Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Summary

Fremstillingen af ​​akutte hjerneskiver fra isolerede hippocampi samt de samtidige elektrofysiologiske optagelser af astrocytter og neuroner i

Abstract

Astrocytter danner sammen med neuroner treparts synapser, hvor de integrerer og modulerer neuronal aktivitet. Faktisk astrocytter fornemmer neuronale input gennem aktivering af deres ionkanaler og neurotransmitterreceptorer, og bearbejde information dels gennem aktivitet-afhængig frigivelse af gliotransmitters. Endvidere astrocytter udgør det vigtigste optagelsessystem for glutamat, bidrager til kalium rumlig bufferlagring, samt GABA clearance. Disse celler derfor hele tiden overvåge synaptisk aktivitet, og dermed er følsomme indikatorer for ændringer i synaptisk udgivet glutamat, GABA og ekstracellulære kalium niveauer. Derudover kan ændringer i astroglial optagelse aktivitet eller bufferkapacitet har alvorlige virkninger på neuronale funktioner, og kan blive overset, når kendetegnende fysiopatologiske situationer eller knockout mus. Dobbelt optagelse af neuronale og astroglial aktiviteter er derfor en vigtig metode til at studere ændringer isynaptisk styrke af at dermed forbundne ændring af astroglial optagelse og buffermidler kapacitet. Her beskriver vi, hvordan du forbereder hippocampusskiver, hvordan man identificerer stratum radiatum astrocytter, og hvordan du optager samtidigt neuronale og astroglial elektrofysiologiske svar. Desuden beskriver vi, hvordan du isolerer farmakologisk de synaptisk-fremkaldte astrogliale strømme.

Protocol

1. Fremstilling af kunstig cerebrospinalvæske og intracellulære opløsning

1. Før start af forsøget, skal en til fremstilling af den indre opløsning for patch-clamp-optagelser, samt kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) i hippocampus præparatet. Du vil endvidere have en dissektion kit bestående af kirurgisk saks og fine iris saks, to spatler og pincetter (Fine Science Tools), et glas gasning enhed (micro-filter stearinlys, Robus Tyskland) og væv gitter (myggenet eller nylon stram), og superlim (Uhu Dent). Konfigurationen af elektrofysiologi skive patch setup blev beskrevet af Finkel & Bookman, 2001 ^1.
2. Til den indre opløsning, opløses (i mM): 105 K-gluconat, 30 KCI, 10 HEPES og 0,3 EGTA i deioniseret vand (i 70-80% af det endelige volumen). Opløsningen afkøles til 4 ° C og der tilsættes (i mM): 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Tris og 10 phosphocreatin. PH justeres til 7,4 med KOH og fyld up med deioniseret vand til slutvolumenet. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtreres denne opløsning (porestørrelse 0,2 pm). Alikvoteret opløsning er stabil i 3-4 uger ved - 20 ° C. For en forsøgsdag bliver ~ 1 ml intern opløsning nødvendig.
3. Medmindre andet er angivet, den ACSF anvendes til hippocampus forberedelse og optagelser af celler i CA1-region, indeholder (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 _CaCl2, 1,3 _MgSO4, 1 NaH _{2 PO4,} 26,2 _NaHCO3 og 11 glucose. Opløses disse salte i deioniseret vand (Osmolaritet ~ 320 mOsm) og oxygenat denne opløsning i mindst 10 min (pH ~ 7,3 til 7,4) med carbogen _(95% O2 og _5% CO2). Forbered mindst 1 liter opløsning per eksperiment. Især bør det tages til fremstilling af hippocampalt væv, der skal bruges til at udføre forsøg i CA3-regionen af ​​hippocampus. Faktisk har denne region er tilbøjelig til epileptiform aktivitet og efterfølgende neuronal død. Således synaptic-aktivitet bør kraftigt reduceret under skive tilberedning, og dette opnås ved at udføre hippocampus dissektion i iskold saccharoseopløsning indeholdende (i mM): 87 NaCI, 2,5 KCI, 0,5 _CaCl2, 7 _MgCl2, 1 NaH _{2 PO4} , 25 _NaHCO3, 10 Glucose og 75 Saccharose. I denne løsning massivt kombinationen af ​​lavt natriumindhold, lavt calcium og høje magnesiumkoncentrationer reducerer præsynaptiske aktivering og frigivelse sandsynlighed samt postsynaptiske NMDA-receptor-aktivitet, hvilket minimerer spontan aktivitet og celledød. De tilberedte hippocampusskiver, der anvendes til optagelser af celler fra CA3 region er perfunderes med modificeret ACSF indeholdende 4 _mM CaCl2 og 4 _MgSO4, for at minimere polysynaptiske aktivitet.

2. Akut hippocampalt snit Preparation

1. Cool down ~ 300 ml ACSF til udskæring kammeret, samt til fremstilling ved 4 ° C, under konstant oxygenating medcarbogen. Udarbejde et lille bægerglas med ACSF ved stuetemperatur (RT) i udsnit oplagring, som også iltet med carbogen (skema figur 1).
2. Bedøve musen i et stinkskab med en lille papirhåndklæde vædet med 1 ml isofluran, der tilsættes ind i buret.
3. Efter musen er dybt bedøvet, skære hovedet af og tilføje det direkte ind i en lille skål med iskold oxygeneret ACSF. Fjern hovedbunden med en lille saks og overføre hovedet til væv for efterfølgende trin. Begynder at dissekere hippocampus som vist og beskrevet i figur 1..
4. Skåret 300-400 um tykke tværgående skiver ved lav hastighed (3 um / sek) og vibrationsfrekvens på 70 Hz i iskold oxygeneret ACSF, og overføre dem til et lagerkammer. Lad skiver hvile ved stuetemperatur i mindst 1 time før optagelse. Skiver til CA3 eksperimenter lagres 25 min ved 34 ° C og mindst 30 min ved stuetemperatur, for at komme sig efter udskæring proces.
3. Dual Optagelse af Evoked astrogliale Currents og neuronal feltpotentialer

Vi her beskrive, hvordan du indspiller synaptisk-fremkaldte astrogliale og neuronale reaktioner, dvs reaktioner induceret af synapse aktivering via afference stimulation ved hjælp af en ekstracellulær elektrode.

1. Konstant perfundere optagelsen kammer med oxygeneret ACSF (1,5-2 ml / min, RT), der indeholder 100 uM picrotoxin _{(GABAA-antagonist)} at isolere excitatoriske reaktioner. Overføre en skive på en poly-L-lysin (1,5 til 3 mg / ml) overtrukket dækglas, suge væsken at opnå en god skive adhæsion og en dråbe ASCF oven på skiven. Placere dækglasset i registreringskammer. Blokade af hæmmende transmission af picrotoxin kan resultere i epileptiform aktivitet, dvs spontan, synkron affyring af neuronale populationer, som vil forvride måling af fremkaldte begivenheder. For således at undgå epileptiform aktivitet, gøre enfladt snit (kun overfladen) mellem de CA1 og CA3 regioner for at forhindre udbredelsen via Schaffer soeskende (som vist i figur 2a).
2. Stratum radiatum astrocytter kan identificeres ved deres lille soma størrelse (~ 10 um) og stjerneformet proces samling. Vælge en celle mindst 20-30 um under skive overflade. Montere et glas stimulationselektrode (tip resistens ~ 1 MQ) på sølvtråd, der er forbundet med stimulus isolation boksen og jordforbundet til badet (simpelthen ved at vikle den anden sølvtråd omkring glaspipette). Anbring stimulationselektrode i Schaffer sikkerhed regionen, som indikeret i figur 2A i en afstand på 200-300 um væk fra den valgte astrocyt. Montere feltet elektrode (~ 2-5 MOhm) på et chloreret sølvtråd forbundet til hovedtrin af forstærkeren. Begge elektroder er fyldt før med ACSF. Vælg i Multiklemmen den tilstand I = 0, hvilket deaktiverer ekstern comefterspørgsel indgang og placere elektroden ~ 50 um væk fra astrocyt ind i stratum radiatum region (figur 2A). Optag svarene med Gain 2 til 10 og filter med en 2 kHz Bessel-filter. Elektrisk strøm indsprøjtning i hjernen skive udløser aktionspotentialer i de omkringliggende Schaffer sikkerhedsstillelse axoner og efterfølgende sender frigivelse ved de præsynaptiske terminaler dette projekt til postsynaptiske CA1 pyramideformede neuroner. De frigivne transmittere udløser en positiv ladning strømme ind i cellerne via postsynaptiske ionotropiske receptorer, der kan måles ekstracellulært som et lille negativt potentiale. Dette felt excitatorisk postsynaptisk potentiale (fEPSP) integrerer aktiviteten af ​​en gruppe af samtidigt aktive neuroner, mens inhiberende transmission blokeres farmakologisk. Anvende nogle testimpulserne (0,1 ms varighed) for at fremkalde en fEPSP, nogle repositionering af stimulation elektroden kan bidrage til at øge fEPSP. En typisk CA1 stratum Radiatum fEPSP er illustreret i figur 2B. Yderligere oplysninger om positionering og svar bølgeformer kan findes i Yuan et al. 2003 ^2. Den fEPSP amplitude i en sund hippocampalt snit bør normalt være mere end dobbelt så stor som amplituden af ​​fiber volley. For nøjagtig kvantificering af fEPSP amplitude eller hældning, bør den fremkaldte reponse være monosynaptiske, som polysynaptiske aktivitet (påviselig som en multi-maksimal respons) indikerer synaptisk aktivitet uafhængigt af elektrisk stimulering, hvilket kan være et tegn for hyperexcitabilitet. For forsøg udført i CA3-regionen af hippocampus, er stimulering og registrering af pipetter anbragt som vist i figur 3C. Til klart at identificere mosbegroet fiber input, som er stærkt fremme, parret-puls stimulation (50 msek interpulse interval) og 1 Hz stimulation for et par sekunder påføres massivt øge oprindeligt lave amplitude fremkaldt fEPSP responses.At endenaf eksperimentet, DCGIV, en mGluR2 / 3-receptorantagonist, kan vaskes i for yderligere at verificere, at faktisk mosbegroet fiber input blev stimuleret. Anvendelse af denne antagonist bør reducere fEPSP med ~ 90% på grund af høj ekspression af mGluR2 / 3 receptorer, hæmme præsynaptiske frigivelse fra mosbegroet fiber boutons.
3. Fyld en patch pipette (~ 2-5 MOhm) med filtreret intern løsning og montere det på en chloreret sølvtråd forbundet med den anden hovedtrin, anvende positivt tryk med en sprøjte, som er forbundet via en slange til din pipette indehaveren. Konstant anvende en 20 msek test puls på 10 mV og flytte pipetten ind i vævet, indtil du når celleoverfladen og en afbøjning i membranen bliver synlig. Nulstille offset pipette til at fjerne det positive tryk, og fastgør membranen til - 80 mV. Vent et gigaseal (mindst 1 GQ) er nået (det bør ikke tage mere end nogle få sekunder). Skånsom anvendelse af en vis negativ pres kan bidrage til at nå agigaseal. Bryde ind i cellen opnås ved en kort påføring af negativt tryk eller ved hjælp af zap funktion i Multiklemmen. Start samtidig optagelse af Schaffer sikkerhedsstillelse fremkaldte fEPSP og den astroglial reaktion i spænding clamp (Vhold - 80 mV; frekvens 0,1 Hz, Bessel filter 2 kHz, forstærkning 10). Den astroglial nuværende reaktion er bifasisk: For det første vil du se en hurtig transient udadgående strøm, hvilket afspejler fEPSPs genereret af tilstødende pyramideformede celler. Dette efterfølges af en let stigende og henfaldende indadgående strøm (vedvarende adskillige sekunder (> 10 sec) efter afslutning af neuronale reaktioner). Denne strøm er hovedsagelig skyldes kalium indrejse i astrocytter, efter frigivelse ved omgivende depolariserede postsynaptiske terminaler. En aktiveret samtidig hurtig transient glutamat transporter strøm (GLT), udløst af præsynaptiske glutamatfrigivelse er maskeret af kalium strøm. Den holdepotentiale af astrocyt, samt adgang modstand af plastret bør være monitored hele forsøget, og de bør ikke variere mere end ~ 20%, for at undgå unøjagtig overvågning af astrogliale Réponses grund af ændringer i optageforholdene. Kun astrocytter med en oprindelige bedrift potentiale> -70 mV bør undersøges for at studere raske celler.
4. Skift fra spænding til strøm-clamp for at registrere den fremkaldte astrocytisk membrandepolarisering. Isoler glial glutamat transportøren (GLT) strøm ved perfusion af ionotropisk glutamatreceptor blokker kynurensyre (5 mM), indtil fEPSP fuldstændig blokeres, og GLT amplitude har nået et plateau. Til klart at identificere den GLT strøm, anvende den særlige antagonist DL-threo-β-Benzyloxyaspartatic syre (DL-TBOA, 200 uM). Øge stimulering udtrykt i 2-fold til 5-fold at optage neuronale og astroglial reaktioner ved forskellige synaptiske styrke og anvende to tætliggende stimuli (50 msek interval) at undersøge responser på parret puls stimulation. Stabilitet af series resistance og membranpotentiale af gliacelle bør overvåges under hele optagelsen.
5. At visualisere omfanget af gap junction medieret astrogliale net, bør farvestof-kobling forsøg udføres i strømtang tilstand, uden strøminjektion, så passiv diffusion af lavmolekylære farvestoffer (<1,5 kDa), såsom sulforhodamin-B, via gap junction kanaler. For at minimere farvestof afsmitning til det omgivende væv, bør positivt tryk påføres gennem patch-pipette netop når ind i vævet og plastret bør indgås så hurtigt som muligt.

Representative Results

Et repræsentativt samtidig detektering af synaptisk-fremkaldte astrogliale og neuronale reaktioner (fEPSPs) i CA1-området i hippocampus er vist i figur 2 AB. Den fremkaldte astroglial strøm er bifasisk, dvs består af en transient udadgående strøm og en langsomt henfaldende indadgående strøm (> 10 sec) (figur 2B). Den udadgående strøm afspejler den fremkaldte fEPSP, og er blokeret efter hæmning af ionotrope glutamatreceptorer ved kynurensyre (mørk grå spor, 2B) ^3. Størstedelen af den langsomme indadgående strøm afspejler kalium indtræden i astrocyt følgende postsynaptiske depolarisering, da det også er ophævet af kynurensyre, som inhiberer postsynaptiske ionotropiske glutamatreceptor-aktivitet (figur 2B og 2C ₁₎ ^3-6, kendt for at repræsentere den største kilde (80%) af kalium-release ^7. De resterende hastigt stigende end henfaldende indadgående strøm inhiberes af den GLT antagonist DL-TBOA (lysegrå spor, 2B og 2C _2). Post-hoc subtraktion af den resterende langsom strøm i TBOA (lysegrå spor) fra strømmen i kynurensyre (mørkegrå spor) tillader isolering af det rene astroglial glutamat transporter strøm (black trace), som vist i figur 2C _2. Den vedvarende langsomt henfaldende strøm i kynurensyre og TBOA (lysegrå spor, 2B og 2C ₂₎ kan blokeres af TTX (data ikke vist), og afspejler mest sandsynligt akkumulering af ekstracellulære K ⁺ frigives under præsynaptiske afferent fyring ^3. Moderat enkelt stimulering af Schaffer kollateraler inducerer en relativt stor synaptisk-fremkaldte astroglial strøm i forhold til den lille fremkaldt depolarisation indføres i den samme celle (figur 2D). Dette skyldes, atlav membran modstand af astrocytter. Registrering af synaptisk-fremkaldte astrogliale membranpotentiale dynamik, som vist i figur 2D, er et direkte mål af lokale ekstracellulære kaliumniveauet ^8. Normalisering af de fremkaldte astrogliale reaktioner på den underliggende neuronal aktivitet tillader direkte sammenligning af forskellige eksperimenter, som for nylig vist ^6. Astrogliale strømme kan desuden overvåge meget pålideligt ændringer i excitatorisk transmission, da det samlede synaptisk-fremkaldte astroglial strøm følger lineært stigningen i fEPSP (figur 2E). Astrogliale strømme afspejler også kortvarig synaptisk plasticitet, eftersom de viser, som neuroner, parret-puls lettelse (figur 2F). Forbundne helcelle-optagelse af en CA1 pyramidal celle og en astrocyt viser meget forskellige elektrofysiologiske opførsel i begge celletyper, eftersom neuron display aktionspotentialer som reaktion på en depolariserende impuls,mens den tilstødende astrocyt er tavs (figur 3A-B). Imidlertid kan moderat stimulering af Schaffer kollateraler fremkalder samtidigt en hurtig excitatorisk posynaptic potentiale i CA1 pyramidal celle og en hurtig ud-og langsom indadgående strømme i den tilstødende astrocyt (figur 3B _2). Dobbelt optagelser af synaptisk-evoked neuronale og astroglial reaktioner kan også registreres i CA3-området i hippocampus som vist i figur 3C. Faktisk enkelt stimulation af CA3 mosagtige fibre fremkalder i basale betingelser meget små neuronale reaktioner, registreres som lokale fEPSPs, associeret med små hurtige udadgående og langsom indadgående strømme i astrocytter (figur 3D _1). I modsætning hertil stærkt 1 Hz stimulering af CA3 mosagtige fibre i nogle sekunder forstærker fEPSP, mens det kun moderat forøger astroglial respons (figur 3D _2).

Fig. 1. Hippocampus isolering til fremstilling tværgående skiver. At dissekere hjernen, skæres kraniet langs midterlinien (a). Foretag en koronale snit på niveau med lugtekolben (b) og efterfølgende på niveauet for cerebellum (c). Fjern forsigtigt kraniet ved hjælp af en pincet (d), adskille de to halvkugler med en klinge (e), og overføre dem på en lille ske i koldt oxygeneret ACSF (f). Efter ~ 5 min ligevægt, placere en halvkugle på tørt væv med den mediale overflade op (g). Ved hjælp af to skeer fjerne diencephalon (hj). Hippocampus er nu synlig, som illustreret ved de punkterede linier (k). Dissekere hippocampus med en ske ud, startende fra fimbria, synlige i hvidt struktur (lm). Overfør hippocampus tilbage i den kolde ACSF. Forbered en lille agarose-blok, position de to hippocampi med den alveus side op og den ventrale hippocampos mod kanten af ​​agar blokken, og suge omhyggeligt alle væske væk for at tillade en god fastgørelse til agar (n). Lim hippocampus fastgjort til agar blok på den ventrale side (o).

Figur 2. Samtidige neuronale og astroglial responser fremkaldt-synaptisk i CA1-området i hippocampus. A) Scheme af hippocampalt snit viser anbringelsen af ​​den stimulerende elektrode, for at aktivere Schaffer soeskende (SC), patch-pipetten elektroden, for at optage astrocytiske strømme, og det ekstracellulære elektrode, for at optage fEPSP, fremkaldt af SC stimulation i den hippocampale CA1-området. B) Repræsentative spor af samtidige optagelser af fEPSPs (øverste panel) og astrocytiske strømme (nederste panel) fremkaldt-synaptisk af SC stimulering i presence af farmakologiske lægemidler. Svarene første registreres i nærvær af en _{GABAA-receptor} blocker (picrotoxin, 100 uM, sorte spor) at isolere excitatoriske reaktioner. Efterfølgende påføring af en ionotropisk glutamatreceptor blokker (kynurensyre, 5 mM, mørkegrå spor), inhiberer fEPSP og størstedelen af ​​den langvarige astroglial strøm, demaskering en lille og hurtig transient komponent af astrocytisk strømsvar, som er følsom over for en glutamat transportør blokker (TBOA, 200 uM, lys grå spor). Scale bar, fEPSP 0,1 mV, astrocytisk nuværende 15 pA, 10 msek. C _1). Prøve spor af astroglial kaliumstrøm (1-2), som kan isoleres fra den fremkaldte reaktion, er vist i B (nedre felt, black trace), ved at subtrahere den aktuelle komponent forbliver i kynurensyre (2) fra den samlede strøm ( 1). Scale bar, 20 pA, 1 sek. C ₂₎ Prøve spor af glutamat transportøren strøm (2-3), der fås ved subtraktion af TBOA insensitive langsomme bestanddel (3) fra strømmen i kynurensyre (2). Scale bar, 2,5 pA, 25 msek. D) Eksempler spor af en indadgående strøm registreres i spændings-clamp (nedre felt) og den tilsvarende membrandepolarisering optaget i strøm-clamp (øverste panel) fremkaldes hos en astrocyt fra SC stimulation. Scale bar, strøm-clamp 1,5 mV, spænding-clamp 5 Pa, 1 sek. E) Input-output-kurver, der illustrerer forholdet mellem den præsynaptiske fiber flugtninger (input) og den totale astroglial strøm (output) optages samtidigt som reaktion på SC stimulation (n = 6). De astrogliale nuværende stiger lineært med de øgede fiber flugtninger, som den neuronale fEPSP. F) Eksempler spor af den neuronale respons (fEPSP) og astrocytisk strøm er vist for parrede-impuls stimulation ved en 40 msek interpulse interval. De synaptisk-evoked astrogliale aktuelle udstillinger, ligesom neuroner, parret puls lettelse. Scale bar, 0,1 mV, 5 pA, 20 msek.

Figur 3. Dobbelte optagelser af synaptisk-inducerede neuronale og astroglial responser i CA1 og CA3 områder i hippocampus. A) Rekonstruktion af en CA1 pyramidale celler injiceret med sulforhodamin-B (rød, 0,1%) og en astrocyt fyldt med fluorescein dextran (grøn, 0,1%) ved anvendelse af helcelle-patch-clamp-teknik. Scale bar, 10 um. B ₁₎ Repræsentative spor af samtidige helcelle-optagelser af membranpotentialer optaget i strøm-clamp fra en CA1 pyramidal celle og en tilstødende astrocyt. Neuronal virkningspotentiale brænding (black trace), fremkaldt ved injektion af en 20 pA depolariserende strømimpuls, fremkalder ingen reaktion i det tilstødende astrocyt (grå spor). Scale bar, 20 mV, 10 pA, 100 msek. B ₂₎ Prøve spor af dobbelt hel-celle optagelser af en CA1 pyramidal celle i strøm-muslingp og et tilgrænsende astrocyt i spændings-clamp efter SC stimulering i nærvær af picrotoxin (100 uM). SC stimulation fremkalder en excitatorisk postsynaptisk potentiale (EPSP, black trace) forbundet med et mindre og langvarig astrocytisk strøm (grå spor). Scale bar, 5 mV, 10 pA, 100 msek. C) Scheme af hippocampalt snit viser i den tandede gyrus (DG) og CA3 områder indretning af den stimulerende elektrode, for at aktivere mosagtige fibre, patch-pipetten elektrode (grå), at registrere astrocytiske strømme, og den ekstracellulære elektrode, at record fEPSP, fremkaldt af CA3 mosagtige fibre stimulation. D, E) Repræsentative spor af parvise optagelser af CA3 fEPSPs (øverste paneler, sorte spor i D ₁ og D ₂₎ og astrocytiske hel-celle-responser (nederste paneler, grå spor i D ₁ og D ₂₎ til en enkelt stimulering af CA3 mossy fibre ved 0,02 Hz (zoom i den indsatte) (D ₁₎ eller ved 1 Hz stimulation frekvens (D _2). Scale bar for D 2, 0,2 mV, 15 Pa, tid: D ₁ 1 sek, D ₂ 100 msek. Inset Målestokken, 0,1 mV, 100 msek.

Discussion

Dobbelttællinger af synaptisk-induceret neuronal og glial respons er en nyttig metode til at studere online ændringer i præ-og postsynaptiske aktiviteter associeret med ændringer i astrogliale egenskaber. Den synaptisk-fremkaldte glial membrandepolarisering er et direkte mål for det ekstracellulære kalium stigning ^8, dels på grund af præsynaptisk virkningspotentiale fyring, men hovedsagelig til postsynaptiske depolarisering ^7. Derfor optagelser af gliale membranpotentiale dynamik kan anvendes til at undersøge ændringer i præsynaptiske excitabilitet, postsynaptisk aktivitet, ekstracellulære rum volumen og kalium buffermidler kapacitet ^{6, 8.} Den astroglial glutamat transportør strøm er et følsomt mål for præsynaptisk glutamatfrigivelse, kunne overvåge kortsigtede ændringer i release sandsynlighed ^{3, 5, 9.} Det kan endvidere anvendes til at karakterisere de funktionelle synapse-glia interaktioner på forskellige synapser eller på forskellige udviklingsstadier staldre ^10. Det bør fremhæves, at GLTs er meget temperaturfølsomme ¹¹ og er drevet af den elektrokemiske gradient af Na ^+, K ⁺ og H ^+12. Således amplituden og kinetik af GLT strøm stærkt afhængig af de valgte forsøgsbetingelser. Endvidere er den faktiske tidsforløbet af astroglial glutamat clearance afledt fra den indspillede GLT strøm kendt for at være delvist skjult. Dette skyldes filtrering af GLT strømme af faktorer, såsom de electrotonic egenskaber af astrocytter eller det asynkrone transmitterfrigivelse, som forvrider deres kinetik ^13. Fremgangsmåder udvinder de tidsmæssige forhold i filtreringsmekanismer er blevet udviklet og kan anvendes til at udlede den aktuelle glutamat clearance tidsforløb i fysiologiske eller patologiske situationer, som recenly udført ^6,13,14. Derudover samtidig optagelse af astroglial membrandepolarisering i strømtang, kan give insignifikantHTS af mulige ændringer af ekstracellulære kalium transienter. Enkelte astrocytter kontakt op til 100.000 synapser på ~ 100 forskellige neuroner, og lad derfor integrere og modulerer aktiviteten af ​​lokale neurale netværk.

Når du bruger den teknik, der præsenteres her, dvs optagelse elektrofysiologiske hel-celle responser fra astrocytter at få indblik i basal synaptisk aktivitet, bør man huske på, at i astrocytter, patch-clamp optagelser på soma-niveau muligt at konstatere strømme hovedsagelig stammer fra cellen soma eller proksimale processer. Faktisk strømme detekteres ved soma kun delvis stamme fra fine distale processer, når en stærk aktivering af receptorer og kanaler der forekommer i flere fine processer kan generere strømme udbreder sig til den celle soma. Således basal receptoren og kanalaktivitet i individuelle små astrogliale processer omfatter synaptiske rum næppe detekterbar. Dette skyldes til dels begrænsede yngelial og tidsmæssig kontrol af membran strømme og spændinger ved hel-celle patch-clamp optagelser fra astrocytter in situ. Imidlertid skal det bemærkes, at overfladen af ​​de rigelige små astrocytiske processer langt overstiger membranarealet af soma og vigtigste processer. Desuden indeholder disse perisynaptic astrogliale mikrodomæner de funktionelt relevante receptorer og kanaler, hvilket sandsynligvis spiller en vigtig rolle i neuroglial kommunikation og synaptiske regulering. Den teknik, som vi præsenterede her er derfor mest hensigtsmæssigt at undersøge astrocytisk integration af synkron aktivitet fra neuronale ensembler, der forekommer især i afference stimulation. Det bør ikke bruges til at studere dialogen mellem de enkelte synapser og tilstødende fine astrocytiske processer, der opstår under basal spontan aktivitet. En alternativ fremgangsmåde til at studere lokale astrogliale responser induceret af basal synaptisk aktivitet ville være at udføre patch-clamp-optagelser af fine processer, som den i dendritter ^15. Selvom lappe disse fine astrogliale processer sandsynligvis er udfordrende på grund af deres lille størrelse, er det sandsynligvis en avenue til at forfølge at trævle mere intime dialog mellem astrogliale mikrodomæner og individuelle synapser. Dog kan de sandsynlige små elektrofysiologiske astrogliale reaktioner som følge af de enkelte fine astrogliale processer være under tærskelværdien afsløring, da elektrisk støj når i gennemsnit 3-5 pA i patch-clamp optagelser. En anden fremgangsmåde til at studere astrogliale reaktioner på synaptisk aktivitet er calcium imaging, idet aktivering af astrocytiske membranreceptorer eller transportører af neuroaktive stoffer kan udløse intracellulært calcium transienter. Dog kan isætning af astrocytter med calcium indikatorer også afspejler hovedsagelig somatisk aktivitet ^16. Kombinationen af ​​elektrofysiologi og calcium imaging også muligt detektere små calcium signaler fra fine astrogliale processer, enten forekommende spontant eller udløses by minimal synaptisk stimulation ^{17, 18.} Man skal dog huske på, at høj affinitet calcium indikatorer kan fungere som calcium buffere, hæmmer vigtige calcium signaleringsveje, hvorimod lav-affinitet indikatorer kan arbejde under detektionsniveauet. Endelig er en elegant og ikke-invasiv teknik til at undersøge calcium begivenheder i fine astrocytiske processer, som også omgår udvaskning af intracellulære signalmolekyler ved helcelle-patch-clamp, består i anvendelse af en membran målrettet calcium sensor, som kan udtrykkes i astrocytter in situ. såvel som in vivo ¹⁹ Dog kan calcium imaging kun give oplysninger om en signalmolekyle, som er involveret i mange, men ikke alle cellulære aktiviteter, mens hel-celle patch-clamp giver kvantitative oplysninger om alle de forskellige ionstrømme udløses ved kanal og receptor-aktivering. Derfor samtidige elektrofysiologiske optagelser fra neuroner og astrocytterer en unik og stærk metode til at udrede online dynamikken i neuroglial ionisk signalering og dets rolle hjerne informationsbehandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picrotoxin	Sigma	P1675	dissolve in DMSO
Kynurenic Acid	Tocris	0223	dissolve at 34 °C stirring or sonication
DL-TBOA	Tocris	1223	DCG IV Tocris 0975