Summary
La préparation de coupes de cerveau de courte durée isolé hippocampes, ainsi que les enregistrements électrophysiologiques simultanées d'astrocytes et les neurones dans
Abstract
Les astrocytes forment ensemble avec les synapses des neurones tripartites, où ils intègrent et moduler l'activité neuronale. En effet, les astrocytes sentir entrées neuronales par l'activation de leurs canaux ioniques et des récepteurs de neurotransmetteurs, et traiter l'information en partie grâce à l'activité dépendante de la libération de gliotransmetteurs. Par ailleurs, les astrocytes constituent le système d'absorption principale du glutamate, contribuer à tampon spatiale de potassium, ainsi que la clairance de GABA. Ces cellules donc constamment surveiller l'activité synaptique, et ce sont des indicateurs sensibles pour des altérations de glutamate synaptique du GABA libéré,-et extracellulaire des niveaux de potassium. En outre, des modifications de l'activité ou l'absorption astrogliale capacité tampon peut avoir des effets graves sur les fonctions neuronales, et peut être négligée lors de la caractérisation des situations physiopathologiques ou des souris knock-out. Double enregistrement des activités neuronales et astrocytaires est donc une méthode importante pour étudier les altérations dansla force synaptique associée aux modifications concomitantes de l'absorption et des capacités de mise en mémoire tampon astrogliale. Nous décrivons ici la façon de préparer des coupes d'hippocampe, comment identifier les strates astrocytes radiatum, et comment enregistrer simultanément neuronales et astrocytaires réponses électrophysiologiques. En outre, nous décrivons comment isoler les courants synaptiques pharmacologiquement-astrogliales évoqués.
Protocol
1. Préparation du liquide céphalo-rachidien artificiel et la solution intracellulaire
- Avant de commencer l'expérience, on a besoin de préparer la solution interne pour les enregistrements de patch-clamp, de même que le fluide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour la préparation hippocampe. Vous devez en outre un kit de dissection composé de ciseaux chirurgicaux et bien ciseaux iris, deux spatules et pinces (outils scientifiques Arts), un dispositif de gazage verre (micro-filtre à bougies, ROBU Allemagne) et la grille de tissu (moustiquaire nylon ou serré), ainsi que la superglue (Dent Uhu). La configuration de l'installation de patch électrophysiologie tranche a été décrit par Finkel & Bookman, 2001 1.
- Pour la solution interne, dissoudre (en mM): 105 K-gluconate, 30 KCl, 10 HEPES et 0,3 EGTA dans de l'eau déminéralisée (dans 70-80% du volume final). Refroidir la solution à 4 ° C et ajouter (en mM): 4 ATP-Mg, 0,3 Tris-GTP et 10 phosphocréatine. Ajuster le pH à 7,4 avec KOH et de remplissage up avec de l'eau déminéralisée au volume final. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtrer cette solution (taille des pores de 0,2 um). Poolées solution est stable pendant 3-4 semaines à - 20 ° C. Pour une journée expérimentale, ~ 1 ml de solution interne est nécessaire.
- Sauf indication contraire, l'ACSF utilisé pour la préparation hippocampe et des enregistrements de cellules dans la région CA1, contient (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,3 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 et 11 glucose. Dissoudre ces sels dans l'eau désionisée (320 mOsm Osmolarité ~) et oxygéner cette solution pendant au moins 10 minutes (pH ~ 7,3 - 7,4) avec carbogène (95% O 2 et 5% de CO 2). Préparer au moins 1 litre de solution par expérience. Une attention particulière doit être prise pour la préparation du tissu hippocampique qui sera utilisé pour effectuer des expériences dans la région CA3 de l'hippocampe. En effet, cette région est sujette à épileptiformes activité et après la mort neuronale. Ainsi SYNAPTic activité devrait être fortement réduit au cours de la préparation de tranche, et ceci est réalisé en effectuant la dissection hippocampe dans une solution glacée de saccharose contenant (en mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 et 75 Saccharose Glucose. Dans cette solution, la combinaison de la faible teneur en sodium, calcium et magnésium concentrations élevées de réduire massivement tir présynaptique et la probabilité de libération, ainsi que postsynaptique activité des récepteurs NMDA, ce qui réduit l'activité spontanée et la mort cellulaire. Une fois préparée, des coupes d'hippocampe utilisés pour les enregistrements de cellules provenant de la région CA3 sont perfusés avec mise à jour ACSF, contenant 4 mM CaCl 2 et 4 MgSO 4, afin de minimiser l'activité polysynaptique.
2. Préparation aiguë Slice hippocampe
- Refroidir ~ 300 ml d'ACSF pour la chambre de découpage, ainsi que pour la préparation de 4 ° C, tandis que l'oxygénation constante aveccarbogène. Préparer un petit becher avec ACSF à température ambiante (RT) pour le stockage de tranche, qui est également oxygéné avec carbogène (Figure schéma 1).
- Anesthésier la souris sous un capot avec une serviette en papier imbibée petite avec 1 ml isoflurane qui est ajouté dans la cage.
- Après la souris est profondément anesthésié, couper la tête et de l'ajouter directement dans une petite assiette avec de la glace-froid ACSF oxygénée. Enlever le cuir chevelu avec un petit ciseau et transférer sur la tête de tissu pour les étapes ultérieures. Début de disséquer l'hippocampe, comme illustré et décrit dans la figure 1.
- Couper 300-400 microns d'épaisseur coupes transversales à faible vitesse (3 um / s) et la fréquence de vibration de 70 Hz à froid glace oxygénée ACSF, et les transférer dans une chambre de stockage. Laisser reposer à température ambiante pendant tranches au moins 1 heure d'enregistrement préalable. Tranches de CA3 expériences sont stockés 25 min à 34 ° C et au moins 30 min à température ambiante, pour se remettre de l'opération de tranchage. 3. Double enregistrement des courants évoqués astrogliale et potentiels de champs neuronaux
- Perfuser constamment avec la chambre d'enregistrement oxygéné ACSF (1.5-2 ml / min, RT), contenant 100 uM de la picrotoxine (antagoniste GABA A) afin d'isoler des réponses excitatrices. Transfert d'un morceau sur une poly-L-lysine (1,5 à 3 mg / ml) lamelle enduite, trempez le liquide pour obtenir une adhérence bonne tranche et ajouter une goutte de la FCSA sur le dessus de la tranche. Placez la lamelle dans la chambre d'enregistrement. Le blocage de la transmission inhibitrice par la picrotoxine peut entraîner une activité épileptiforme, soit spontanée, tir synchrone des populations neuronales, ce qui faussera la mesure des événements évoqués. Ainsi, pour empêcher l'activité épileptiforme, faire unecoupe à plat (seulement la surface) entre les régions CA1 et CA3 pour empêcher la propagation via les collatérales de Schaffer (comme indiqué dans la figure 2a).
- Strate astrocytes radiatum peuvent être identifiés par leur taille soma petite (~ 10 m) et processus d'assemblage stellaire. Choisissez une cellule au moins 20-30 um en dessous de la surface de la tranche. Monter une électrode de stimulation de verre (résistance à la pointe ~ 1 M) sur le fil d'argent qui est relié à la boîte d'isolation stimulus et la terre dans le bain (simplement en enroulant le fil d'argent autour de la seconde pipette en verre). Placer l'électrode de stimulation dans la région collatérale de Schaffer, comme indiqué sur la figure 2A, à une distance de 200-300 um loin de l'astrocyte choisi. Monter l'électrode d'enregistrement de terrain (~ 2-5 MQ) sur un fil d'argent chlorée connecté à la headstage de l'amplificateur. Les deux électrodes sont remplies avant avec ACSF. Choisissez dans MultiClamp le mode I = 0, ce qui désactive com externemande d'entrée et de placer l'électrode ~ 50 um loin de l'astrocyte dans la région stratum radiatum (Figure 2A). Enregistrer les réponses avec gain de 2 à 10 et un filtre à 2 kHz filtre de Bessel. Injection de courant électrique dans la tranche cerveau déclenche des potentiels d'action dans les axones qui entourent collatérale de Schaffer et la libération subséquente émetteur aux bornes présynaptiques ce projet de post-synaptiques neurones pyramidaux CA1. Les transmetteurs libérés va déclencher un flux de charge positive dans les cellules post-synaptiques par les récepteurs ionotropiques, qui est mesurable extracellulaire comme un potentiel légèrement négatif. Ce champ de potentiel d'excitation post-synaptique (fEPSP) intègre l'activité d'un groupe de neurones actifs simultanément, alors que la transmission est bloquée inhibiteur pharmacologique. Appliquez quelques impulsions de test (0,1 msec) pour évoquer un fEPSP, certains repositionnement de l'électrode de stimulation pourrait contribuer à accroître la fEPSP. Un type CA1 strate Radiateuh fEPSP est illustré dans la figure 2B. De plus amples détails sur le positionnement et la réponse formes d'onde peuvent être trouvés dans Yuan et al. 2003 2. L'amplitude fEPSP dans une tranche saine hippocampe devrait normalement être plus de deux fois plus grande que l'amplitude de la salve de fibres. Pour une quantification précise de l'amplitude fEPSP ou la pente, la reponse devrait être évoquée monosynaptique, l'activité polysynaptique (détectable comme une réponse multi-crête) indique une activité synaptique indépendante de la stimulation électrique, qui pourrait être un signe pour hyperexcitabilité. Pour les expériences réalisées dans la région CA3 de l'hippocampe, de stimulation et d'enregistrement pipettes sont positionnés comme illustré à la figure 3C. Pour identifier clairement les intrants fibres moussues, qui sont fortement facilitant, jumelé à impulsions de stimulation (50 ms d'interruption d'intervalle) et 1 Hz stimulation pendant quelques secondes sont appliqués à améliorer massivement l'amplitude initialement faible évoqué fEPSP responses.At la finde l'expérience, DCGIV, un antagoniste des récepteurs mGluR2 / 3, peuvent être lavés dans de plus vérifier que les entrées de fibres moussues effet ont été stimulées. L'application de cette antagoniste doit diminuer la fEPSP par ~ 90% en raison de la forte expression de mGluR2 / 3 récepteurs, l'inhibition présynaptique de libération boutons fibres moussues.
- Remplir une pipette de patch (~ 2-5 MQ) avec une solution interne filtré et le monter sur un fil d'argent chlorée reliée à la seconde headstage, appliquer une pression positive avec une seringue, qui est relié par une tubulure à votre porte-pipette. Constamment appliquer une impulsion de 20 ms essai de 10 mV et déplacez la pipette dans le tissu jusqu'à ce que vous atteigniez la surface de la cellule et une déviation de la membrane devient visible. Zéro la pipette offset, enlever la pression positive, et serrer la membrane - mV 80. Attendez jusqu'à ce qu'un gigaseal (au moins 1 GΩ) est atteint (il ne devrait pas prendre plus de quelques secondes). Application douce de quelque pression négative pourrait aider à atteindre agigaseal. Percer dans la cellule est réalisée par une application d'une pression négative à court ou moyen de la fonction de zap multipince. Démarrez l'enregistrement simultané de la collatérale de Schaffer évoqué fEPSP et la réponse astrogliale dans la pince de tension (Vhold - 80 mV; gain de fréquence de 0,1 Hz, filtre de Bessel 2 kHz, 10). La réponse astrogliale actuelle est biphasique: d'abord, vous verrez un rapide courant transitoire vers l'extérieur, ce qui reflète fEPSPs générés par les cellules pyramidales adjacentes. Elle est suivie par une hausse lente décomposition et intérieurs actuels (qui persistent pendant plusieurs secondes (> 10 sec) après la cessation des réponses neuronales). Ce courant est principalement due à l'entrée de potassium dans les astrocytes, après la libération en entourant dépolarisées terminaux post-synaptiques. Une fois activé transporteur du glutamate rapide courant transitoire (GLT), déclenchée par la libération de glutamate présynaptique est masqué par le courant potassique. Le potentiel de maintien de l'astrocyte, ainsi que la résistance d'accès du patch devrait être monitored tout au long de l'expérience et ne doit pas varier de plus de ~ 20%, afin d'éviter la surveillance inexacte des reponses astrogliales raison de changements dans les conditions d'enregistrement. Seuls les astrocytes avec un potentiel initial de détention> -70 mV doivent être examinées pour étudier les cellules saines.
- Passez de tension à courant pince pour enregistrer la dépolarisation de la membrane évoqué astrocytaire. Isoler le transporteur du glutamate glial (GLT) actuelle par perfusion de l'acide ionotropiques du glutamate bloqueur des récepteurs kynurénique (5 mM), jusqu'à ce que le fEPSP est complètement bloquée et l'amplitude GLT a atteint un plateau. Pour identifier clairement le courant GLT, appliquez l'antagoniste spécifique DL-thréo-β-Benzyloxyaspartatic acide (DL-TBOA, 200 uM). Augmenter la résistance à la stimulation par le 2-pli à 5-fois pour enregistrer les réponses neuronales et astrocytaires à force synaptique différent, et appliquer deux stimuli étroitement espacés (50 ms d'intervalle) pour étudier les réponses à l'impulsion de stimulation appariées. Stabilité de série resistance potentiel et de la membrane de la cellule gliale doit être contrôlée tout au long de l'enregistrement.
- À visualiser la mesure de l'écart-jonction médiée réseaux astrocytaires, des expériences de couplage de colorant doit être effectué dans le mode courant de fixation, sans injection de courant, pour permettre la diffusion passive de faible colorants moléculaire (<1,5 kDa), tels que sulforhodamine-B, par la voie des jonctions lacunaires. Afin de minimiser les retombées colorant dans les tissus environnants, pression positive doit être appliquée par la pipette de patch juste en entrant dans le tissu et le patch devrait être atteint dès que possible.
Nous décrivons ici comment enregistrer synaptique évoquée par les réponses neuronales et astrocytaires, c.-à-réponses induites par l'activation des synapses grâce à la stimulation afférence en utilisant une électrode extracellulaire.
Representative Results
Un enregistrement simultané de représentant-synaptique réponses évoquées astrogliales et neuronale (fEPSPs) dans la région CA1 de l'hippocampe est illustré à la figure 2 AB. Le courant est évoqué astroglial biphasique, c'est à dire qu'il se compose d'un courant transitoire vers l'extérieur et un courant décroissant lentement vers l'intérieur (> 10 sec) (Figure 2B). Le courant sortant reflète la fEPSP évoqué, et est bloqué après l'inhibition des récepteurs du glutamate ionotropiques par l'acide kynurénique (gris foncé trace, Figure 2B) 3. La majorité du courant entrant lent reflète l'entrée de potassium dans la dépolarisation postsynaptique astrocytes qui suit, car il est aussi supprimée par l'acide kynurénique, qui inhibe l'activité des récepteurs post-synaptiques du glutamate ionotropiques (figure 2B et 2C Figure 1) 3-6, connu pour représenter le principal source (80%) de la libération de potassium 7. Le reste de l'augmentation rapide d'uned courante en décomposition intérieure est inhibée par l'antagoniste GLT DL-TBOA (gris clair trace, Figure 2B et 2C Figure 2). Post-hoc soustraction du courant reste lente dans TBOA (gris clair trace) du courant dans l'acide kynurénique (gris foncé trace) permet d'isoler le transporteur du glutamate astrogliale pur courant (trace noire), comme illustré à la figure 2C 2. La persistance lentement en décomposition actuelle en acide kynurénique et TBOA (gris clair trace, Figure 2B et 2C Figure 2) peut être bloqué par TTX (données non présentées), et reflète probablement l'accumulation de K + extracellulaire libéré pendant la cuisson afférente présynaptique 3. Modérée stimulation unique de Schaffer collatéraux induit un courant relativement important synaptiquement-évoqué astroglial par rapport à la dépolarisation petit évoquée enregistrés dans la même cellule (figure 2D). Cela est dû à larésistance de la membrane à faible des astrocytes. Enregistrement des synapses-évoqués astrogliales dynamique potentiels de membrane, comme illustré sur la figure 2D, est une mesure directe du taux de potassium extracellulaire locales 8. Normalisation des réponses évoquées astrogliales à l'activité neuronale sous-jacente permet la comparaison directe des différentes expériences, comme l'a récemment montré 6. Astrogliales courants peuvent par ailleurs suivre de manière très fiable des altérations de la transmission excitatrice, que le courant total de synapses-évoqué astroglial suit linéairement l'augmentation de la fEPSP (2E figure). Courants astrogliales aussi refléter court terme plasticité synaptique, car ils montrent, comme les neurones, jumelé à impulsions facilitation (figure 2F). Couplé à cellules entières d'enregistrement d'une cellule pyramidale CA1 et un astrocyte révéler très différente comportement électrophysiologique dans les deux types de cellules, depuis des potentiels neuronaux l'action d'affichage en réponse à une impulsion de dépolarisation,tandis que l'astrocyte voisin est silencieux (Figure 3A-B). Cependant, la stimulation modérée des collatérales de Schaffer peut évoquer en même temps un potentiel excitateur rapide posynaptic dans la cellule pyramidale CA1 et un rapide aller et lent des courants entrants dans l'astrocyte adjacente (figure 3B 2). Deux enregistrements de synaptiquement-évoqués réponses neuronales et astrocytaires peuvent également être enregistrées dans la zone CA3 de l'hippocampe, comme le montre la figure 3C. En effet, la stimulation unique de CA3 fibres moussues évoque dans des conditions basales très petites réponses neuronales, enregistrées fEPSPs locaux, associés à de petits rapides et lents extérieurs courants entrants dans les astrocytes (figure 3D 1). En revanche, 1 Hz stimulation des fibres moussues CA3 pendant quelques secondes potentialise fortement l'fEPSP, alors qu'il modérément augmente la réponse astrogliale (figure 3D 2).
Figure isolement Hippocampus 1. Préparer coupes transversales. À disséquer le cerveau, le crâne découpé le long de la ligne médiane (A). Effectuer une coupe coronale au niveau du bulbe olfactif (b) et par la suite au niveau du cervelet (c). Retirez délicatement le crâne à l'aide d'une pince (d), séparer les deux hémisphères avec une lame (e), et de les transférer sur une petite cuillère en froid oxygéné ACSF (f). Après équilibrage ~ 5 min, placer un hémisphère sur le tissu sec avec la face médiale jusqu'à (g). Avec l'aide de deux cuillères à retirer le diencéphale (hj). L'hippocampe est maintenant visible, comme illustré par les lignes en pointillés (k). Disséquer l'hippocampe avec une cuillère, à partir de la fimbria, visible en tant que structure de blanc (lm). Transfert de l'hippocampe de nouveau dans l'ACSF froid. Préparer un petit bloc d'agarose, la position du deux hippocampes avec le côté alveus et l'hippocampe ventralnous sommes confrontés au bord du bloc de gélose, et imprégnez soigneusement tout liquide loin de permettre une bonne fixation de la gélose (n). L'hippocampe colle fixée au bloc de gélose sur la partie ventrale (o).
Figure 2. Simultanées réponses neuronales et astrocytaires évoqués-synaptique dans la région CA1 de l'hippocampe. A) Schéma de la tranche hippocampique illustrant l'agencement de l'électrode de stimulation, pour activer collatérales de Schaffer (SC), l'électrode de pipette de patch, de suivre les courants astrocytaires, et l'électrode extracellulaire, pour enregistrer fEPSP, provoquée par la stimulation de la SC hippocampique région CA1. B) représentatifs des traces des enregistrements simultanés de fEPSPs (panneau supérieur) et les courants astrocytaires (panneau inférieur)-synaptique évoquée par stimulation SC dans le presence de médicaments pharmacologiques. Les réponses sont d'abord enregistrées dans la présence d'un bloqueur des récepteurs de GABA A (picrotoxine, 100 pM, des traces noires) pour isoler les réponses excitatrices. L'application ultérieure d'un bloqueur des récepteurs ionotropiques du glutamate (acide kynurénique, 5 mM, sombres traces de gris), inhibe la fEPSP et la majeure partie du courant de longue durée astrogliale, démasquant un petit élément et transitoire rapide de la réponse astrocytaire courant, qui est sensible à un inhibiteur transporteur du glutamate (TBOA, 200 uM, des traces gris clair). La barre d'échelle, fEPSP 0,1 mV, astrocytaire actuel de 15 pA, 10 msec. C 1). Échantillon de la trace de potassium astroglial courant (1-2), qui peut être isolé à partir de la réponse évoquée, montre B (panneau inférieur, trace noire), par soustraction de la composante de courant qui reste dans l'acide kynurénique (2) à partir du courant total ( 1). La barre d'échelle, 20 pA, 1 sec. Exemple trace C 2) du transporteur du glutamate de courant (2-3), obtenue par soustraction de la i TBOAnsensitive composante lente (3) à partir du courant dans l'acide kynurénique (2). La barre d'échelle, 2,5 pA, 25 msec. D) Exemples de traces d'un courant entrant enregistré en voltage-clamp (panneau inférieur) et la dépolarisation de la membrane correspondante enregistrée en courant de serrage (panneau supérieur) induite dans un astrocyte par la stimulation SC. La barre d'échelle, courant de serrage 1,5 mV, voltage-clamp 5 pA, 1 sec. E) d'entrée-sortie des courbes illustrant la relation entre les volées de fibre présynaptique (entrée) et le courant total astrogliale (sortie) enregistrées simultanément en réponse à la stimulation SC (n = 6). Les augmentations actuelles astrogliales linéairement avec les salves de fibre accrues, comme le fEPSP neuronale. F) des traces d'exemples de la réponse neuronale (fEPSP) et le courant sont présentés pour astrocytaire appariées impulsion de stimulation à un intervalle de 40 ms entre impulsions. Les synapses-évoqués astrogliales expositions en cours, comme les neurones, double choc de facilitation. La barre d'échelle, 0,1 mV, 5 pA, 20 msec.
La figure 3. Enregistrements doubles de synapses neuronales induites par les réponses et astroglial dans les zones CA1 et CA3 de l'hippocampe. A) la reconstruction d'une cellule pyramidale CA1 injecté avec sulforhodamine B (rouge, 0,1%) et un astrocyte rempli avec de la fluorescéine dextrane (vert, 0,1%), en utilisant l'ensemble des cellules de patch-clamp technique. La barre d'échelle, 10 pm. B 1) représentatifs de traces simultanées de cellules entières enregistrements de potentiels de membrane enregistrées dans le courant de serrage d'une cellule pyramidale CA1 et un astrocyte adjacent. Neuronale cuisson potentiel d'action (trace noire), provoquée par l'injection d'un PA 20 dépolarisant impulsion de courant, évoque sans réponse dans l'astrocyte adjacent (gris trace). La barre d'échelle, 20 mV, 10 pA, 100 msec. Traces d'exemples B 2) de deux cellules entières des enregistrements d'une cellule pyramidale CA1-courant dans palourdep et un astrocyte voisine de voltage-clamp après stimulation SC en présence de picrotoxine (100 pM). SC stimulation évoque un potentiel postsynaptique excitateur (PPSE, trace noire), associée à un faible courant et de longue durée astrocytaire (gris trace). La barre d'échelle, 5 mV, 10 pA, 100 msec. C) Schéma de la tranche hippocampique représentant dans le gyrus denté (DG) et les zones CA3 la disposition de l'électrode de stimulation, pour activer les fibres moussues, l'électrode de pipette de patch (gris), pour enregistrer les courants astrocytaires, et l'électrode extracellulaire, à fEPSP dossier, évoqué par la stimulation des fibres moussues CA3. Traces représentatives D, E) d'enregistrements appariés de CA3 fEPSPs (panneaux supérieurs, des traces noires dans D 1 et D 2) et astrocytaires cellules entières réponses (panneaux inférieurs, des traces grises D 1 et D 2) à une stimulation unique de mousse CA3 fibres à 0,02 Hz (zoom dans l'encart) (D 1) ou à 1 Hz de fréquence de stimulation (D 2). La barre d'échelle D
Discussion
Double enregistrement des synaptique induite par les réponses neuronales et gliales est une méthode utile pour étudier les altérations en ligne à des activités pré-et post-synaptiques associés à des changements dans les propriétés astrogliales. La dépolarisation de la membrane synaptique évoquée par des cellules gliales est une mesure directe de la hausse de potassium extracellulaire 8, en partie à cause du potentiel d'action présynaptique de tir, mais surtout à la dépolarisation postsynaptique 7. Par conséquent, les enregistrements de la dynamique gliales potentiel de membrane peut être utilisée pour étudier les modifications de l'excitabilité postsynaptique présynaptique, l'activité, le volume de l'espace extracellulaire et des capacités de mise en mémoire tampon de potassium 6, 8. Le courant de glutamate astrogliale transporteur est une mesure sensible de la libération de glutamate présynaptique, en mesure de surveiller changements à court terme dans 3 probabilité de libération, 5, 9. Il peut en outre être utilisée pour caractériser les fonctionnelles synapse-glie interactions au niveau des synapses différents ou à st développement différentâgés de 10 ans. Il convient de souligner que GLTs sont très sensibles température 11 et sont entraînés par le gradient électrochimique de Na +, K + et H +12. Ainsi, l'amplitude et la cinétique du courant GLT dépendra fortement des conditions expérimentales choisies. En outre, le cours du temps réel de jeu glutamate astrogliale dérivé du courant GLT enregistré est connu pour être partiellement obstrué. Cela est dû au filtrage des courants GLT par des facteurs tels que les propriétés électrotoniques d'astrocytes ou la libération émetteur asynchrone, qui faussent leur cinétique 13. Méthodes d'extraction des caractéristiques temporelles des mécanismes de filtrage ont été développés et peuvent être utilisées pour dériver le cours réel du glutamate espace temps dans des situations physiologiques ou pathologiques, comme recenly effectué 6,13,14. En outre, l'enregistrement simultané de la dépolarisation de la membrane astrogliale, en cours de serrage, peut fournir INSIGhts dans altérations possibles de extracellulaires transitoires de potassium. Astrocytes simples avec jusqu'à 100.000 synapses des neurones ~ 100 différentes, et ne donc intégrer et de moduler l'activité des réseaux neuronaux locaux.
Lorsque vous utilisez la technique présentée ici, à savoir l'enregistrement électrophysiologiques de cellules entières réponses astrocytes de mieux comprendre les activité synaptique basale, il faut garder à l'esprit que dans les astrocytes, patch-clamp au niveau soma permettent aux courants détection pour la plupart en provenance du corps cellulaire ou processus proximaux. En effet, les courants détectés au niveau du soma que partiellement provenir de beaux processus distaux quand une forte activation des récepteurs et canaux qui se produisent dans de multiples processus fines peuvent générer des courants se propagent au soma cellulaire. Ainsi récepteur de base et l'activité des canaux individuels dans les petites astrogliales processus couvrant compartiments synaptiques est difficilement détectable. Cela est dû en partie à la limité naissaincontrôle ial et temporelle des courants et des tensions membranaires par la cellule entière patch-clamp du astrocytes in situ. Cependant, il faut noter que la surface des abondantes minuscules processus astrocytaires dépasse de loin la surface de la membrane des processus et soma principale. En outre, ces microdomaines périsynaptiques astrogliales contiennent les récepteurs fonctionnellement pertinents et les canaux, ce qui a probablement jouer un rôle important dans la communication neurogliale et la régulation synaptique. La technique que nous avons présenté ici est donc surtout utile pour étudier l'intégration astrocytaire de l'activité synchrone à partir des ensembles neuronaux, survenant notamment lors de la stimulation afférence. Il ne devrait pas être utilisé pour étudier le dialogue entre les synapses individuelles et fines adjacentes processus astrocytaires qui se produisent au cours de l'activité spontanée de la base. Une autre méthode pour étudier les réponses locales astrogliales induites par l'activité synaptique basale serait d'effectuer des enregistrements de patch-clamp de processus fines, comme dune dendrites en 15. Bien que ces processus de correction fines astrogliales est probablement difficile en raison de leur petite taille, il s'agit probablement d'une voie à suivre pour démêler dialogue plus intime entre microdomaines astrogliales et des synapses individuelles. Cependant, les petites électrophysiologiques susceptibles réponses astrogliales résultant de processus individuels fines astrogliales peut être inférieure à détection de seuil, car le bruit électrique atteint en moyenne 5.3 pA dans le patch-clamp enregistrements. Une autre méthode pour étudier les réponses astrogliales à l'activité synaptique est l'imagerie calcique, depuis l'activation de récepteurs membranaires ou des transporteurs astrocytaires par des substances neuro peut déclencher transitoires calciques intracellulaires. Cependant, le chargement en vrac des astrocytes avec des indicateurs de calcium peut également reflètent principalement l'activité somatique 16. La combinaison de l'imagerie électrophysiologie et de calcium permet également de détecter des signaux calciques petits à partir de fines astrogliales processus, que ce soit survenant spontanément ou déclenché by stimulation minimal synaptique 17, 18. Cependant, il faut garder à l'esprit que les indicateurs de calcium de haute affinité pourrait agir comme tampons calciques, inhibiteurs calciques voies de signalisation importantes, alors que les indicateurs de faible affinité pourrait fonctionner en dessous du niveau de détection. Enfin, une technique élégante et non invasive pour étudier les événements de calcium dans les processus astrocytaires fines, qui contourne également le lavage des molécules de signalisation intracellulaire lors de la cellule entière de patch-clamp, consiste à utiliser un capteur de calcium membrane cible, qui peut être exprimé dans les astrocytes in situ, ainsi que in vivo 19. Cependant, l'imagerie calcique ne peut fournir des informations sur une molécule de signalisation, qui est impliquée dans de nombreux, mais pas toutes les activités cellulaires, alors que la cellule entière de patch-clamp fournit des informations quantitatives sur les différents courants ioniques déclenchés sur le canal et l'activation du récepteur. Par conséquent simultanées enregistrements électrophysiologiques de neurones et les astrocytessont une méthode unique et puissante pour percer en ligne de la dynamique de la signalisation ionique neurogliale et son traitement de l'information le rôle du cerveau.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Dana Kamalidenova, Morgan Autexier, et Roch Chopier, qui a fait la vidéo et des animations, ainsi que Florian Beck pour les photos et la post-production de la vidéo voice-over. Ce travail a été financé par Olympus et soutenu par des subventions du HFSPO (Career Development Award), l'ANR (programme Jeunes Chercheurs et le Programme Blanc neurosciences), le FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), l'INSERM et La Pitié Salpêtrière (recherche translationnelle contrat) à NR, du français Ministère de la Recherche et de bourses post-doctorales Deutsche Forschungsgemeinschaft pour UP, et des doctorants des écoles "Frontiers in Science de la vie», Université Paris Diderot, Bettencourt Schuller fondation, et FRM (Fondation pour la Recherche Médicale) bourse de doctorat à JS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
- Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
- Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
- Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
- Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
- Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
- Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
- Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).
