Summary
De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen in
Abstract
Astrocyten vormen samen met neuronen tripartiete synapsen, waar ze integreren en moduleren neuronale activiteit. Inderdaad, astrocyten voelen neuronale input door activering van hun ionkanalen en neurotransmitter receptoren, en verwerken van informatie voor een deel door middel van de activiteit-afhankelijke afgifte van gliotransmitters. Bovendien astrocyten de belangrijkste opname te vormen voor glutamaat, bijdragen aan kalium ruimtelijke buffering, alsmede GABA klaring. Deze cellen dan ook voortdurend op synaptische activiteit, en zijn daardoor gevoelig indicatoren voor veranderingen in synaptisch uitgebrachte glutamaat, GABA en extracellulaire kalium. Bovendien kunnen veranderingen in astrogliale opname activiteit of buffercapaciteit ernstige effecten op de neuronale functies, en kan het hoofd worden gezien bij het karakteriseren van fysiopathologische situaties of knock-out muizen. Dubbele registratie van neuronale en astrogliale activiteiten is dan ook een belangrijke methode om veranderingen te bestuderen insynaptische kracht geassocieerd met veranderingen in de astrogliale opname en buffering capaciteiten gelijktijdige. Hier beschrijven we hoe u de hippocampus plakjes, hoe stratum radiatum astrocyten te identificeren, en hoe tegelijkertijd neuronale en astrogliale elektrofysiologische respons op te nemen voor te bereiden. Daarnaast beschrijven we hoe u farmacologisch de synaptisch-opgeroepen astrogliale stromingen isoleren.
Protocol
1. Voorbereiding van kunstmatige cerebrospinale vloeistof en intracellulaire oplossing
- Voordat de proef, moet men de interne oplossing bereid voor de patch clamp opnames, evenals de kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voor de bereiding hippocampus. U zal bovendien behoefte aan een dissectie kit bestaande uit chirurgische schaar en fijne iris schaar, twee spatels en een pincet (Fine Science Tools), een glas vergassen apparaat (micro-filter kaars, Robu Duitsland) en weefsel net (klamboe of nylon strak), alsmede superlijm (Uhu Dent). De configuratie van de elektrofysiologie slice patch setup werd door Finkel & Bookman, 2001 1.
- Voor de interne oplossing opgelost (in mM): 105 K-gluconaat, 30 KCl, 10 HEPES en 0,3 EGTA in gedeïoniseerd water (in 70-80% van het uiteindelijke volume). Koel de oplossing tot 4 ° C en voeg (in mM): 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris en 10 creatinefosfaat. Breng de pH op 7,4 met KOH en vul up met gedeïoniseerd water om het eindvolume. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtreer deze oplossing (poriegrootte 0,2 pm). Gealiquoteerd oplossing is 3-4 weken bij - 20 ° C. Voor een experimentele dag, ~ 1 ml interne oplossing nodig.
- Tenzij anders vermeld, de hippocampus ACSF voor bereiding en opnames van cellen in het CA1-gebied bevat (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,3 MgSO4, 1 NaH 2PO 4, 26,2 NaHCO3 en 11 glucose. Deze zouten opgelost in gedeïoniseerd water (~ osmolariteit 320 mOsm) en zuurstof deze oplossing gedurende ten minste 10 min (pH ~ 7,3 tot 7,4) met carbogen (95% O2 en 5% CO2). Bereid ten minste 1 liter oplossing per experiment. Bijzondere zorg moet worden genomen voor de bereiding van hippocampale weefsel dat wordt gebruikt om de experimenten uit te voeren in CA3 gebied van de hippocampus. Inderdaad, deze regio gekenmerkt activiteit en daaropvolgende neuronale dood epileptische. Zo synaptIC activiteit moet sterk worden verminderd tijdens slice voorbereiding, en dit wordt bereikt door het uitvoeren van de hippocampus dissectie in ijskoude sucroseoplossing bevattende (in mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 1 NaH 2PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 en 75 Sucrose Glucose. In deze oplossing, de combinatie van lage natrium, laag calcium en magnesium hoge concentraties massaal verminderen presynaptische vuren en afgifte waarschijnlijkheid evenals postsynaptische NMDA receptor activiteit, dus het minimaliseren van spontane activiteit en celdood. Na bereiding hippocampale plakken voor opnamen van cellen van het CA3 regio geperfundeerd met gemodificeerde ACSF, die 4 mM CaCl 2 en 4 MgSO4, om polysynaptic activiteit te minimaliseren.
2. Acute hippocampus Slice Voorbereiding
- Afkoelen ~ 300 ml van ACSF voor versnijding kamer, alsmede voor de bereiding bij 4 ° C, onder voortdurend zuurstof metcarbogen. Bereid een klein bekerglas met ACSF bij kamertemperatuur (RT) slice opslag, ook met zuurstof carbogen (Schema figuur 1).
- Verdoof de muis onder een kap met een klein papieren handdoek gedrenkt in 1 ml isofluraan die wordt toegevoegd in de kooi.
- Nadat de muis is diep verdoofd, knip de kop eraf en voeg het direct toe in een kleine schotel met ijskoude zuurstofrijk ACSF. Verwijder de hoofdhuid met een kleine schaar en breng het hoofd naar weefsel voor de volgende stappen. Beginnen de hippocampus ontleden, zoals afgebeeld en beschreven in figuur 1.
- Snijd 300-400 pm dikke transversale plakjes lage snelheid (3 um / sec) en trilfrequentie van 70 Hz in ijskoude zuurstof ACSF, en deze overbrengen naar een opslagruimte. Laat de plakjes rusten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur vóór opname. Plakken voor CA3 experimenten opgeslagen 25 min bij 34 ° C en ten minste 30 min bij kamertemperatuur, te herstellen van de snijproces. 3. Dual Recording van Evoked astrogliale Stromen en Neuronale Field Potentials
- Voortdurend perfuseren de opname kamer met ACSF geoxygeneerde (1.5-2 ml / min, RT), dat 100 uM picrotoxin (GABA A antagonist) aan exciterend reacties isoleren. Breng een plak op een poly-L-lysine (1,5 tot 3 mg / ml) bekleed dekglaasje, genieten de vloeistof een goede hechting slice en voeg een druppel ASCF bovenop de slice. Plaats het dekglaasje in de opname kamer. Blokkade van remmende overdracht door picrotoxin kan resulteren in epileptische activiteit, namelijk spontaan synchrone afvuren van neuronale populaties, waarbij de meting van opgewekte gebeurtenissen verstoren. Dus om epileptische activiteit te voorkomen, eenDos (alleen het oppervlak) tussen de CA1 en CA3 gebieden op de voortplantingsrichting via de Schaffer collateralen (zoals in figuur 2a) te voorkomen.
- Stratum radiatum astrocyten kunnen worden geïdentificeerd door hun kleine omvang soma (~ 10 micrometer) en stellatum proces montage. Kies een cel ten minste 20-30 urn onder het oppervlak slice. Monteer een glazen stimulatie-elektrode (tip weerstand ~ 1 MQ) op de zilveren draad die is aangesloten op de stimulus isolatie box en geaard op het bad (eenvoudig door het wikkelen van de tweede zilver draad rond de glazen pipet). Plaats de stimulatie-elektrode in de Schaffer zekerheid regio, zoals aangegeven in figuur 2A op een afstand van 200-300 urn afstand van de gekozen astrocyten. Monteer het gebied registratie-elektrode (~ 2-5 MQ) op een gechloreerd zilverdraad verbonden met de headstage van de versterker. Beide elektroden zijn gevuld voordat met ACSF. Kies in Multiclamp de modus I = 0, wat externe com uitgeschakeldmand ingang en plaats de elektrode ~ 50 urn afstand van de astrocyten in het stratum radiatum gebied (figuur 2A). Noteer de reacties met Gain 2 tot 10 en filter met 2 kHz Bessel filter. Elektrische stroom injectie in de hersenen slice triggers actiepotentialen in de omliggende Schaffer onderpand axonen en de daaropvolgende afgifte van transmitter op de presynaptische terminals dat project aan de postsynaptische CA1 pyramidale neuronen. De vrijgekomen zenders zal leiden tot een positieve lading stroom in de cellen door postsynaptische ionotrope-receptoren, die meetbaar extracellulair als een kleine negatieve potentiaal. Dit veld excitatoire postsynaptische potentiaal (fEPSP) integreert de activiteit van een groep gelijktijdig actief neuronen, terwijl remmende transmissie farmacologisch geblokkeerd. Breng wat stroomstoten (0,1 msec duur) om een fEPSP roepen, sommige herpositionering van de stimulatie-elektrode kunnen helpen om de fEPSP te verhogen. Een typische CA1 stratum Radiatum fEPSP wordt geïllustreerd in figuur 2B. Verdere details over positionering en golfvormen reactie vindt in Yuan et al.. 2003 2. De fEPSP amplitude in een gezonde hippocampus slice moet meestal meer dan tweemaal zo groot als de amplitude van de vezel volley. Voor nauwkeurige kwantificering van fEPSP amplitude of helling moet de opgeroepen respons te monosynaptic als polysynaptic activiteit (detecteerbaar als een multi-piekrespons) geeft synaptische activiteit onafhankelijk van de elektrische stimulatie, wat een teken voor hyperexciteerbaarheid zijn. Voor experimenten in de CA3 gebied van de hippocampus zijn stimulatie als opname pipetten gepositioneerd zoals weergegeven in figuur 3C. Om duidelijk te identificeren mosvezel ingangen, die sterk vergemakkelijken, gekoppeld-puls stimulatie (50 msec interpuls interval) en 1 Hz stimulatie gedurende enkele seconden worden toegepast op massaal verbeteren van de aanvankelijk lage amplitude opgeroepen fEPSP responses.At het eindevan het experiment DCGIV een mGluR2 / 3 receptor antagonist, kan worden gewassen om verder te verifiëren dat inderdaad mosvezel inputs gestimuleerd. De toepassing van deze antagonist moet verminderen de fEPSP met ~ 90% te wijten aan de hoge expressie van mGluR2 / 3 receptoren, remmen presynaptische vrijlating uit mosvezel boutons.
- Vul een patch pipet (~ 2-5 MQ) met interne oplossing gefiltreerd en monteren op een gechloreerde zilverdraad met de tweede headstage toepassen positieve druk met een injectiespuit, die via slangetje om pipethouder. Voortdurend toepassen van een 20 msec testpuls van 10 mV en beweeg de pipet in het weefsel tot aan het celoppervlak en de doorbuiging van het membraan zichtbaar. Nulpuntverschuiving de pipet, verwijder de positieve druk, en klem het membraan naar - 80 mV. Wachten tot een gigaseal (ten minste 1 GΩ) bereikt (het mag niet langer dan enkele seconden). Gentle toepassing van een aantal negatieve druk zou kunnen helpen om ag te bereikenigaseal. Breken in de cel wordt bereikt door een korte toepassing van negatieve druk of met de zap functie Multiclamp. Start de gelijktijdige opname van de Schaffer onderpand opgeroepen fEPSP en de astrogliale respons in spanning klem (Vhold - 80 mV; frequentie 0,1 Hz, Bessel-filter 2 kHz, gain 10). De astrogliale huidige reactie is bifasisch: eerst zul je een snelle voorbijgaande uiterlijke huidige zie, als gevolg van fEPSPs gegenereerd door aangrenzende piramidale cellen. Dit wordt gevolgd door een langzaam stijgende en vervallen binnenwaartse stroom (aanhoudende enkele seconden (> 10 sec) na beëindiging van neuronale reacties). Deze stroom is voornamelijk te wijten aan kalium binnenkomst in astrocyten, na vrijgave door de omliggende gedepolariseerde postsynaptische terminals. Een gelijktijdig geactiveerd snel voorbijgaande glutamaat transporter stroom (GLT), veroorzaakt door presynaptische glutamaat release wordt gemaskeerd door de kalium stroom. De holding potentieel van de astrocyten, en de toegang weerstand van de pleister moet monitored gehele experiment en mag niet meer variëren dan ~ 20%, een onnauwkeurige controle van astrogliale REPONSES door veranderingen in de opnameomstandigheden voorkomen. Alleen astrocyten met een oorspronkelijke bedrijf potentieel> -70 mV moeten worden onderzocht om gezonde cellen te bestuderen.
- Schakelen van voltage-clamp bij lopende om de opgewekte astrocytische membraandepolarisatie nemen. Isoleer de gliale glutamaat transporter (GLT) stroom door perfusie van de ionotrope glutamaat receptor blokker kynurenic zuur (5 mM), totdat de fEPSP volledig geblokkeerd en de GLT amplitude heeft een plateau bereikt. Om duidelijk de GLT stroom, gelden de specifieke antagonist DL-threo-β-Benzyloxyaspartatic zuur (DL-TBOA, 200 uM). Verhoog de stimulatie sterkte 2-voudig tot 5-voudig tot neuronale en astrogliale reacties opnemen met verschillende synaptische sterkte, en twee dicht bij elkaar gelegen stimuli (50 msec interval) toegepast om reacties te onderzoeken gepaarde puls stimulatie. Stabiliteit van de serie rWeerstand en membraanpotentiaal van de gliale cel worden gevolgd gedurende de opname.
- Een beeld van de omvang van de gap-junction gemedieerd astrogliale netwerken moet kleurstof koppeling experimenten worden uitgevoerd in stroomtang modus, zonder stroominjectie, van passieve diffusie van laag moleculaire kleurstoffen (<1,5 kDa), zoals sulforhodamine-B kunnen, door middel van gap junction kanalen. Om kleurstof spillover te minimaliseren in het omliggende weefsel, dient positieve druk worden toegepast door middel van de patch pipet net bij het betreden van het weefsel en de pleister moet zo snel mogelijk worden bereikt.
We beschrijven hier hoe u opnemen astrogliale en neuronale responsen, dwz reacties veroorzaakt door synaps activering door afference stimulatie met behulp van een extracellulaire elektrode synaptisch-opgeroepen.
Representative Results
Een vertegenwoordiger gelijktijdige registratie van synaptisch opgewekte astrogliale en neuronale reacties (fEPSPs) in het CA1 gebied van de hippocampus wordt getoond in figuur 2 AB. De opgewekte stroom is astrogliale bifasisch, dat wil zeggen het bestaat uit een voorbijgaande passieve stroom en een langzaam rottende binnenwaartse stroom (> 10 sec) (Figuur 2B). De uiterlijke huidige weerspiegelt de opgeroepen fEPSP, en wordt geblokkeerd na remming van ionotrope glutamaat receptoren door kynurenic zuur (donkergrijs spoor, Figuur 2B) 3. Het merendeel van de langzame binnenwaartse stroom reflecteert kalium binnenkomst in de astrocyten volgende postsynaptische depolarisatie, aangezien ook afgeschaft door kynurenic zuur dat postsynaptische ionotrope glutamaatreceptor activiteit remt (figuur 2B en figuur 2C 1) 3-6, waarover de belangrijkste vertegenwoordigen bron (80%) kalium release 7. De resterende een snel stijgended rottende binnenwaartse stroom wordt geremd door DL-antagonist GLT TBOA (lichtgrijs trace, figuur 2B en figuur 2C 2). Post-hoc aftrekken van de resterende langzame stroom in TBOA (lichtgrijs trace) van de stroom in kynurenic acid (donkergrijs spoor) kan de isolatie van de pure astrogliale glutamaattransporter stroom (black trace), zoals geïllustreerd in figuur 2C 2. De aanhoudende langzaam rottende stroom in kynurenic zuur en TBOA (lichtgrijs trace, figuur 2B en figuur 2C 2) worden geblokkeerd door TTX (data niet getoond), en weerspiegelt waarschijnlijk de ophoping van extracellulaire K + model in presynaptische afferente bakken 3. Matige enkele stimulering van Schaffer collateralen induceert een relatief grote synaptisch opgewekte stroom astrogliale opzichte van de kleine opgeroepen depolarisatie opgenomen in dezelfde cel (Figuur 2D). Dit komt door delage membraan weerstand van astrocyten. Opname van het synaptisch opgewekte astrogliale membraanpotentiaal dynamiek, zoals geïllustreerd in figuur 2D, is een directe maat van de lokale extracellulaire kalium 8. Normalisering van de opgeroepen astrogliale antwoorden op de onderliggende neuronale activiteit laat een directe vergelijking van verschillende experimenten, zoals onlangs aangetoond 6. Astrogliale stromen kunnen bovendien zeer betrouwbaar bewaken veranderingen in excitatoire transmissie de totale synaptisch opgewekte stroom volgt lineair astrogliale de toename van het fEPSP (figuur 2E). Astrogliale stromen weerspiegelen ook de korte termijn synaptische plasticiteit, omdat ze laten zien, zoals neuronen, gepaarde-pulse facilitatie (figuur 2F). Gepaarde whole-cell opname van een CA1 pyramidale cel en een astrocyt blijkt zeer verschillend gedrag elektrofysiologische in beide celtypes, aangezien de weergave neuron actiepotentialen in antwoord op een depolariserende puls,terwijl de naburige astrocyten zwijgt (figuur 3A-B). Echter, gematigde stimulatie van de Schaffer collateralen tegelijk oproepen snel exciterend posynaptic potentieel in het CA1 pyramidale cel en een snelle en langzame buiten naar binnen stromen in de aangrenzende astrocyten (Figuur 3B 2). Dual opnamen van synaptisch-geïnduceerde neuronale en astrogliale reacties kunnen ook worden opgenomen in de CA3 gebied van de hippocampus, zie figuur 3C. Inderdaad, enkel stimulatie van CA3 bemoste vezels oproept in basale omstandigheden zeer kleine neuronale responsen, opgenomen als lokale fEPSPs, geassocieerd met kleine snelle heen-en langzaam naar binnen stromen in astrocyten (Figuur 3D 1). Daarentegen 1 Hz stimulatie van CA3 mosvezels enkele seconden versterkt sterk de fEPSP, terwijl het slechts matig verhoogt de astrogliale respons (Figuur 3D 2).
Figuur 1. Hippocampus isolement te transversale plakjes bereiden. Naar de hersenen ontleden, snijd de schedel langs de middellijn (a). Een coronale snede ter hoogte van de bulbus olfactorius (b) en vervolgens op het niveau van het cerebellum (c). Voorzichtig de schedel te verwijderen met behulp van een pincet (d), scheidt de twee hersenhelften met een mes (e), en breng ze op een kleine lepel in koud zuurstofrijk ACSF (f). Na 5 min equilibratie ~ Plaats een hemisfeer op droog weefsel de mediale oppervlak tot (g). Met de hulp van twee lepels verwijder het diencephalon (hj). De hippocampus is nu zichtbaar, zoals geïllustreerd door de onderbroken lijnen (k). Ontleden de hippocampus met een lepel uit vanaf de fimbria, zichtbaar als witte structuur (lm). Terug Breng de hippocampus in de koude ACSF. Bereid een kleine agarose-blok, plaats de twee hippocampus met de alveus naar boven en de ventrale hippocampons naar de rand van de agar blok en genieten zorgvuldig alle vloeistof weg een goede hechting laat de agar (n). Lijm de hippocampus aan de agar blok op het ventrale deel (o).
Figuur 2. Gelijktijdige neuronale en astrogliale-synaptisch opgeroepen reacties in het CA1 gebied van de hippocampus. A) Schema van de hippocampus slice illustreert de opstelling van de stimulerende elektrode, de Schaffer collateralen (SC), de patch pipet elektrode activeren astrocytische stromen opnemen en de extracellulaire elektrode aan fEPSP opnemen, opgewekt door stimulatie SC in de hippocampus CA1 gebied. B) Vertegenwoordiger sporen van gelijktijdige opnamen van fEPSPs (bovenste paneel) en astrocytische stromen (onderste paneel) opgewekt door SC-synaptisch stimulatie in de presencinge van farmacologische drugs. De reacties worden eerst opgeslagen in de aanwezigheid van een GABA-receptor blocker (picrotoxin, 100 uM, zwarte sporen) exciterend reacties isoleren. Latere toepassing van ionotrope glutamaatreceptor blocker (kynurenic zuur, 5 mM, donkergrijs sporen), remt de fEPSP en het grootste deel van de langdurige astrogliale stroom ontmaskeren kleine en snel veranderende component van de huidige astrocytaire antwoord, dat gevoelig voor een glutamaat transporter blocker (TBOA, 200 uM, lichtgrijs sporen). Scale bar, fEPSP 0,1 mV, astrocytaire huidige 15 pA, 10 msec. C 1). Voorbeeld spoor van astrogliale kaliumstroom (1-2), die de opgewekte reactie, getoond in B (onderste paneel, black trace), worden geïsoleerd door het aftrekken van de gelijkstroomcomponent resterende kynurenic zuur (2) van de totale stroom ( 1). Scale bar, 20 pA, 1 sec. C 2) Sample spoor van de glutamaat transporter stroom (2-3), verkregen door aftrekken van de TBOA insensitive langzame component (3) van de huidige in kynurenic zuur (2). Scale bar, 2,5 pA, 25 msec. D) Voorbeeld sporen van een binnenwaartse stroom opgeslagen in voltage-clamp (onderste paneel) en de overeenkomstige membraandepolarisatie in de lopende-klem (bovenste paneel) geïnduceerd door astrocyten in een SC stimulatie. Scale bar, de huidige-clamp 1,5 mV, voltage-clamp 5 Pa, 1 sec. E) Input-output curven illustreren de verhouding tussen de presynaptische vezel salvo (input) en de totale stroom astrogliale (output) opgenomen gelijktijdig in reactie op stimulatie SC (n = 6). Het astrogliale huidige lineair toeneemt met de toenemende vezel volleys, de neuronale fEPSP. F) Sample sporen van de neuronale respons (fEPSP) en de huidige astrocytische getoond voor gepaarde puls stimulatie met 40 msec interpuls interval. De synaptisch-opgeroepen astrogliale huidige tentoonstellingen, zoals neuronen, gepaarde-pulse faciliteren. Scale bar, 0,1 mV, 5 pA, 20 msec.
Figuur 3. Dual opnamen van synaptisch geïnduceerde neuronale en astrogliale reacties in het CA1 en CA3 gebieden van de hippocampus. A) reconstructie van een CA1 pyramidale cel geïnjecteerd met sulforhodamine-B (rood, 0,1%) en een astrocyt gevuld met fluoresceïne dextran (groen, 0,1%) met de gehele cel patch-clamp techniek. Schaal bar, 10 urn. B 1) Representative sporen van gelijktijdige gehele-cel opname van membraanpotentialen in de lopende-klem van een CA1 pyramidale cel en een aangrenzende astrocyte. Neuronale actiepotentiaal verbranding (zwart trace), opgeroepen door injectie van een 20 pA depolariserende stroompuls geen reactie oproept in de aangrenzende astrocyten (grijze trace). Scale bar, 20 mV, 10 pA, 100 msec. B 2) Sample sporen van dual whole-cell opnames van een CA1 pyramidale cel in de huidige-clamp en een aangrenzend astrocyt in voltage-clamp na SC stimulatie in aanwezigheid van picrotoxin (100 uM). SC stimulatie roept een prikkelende postsynaptische potentiaal (EPSP, zwart spoor), geassocieerd met een kleine en langdurige astrocytaire stroom (grijze spoor). Scale bar, 5 mV, 10 pA, 100 msec. C) Regeling van de hippocampus slice is die in de dentate gyrus (DG) en CA3 gebieden de opstelling van de stimulerende elektrode, de mosvezels de patch pipet elektrode (grijs) om astrocytische stromen opnemen en het extracellulaire elektrode activeren opnemen fEPSP, opgeroepen door CA3 bemoste vezels stimulatie. D, E) Representative sporen van gepaarde opnamen van CA3 fEPSPs (bovenste panelen, zwarte sporen in D1 en D2) en astrocytische hele-cel responsen (onderste panelen, grijs sporen in D 1 en D 2) op enkele stimulatie van CA3 mossy vezels van 0,02 Hz (zoom in de inzet) (D 1) of 1 Hz stimulatiefrequentie (D 2). Scale bar voor D
Discussion
Dual opname van synaptisch-neuronale en gliale reacties is een bruikbare methode voor online veranderingen te bestuderen in pre-en postsynaptische activiteiten geassocieerd met veranderingen in astrogliale eigenschappen. De synaptisch-opgeroepen gliale membraan depolarisatie is een directe maat voor de extracellulaire kalium stijging 8, mede als gevolg van presynaptische actiepotentiaal afvuren, maar vooral aan de postsynaptische depolarisatie 7. Daarom opnamen van gliale membraanpotentiaal dynamiek kan worden gebruikt om wijzigingen in presynaptische prikkelbaarheid, postsynaptische activiteit extracellulaire ruimte volume en kalium buffering capaciteit 6, 8 onderzoeken. De astrogliale glutamaat transporter stroom is een gevoelige maat voor presynaptische glutamaat release, in staat om op korte termijn wijzigingen in release waarschijnlijkheid 3, 5, 9 monitoren. Voorts kan worden gebruikt om de functionele synapse-glia interacties karakteriseren verschillende synapsen of in verschillende ontwikkelingsstadia stleeftijd van 10. Benadrukt moet worden dat GLTs zeer temperatuurgevoelig zijn 11 en worden door de elektrochemische gradiënt van Na +, K + en H +12. Dus de amplitude en kinetiek van de huidige GLT sterk afhankelijk van de gekozen experimentele voorwaarden. Bovendien is de werkelijke tijdsverloop van astrogliale glutamaat klaring uit de opgenomen GLT huidige bekende gedeeltelijk worden bedekt. Dit komt door het filteren van GLT stromen door factoren zoals de elektrotone eigenschappen van astrocyten of asynchrone zender release die de kinetiek verstoren 13. Werkwijzen extraheren van de temporele kenmerken van de filter mechanismen ontwikkeld en kunnen worden gebruikt om de werkelijke glutamaat klaring tijdsverloop in fysiologische of pathologische situaties, 6,13,14 recenly uitgevoerd. Daarnaast is de gelijktijdige opname van de astrogliale membraan depolarisatie, in stroomtang, kan INSIGhts naar mogelijke wijzigingen van extracellulaire kalium transiënten. Single astrocyten tot contact tot 100.000 synapsen van ~ 100 verschillende neuronen, en hebben daarom te integreren en die de werking van de lokale neuronale netwerken.
Bij het gebruik van de techniek hier gepresenteerd, dat wil zeggen het opnemen elektrofysiologische hele-cel responsen van astrocyten tot inzichten in basale synaptische activiteit te krijgen, moet men in gedachten houden dat in astrocyten, patch-clamp opnames op het soma-niveau kunnen detecteren stromen grotendeels afkomstig van de cel soma of proximale processen. Inderdaad, stromen gedetecteerd bij de soma slechts gedeeltelijk afkomstig fijne distale processen bij sterke activatie van receptoren en kanalen voorkomende in meerdere fijne processen genereren stromen propageren naar de cel soma. Zo basale receptor en activiteit op het kanaal in individuele kleine astrogliale processen met betrekking tot synaptische compartimenten is nauwelijks waarneembaar. Dit is deels te wijten aan de beperkte Spatial en tijdelijke controle van membraan stromen en spanningen door whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten in situ. Er moet echter worden opgemerkt dat het oppervlak van de overvloedige kleine astrocytische processen overschrijdt de membraanoppervlak van de soma en hoofdprocessen. Bovendien zijn deze perisynaptic astrogliale microdomeinen bevatten functioneel relevante receptoren en kanalen, die waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in neuroglial communicatie en synaptische regeling. De techniek die we hier gepresenteerde is dus vooral handig om de astrocytaire integratie van synchrone activiteit van neuronale ensembles studeren, die zich in het bijzonder tijdens afference stimulatie. Het moet niet worden gebruikt om de dialoog tussen individuele synapsen en aangrenzende fijne astrocytische processen die onder basale spontane activiteit te bestuderen. Een alternatieve methode om lokale astrogliale geïnduceerd door basale synaptische activiteit te bestuderen zou zijn patch-clamp opnames uitvoeren van fijn processen, deen in dendrieten 15. Hoewel het patchen van deze fijne astrogliale processen wordt waarschijnlijk uitdagend door hun kleine omvang, is het waarschijnlijk een laan te streven naar meer intieme dialoog tussen astrogliale microdomeinen en individuele synapsen te ontrafelen. Echter, de kans klein elektrofysiologische astrogliale reacties als gevolg van individuele geldboete astrogliale processen onder de drempel-detectie, omdat elektrische ruis bereikt in de gemiddelde 3 tot 5 pA in patch-clamp opnames. Een andere methode om astrogliale reacties studeren om synaptische activiteit is calcium beeldvorming, omdat de activering van astrocytaire membraan receptoren of transporters door neuroactive stoffen kan leiden tot intracellulaire calcium transiënten. Echter, bulkverlading van astrocyten met calcium indicatoren ook weerspiegelen voornamelijk somatische activiteit 16. De combinatie van elektrofysiologie en calcium beeldvorming maakt het ook mogelijk het detecteren van kleine calcium signalen van fijn astrogliale wijze verkregen die zich spontaan of getriggerd by minimale synaptische stimulatie 17, 18. Echter, men moet in gedachten houden dat met hoge affiniteit calcium indicatoren kunnen fungeren als calcium buffers, het remmen van belangrijke calcium signaalwegen, terwijl een lage affiniteit indicatoren zou kunnen werken beneden het detectieniveau. Tenslotte een elegant en niet-invasieve techniek om calcium gebeurtenissen in fine astrocytische processen die ook uitwassen van intracellulaire signaalmoleculen omzeilt in whole-cell patch-clamp, onderzoek bestaat uit een membraan gerichte calcium sensor, die kan worden uitgedrukt in astrocyten in situ, evenals in vivo 19. Echter, calcium imaging alleen informatie over een signaalmolecuul die betrokken is in veel, maar niet alle cellulaire activiteiten, terwijl gehele-cel patch-clamp geeft kwantitatieve informatie over de verschillende ionische stromen geactiveerd op kanaal receptor activatie. Daarom gelijktijdige elektrofysiologische opnamen van neuronen en astrocytenzijn een unieke en krachtige methode om te ontrafelen online de dynamiek van neuroglial ionische signalering en haar rol hersenen informatie verwerken.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dana Kamalidenova, Morgan Autexier, en Roch Chopier, die de video en animaties, evenals Florian Beck bedanken voor de foto's en de post-productie van de video voice-over. Dit werk werd gesponsord door Olympus en worden ondersteund door subsidies van de HFSPO (Career Development Award), ANR (Programma Jeunes chercheurs en programma Blanc Neurowetenschappen), FRC (Federation pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM en La Pitie-Salpêtrière ziekenhuis (Translationeel onderzoek contract) aan NR, van Frans Research ministerie en Deutsche Forschungsgemeinschaft postdoc beurzen naar UP, en van de doctoral school "Frontiers in Life Science", Paris Diderot Universiteit, Bettencourt Schuller stichting, en FRM (Fondation pour la Recherche Medicale) doctorale beurs aan JS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
- Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
- Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
- Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
- Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
- Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
- Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
- Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).
