrocytic पूरे सेल (कम पैनलों, 1 डी और 2 डी में भूरे रंग के निशान) CA3 काई से भरा एक उत्तेजना प्रतिक्रियाओं के प्रतिनिधि निशान हर्ट्ज 0.02 (इनसेट में ज़ूम) (1 डी) या 1 हर्ट्ज उत्तेजना आवृत्ति (2 डी) में फाइबर. विकास के लिए स्केल पट्टी
Discussion
Synaptically प्रेरित neuronal और glial प्रतिक्रियाओं की दोहरी रिकॉर्डिंग - पूर्व और postsynaptic astroglial गुणों में परिवर्तन करने के लिए संबंधित गतिविधियों में परिवर्तन ऑनलाइन अध्ययन के लिए एक उपयोगी तरीका है. synaptically पैदा glial झिल्ली विध्रुवण कोशिकी पोटेशियम वृद्धि 8, presynaptic कार्रवाई संभावित फायरिंग हिस्सा कारण है, लेकिन ज्यादातर postsynaptic 7 विध्रुवण का एक सीधा उपाय है. Glial झिल्ली क्षमता गतिशीलता की रिकॉर्डिंग करने के लिए इसलिए प्रीसानेप्टिक excitability में संशोधन, postsynaptic गतिविधि, बाह्य अंतरिक्ष की मात्रा और पोटेशियम buffering के क्षमता 6, 8 की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. astroglial ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर वर्तमान presynaptic ग्लूटामेट रिलीज के एक संवेदनशील उपाय, रिहाई संभावना 3 में अल्पकालिक परिवर्तन, 5, 9 की निगरानी करने में सक्षम है. यह इसके अलावा synapses पर अलग या विभिन्न विकासात्मक सेंट कार्यात्मक synapse glia बातचीत विशेषताएँ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है10 उम्र. यह उल्लेख किया है कि GLTS अत्यधिक संवेदनशील तापमान 11 और Na + K + और एच 12 के विद्युत ढाल द्वारा संचालित कर रहे हैं चाहिए. इस प्रकार और GLT वर्तमान के आयाम कैनेटीक्स अत्यधिक चुना प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करते हैं. इसके अलावा, astroglial ग्लूटामेट दर्ज GLT वर्तमान से प्राप्त निकासी की वास्तविक समय पाठ्यक्रम के लिए आंशिक रूप से छिप जाना जाता है. यह astrocytes के इलेक्ट्रोटोनिक गुण या अतुल्यकालिक ट्रांसमीटर रिहाई, जो उनके कैनेटीक्स 13 बिगाड़ना के रूप में इस तरह के कारकों द्वारा GLT धाराओं के फिल्टर के कारण है. फ़िल्टरिंग तंत्र के अस्थायी सुविधाओं निकालने के तरीके विकसित किया गया है और शारीरिक या रोग स्थितियों में वास्तविक ग्लूटामेट निकासी समय पाठ्यक्रम प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में recenly 6,13,14 प्रदर्शन. इसके अतिरिक्त, astroglial झिल्ली विध्रुवण की एक साथ रिकॉर्डिंग, वर्तमान दबाना में insig प्रदान कर सकते हैंकोशिकी पोटेशियम यात्रियों के संभव परिवर्तन में hts. एकल astrocytes ~ 100 विभिन्न न्यूरॉन्स की 100.000 synapses संपर्क करें, और इसलिए एकीकृत और स्थानीय neuronal नेटवर्क की गतिविधि मिलाना.
जब तकनीक का उपयोग कर यहाँ प्रस्तुत है, यानी astrocytes से रिकॉर्डिंग electrophysiological पूरे सेल प्रतिक्रियाओं बेसल synaptic गतिविधि में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, एक ध्यान में रखना है कि astrocytes में, सोम स्तर पर पैच - दबाना रिकॉर्डिंग का पता लगाने धाराओं ज्यादातर सेल सोम से उद्भव की अनुमति चाहिए या समीपस्थ प्रक्रियाओं. दरअसल, सोमा में पता चला धाराओं केवल आंशिक रूप से ठीक डिस्टल प्रक्रियाओं से उत्पन्न जब रिसेप्टर्स और कई ठीक प्रक्रियाओं में होने वाली चैनल की एक मजबूत सक्रियण सेल सोमा प्रचार धाराओं उत्पन्न कर सकते हैं. इस प्रकार बेसल और व्यक्तिगत छोटे astroglial synaptic डिब्बों को कवर करने की प्रक्रिया में चैनल गतिविधि रिसेप्टर शायद ही detectable है. इस भाग में सीमित करने के लिए कारण है विवादझिल्ली में सीटू astrocytes से पूरे सेल पैच - दबाना रिकॉर्डिंग और धाराओं voltages के ial और अस्थायी नियंत्रण. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रचुर मात्रा छोटे astrocytic प्रक्रियाओं की सतह सोमा और मुख्य प्रक्रियाओं की झिल्ली क्षेत्र द्वारा दूर से अधिक करना चाहिए. इसके अलावा, इन perisynaptic astroglial microdomains कार्यात्मक प्रासंगिक रिसेप्टर्स और चैनल, है जो की संभावना neuroglial संचार और synaptic विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा होते हैं. तकनीक हम यहाँ प्रस्तुत इसलिए ज्यादातर neuronal ensembles से तुल्यकालिक गतिविधि के astrocytic एकीकरण का अध्ययन, afference उत्तेजना के दौरान विशेष रूप से होने वाली उपयोगी है. यह व्यक्तिगत synapses और आसन्न ठीक astrocytic बेसल सहज गतिविधि के दौरान होने वाली प्रक्रियाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए. स्थानीय astroglial बेसल synaptic गतिविधि से प्रेरित प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक विधि ठीक प्रक्रियाओं से पैच - दबाना रिकॉर्डिंग करने के लिए हो सकता है, के रूप में डीdendrites में 15. हालांकि ये ठीक astroglial प्रक्रियाओं पट्टी की संभावना उनके छोटे आकार की वजह से चुनौती दे रहा है, यह शायद अधिक astroglial microdomains और व्यक्तिगत synapses के बीच अंतरंग संवाद सुलझाना पीछा के लिए एक अवसर है. हालांकि, संभावना छोटे electrophysiological astroglial व्यक्ति ठीक astroglial प्रक्रियाओं से उत्पन्न प्रतिक्रियाओं सीमा का पता लगाने के नीचे हो सकता है, के बाद से बिजली के शोर पैच - दबाना रिकॉर्डिंग औसत 3-5 देहात में पहुंचता है. एक अन्य विधि synaptic गतिविधि astroglial प्रतिक्रियाओं का अध्ययन कैल्शियम इमेजिंग है, क्योंकि neuroactive पदार्थों से astrocytic झिल्ली रिसेप्टर्स ट्रांसपोर्टरों सक्रियण intracellular कैल्शियम यात्रियों को गति प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, कैल्शियम संकेतक के साथ astrocytes के थोक लदान भी मुख्य रूप से दैहिक 16 गतिविधि प्रतिबिंबित कर सकते हैं. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम इमेजिंग का संयोजन भी ठीक astroglial प्रक्रियाओं से छोटे कैल्शियम संकेतों का पता लगाने में सक्षम बनाता है, या तो अनायास होने वाली या ट्रिगर खy न्यूनतम synaptic 17 उत्तेजना, 18. हालांकि, एक ध्यान में रखना है कि उच्च आत्मीयता कैल्शियम संकेतकों कैल्शियम buffers, बाधा महत्वपूर्ण कैल्शियम संकेत दे रास्ते की तरह अधिनियम, है जबकि कम आत्मीयता संकेतक का पता लगाने के स्तर से नीचे काम हो सकता है चाहिए. अंत में, एक सुंदर और गैर इनवेसिव कैल्शियम घटनाओं, ठीक astrocytic प्रक्रिया में है, जो भी पूरे सेल पैच दबाना दौरान intracellular संकेतन अणुओं की वार्शआउट circumvents अध्ययन तकनीक झिल्ली लक्षित कैल्शियम सेंसर है जो astrocytes में व्यक्त किया जा सकता है का उपयोग कर में होते हैं में सीटू, के रूप में अच्छी तरह के रूप में 19 vivo में. हालांकि, कैल्शियम इमेजिंग केवल एक संकेत अणु है, जो कई में शामिल है, लेकिन नहीं सभी सेलुलर गतिविधियों के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जबकि पूरे सेल पैच दबाना सब अलग अलग ईओण चैनल और रिसेप्टर सक्रियण पर चालू धाराओं के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है. न्यूरॉन्स और astrocytes से इसलिए युगपत electrophysiological रिकॉर्डिंगएक अद्वितीय और शक्तिशाली विधि ऑनलाइन neuroglial ईओण संकेतन और अपनी भूमिका मस्तिष्क सूचना संसाधन की गतिशीलता को सुलझाना.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए तस्वीरें और आवाज पर वीडियो के बाद उत्पादन के लिए दाना Kamalidenova, मॉर्गन Autexier, और रोच Chopier, जो वीडियो और एनिमेशन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फ्लोरियन बेक का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम के लिए ओलिंप द्वारा प्रायोजित किया गया था और (कैरियर विकास पुरस्कार) HFSPO, ANR (कार्यक्रम Jeunes chercheurs और कार्यक्रम ब्लांक न्यूरोसाइंसेस), FRC (फेडरेशन डालना ला Recherche sur le Cerveau), INSERM और ला Pitie Salpêtrière अस्पताल (translational अनुसंधान से अनुदान द्वारा समर्थित एनआर) अनुबंध, फ्रेंच अनुसंधान मंत्रालय और ड्यूश Forschungsgemeinschaft postdoc फैलोशिप से उत्तर प्रदेश, और डॉक्टरेट स्कूल "जीवन विज्ञान में फ्रंटियर्स" से पेरिस Diderot विश्वविद्यालय, Bettencourt Schuller नींव, और एफ आर (Fondation डालना ला Recherche MEDICALE) जेएस डॉक्टरल फेलोशिप
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
- Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
- Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
- Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
- Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
- Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
- Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
- Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).
