Summary
Fremstillingen av akutte hjernen skiver fra isolerte hippocampi samt samtidige elektrofysiologiske innspillinger av astrocytes og nevroner i
Abstract
Astrocytes danner sammen med nevroner tredelt synapser, hvor de integrere og modulere neuronal aktivitet. Faktisk, astrocytes forstand nevrale innganger gjennom aktivering av sine ionekanaler og nevrotransmitterreseptorer og behandle informasjon blant annet gjennom aktiviteten-avhengige utgivelsen av gliotransmitters. Videre astrocytes utgjør den viktigste opptak systemet for glutamat, bidra til kalium romlig bufring, samt til GABA klaring. Disse cellene derfor kontinuerlig overvåke synaptiske aktivitet, og er dermed følsomme indikatorer for endringer i synaptically utgitt glutamat, GABA og ekstracellulære kaliumnivå. I tillegg kan endringer i astroglial opptak aktivitet eller bufferkapasitet har alvorlige effekter på nevronale funksjoner, og kan bli oversett når karakteriserer physiopathological situasjoner eller knockout mus. Dual opptak av neuronal og astroglial aktiviteter er derfor en viktig metode for å studere endringer isynaptiske styrken knyttet til samtidig endringer i astroglial opptak og bufring kapasitet. Her beskriver vi hvordan å forberede hippocampus skiver, hvordan å identifisere stratum radiatum astrocytes, og hvordan å spille inn samtidig neuronal og astroglial elektrofysiologiske reaksjoner. Videre beskriver vi hvordan du isolerer farmakologisk de synaptically-fremkalt astroglial strømninger.
Protocol
1. Utarbeidelse av kunstig cerebrospinalvæske og Intracellulær Solution
- Før eksperimentet, må man forberede interne løsninger for oppdateringen klemme innspillinger, samt kunstige cerebrospinalvæsken (ACSF) for hippocampus forberedelse. Du vil videre ha en disseksjon bestående av kirurgisk saks og fine iris saks, to stekespader og pinsetter (fine vitenskap verktøy), en glass gassing enhet (micro-filter stearinlys, Robu Tyskland) og vev rutenett (myggnetting eller nylon stramt), samt superlim (Uhu Dent). Konfigurasjonen av elektrofysiologi stykke patch oppsett ble beskrevet av Finkel & Bookman, 2001 1.
- For den interne oppløsning, oppløses (i mM): 105 K-glukonat, 30 KCl, 10 HEPES og 0,3 EGTA i deionisert vann (i 70-80% av det endelige volum). Avkjøl løsningen til 4 ° C og tilsett (i mM): 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris og 10 fosfokreatin. Juster pH-verdien til 7,4 med KOH og fylle up med avionisert vann til det endelige volum. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtrere denne løsning (porestørrelse 0,2 mm). Alikvoteres løsningen er stabil i 3-4 uker ved - 20 ° C. For en eksperimentell dag, er ~ 1 ml intern løsning nødvendig.
- Mindre annet er angitt, inneholder ACSF brukes hippocampus forberedelse og opptak av cellene i CA1 regionen, (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,3 4 MgSO, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 og 11 glukose. Oppløse disse salter i deionisert vann (Osmolaritet ~ 320 mOsm) og oxygenate denne løsningen i minst 10 minutter (pH ~ 7,3 til 7,4) med CARBOGEN (95% O 2 og 5% CO 2). Forberede minst 1 liter løsning per eksperiment. Særlig forsiktighet bør utvises for utarbeidelse av hippocampus vev som skal brukes til å utføre eksperimenter i CA3 regionen av hippocampus. Faktisk, er denne regionen utsatt for epileptiform aktivitet og påfølgende nevronal død. Dermed synaptic aktivitet bør være sterkt redusert under skive forberedelse, og dette er oppnådd ved å utføre hippocampus disseksjon i iskald sukroseløsning inneholdende (i mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 2 CaCl, 7 2 MgCl, 1 NaH 2 4 PO , 25 3 NaHCO, 10 Glukose og 75 Sukrose. I denne oppløsningen kombinasjonen lav natrium, lav kalsium og høye magnesium konsentrasjoner massivt redusere presynaptisk avfyring og slipp sannsynlighet samt postsynaptiske NMDA reseptor aktivitet, og dermed minimere spontan aktivitet og celledød. Etter tilberedning hippocampus skiver som brukes for opptak av celler fra CA3 regionen perfused med modifisert ACSF, som inneholder 4 mM CaCl 2 og 4 MgSO 4, for å minimere polysynaptic aktivitet.
2. Akutt Hippocampus Slice Forberedelse
- Avkjøl ~ 300 ml ACSF for skjæreoperasjonen kammeret, samt for fremstilling ved 4 ° C, mens man hele tiden oxygenating medCARBOGEN. Forbered et lite begerglass med ACSF ved romtemperatur (RT) for stykke lagring, som også oxygenated med CARBOGEN (Reaksjonsskjema figur 1).
- Anesthetize musen under en hette med en liten papirhåndkle fuktet med 1 ml isofluran som legges inn i buret.
- Etter at musa er dypt bedøvet, kuttet hodet av og legg den i en liten skål med iskaldt oksygenert ACSF. Fjern hodebunnen med en liten saks og overføre hode på vev for de påfølgende trinn. Begynn å dissekere hippocampus, som illustrert og beskrevet i figur 1.
- Cut 300-400 mikrometer tykke tverrgående stykker ved lav hastighet (3 mikrometer / sek) og vibrasjonsfrekvensen av 70 Hz i iskald oksygenert ACSF, og overføre dem til et lagringskammer. La stykker resten ved RT i minst 1 time før opptak. Skiver for CA3 eksperimenter lagres 25 minutter ved 34 ° C og minst 30 minutter ved RT, å gjenopprette fra kutting prosessen. 3. Dobbelt opptak av fremkalt Astroglial Currents og Neuronal Felt Potensialer
- Stadig perfuse opptaket kammeret med oksygenrikt ACSF (1,5 til 2 ml / min, RT), inneholdende 100 uM picrotoxin (GABA A antagonist) å isolere eksitatoriske responser. Overføre et stykke på en poly-L-lysin (1,5 til 3 mg / ml) belagt dekkglass, suge væsken for å oppnå en god adhesjon og stykke tilsette en dråpe ASCF oppå stykket. Plasser dekkglass i opptaket kammeret. Blokade av hemmende overføring av picrotoxin kan resultere i epileptiform aktivitet, dvs. spontan, synkron avfyring av nevronale populasjoner, som vil forvrenge måling av fremkalt hendelser. Derfor, for å hindre epileptiform aktivitet, lage enflate snitt (kun overflaten) mellom CA1 og CA3 regionene for å forhindre utbredelsen via Schaffer collaterals (som angitt i figur 2a).
- Stratum radiatum astrocytes kan identifiseres ved sin lille soma størrelse (~ 10 mm) og stellate prosess montering. Velg en celle minst 20-30 mikrometer under stykket overflaten. Montere en glass stimulering elektrode (tips motstand ~ 1 MΩ) på sølvtråd som er koblet til den stimulans isolasjon boksen og jordet til badekaret (simpelthen ved å pakke andre sølvtråd rundt glasset pipette). Plasser stimulering elektroden i Schaffer sikkerheter regionen, som indikert i figur 2A i en avstand på 200-300 mikrometer unna valgte astrocyte. Monter feltopptak elektroden (~ 2-5 MΩ) på et klorert sølvtråd koblet til headstage av forsterkeren. Begge elektrodene er fylt før med ACSF. Velg i multiclamp modus I = 0, som deaktiverer ekstern command inngang og plasseres elektroden ~ 50 mikrometer unna astrocyte inn stratum radiatum regionen (figur 2A). Ta opp svarene med Gain 2 til 10 og filter med en 2 kHz Bessel filter. Elektrisk strøm injeksjon i hjernen skive utløser aksjonspotensialer i de omkringliggende Schaffer sikkerhet axoner og påfølgende sender utgivelsen på den presynaptiske terminaler som prosjekt til postsynaptiske CA1 pyramidale nevroner. De frigitte sendere vil utløse en positiv ladning strømme inn i cellene gjennom postsynaptiske ionotropic reseptorer, som er målbar ekstracellulært som en liten negativ potensial. Dette feltet eksitatorisk postsynaptiske potensial (fEPSP) integrerer aktiviteten av en gruppe samtidig aktive neuroner, mens inhiberende overføring blokkert farmakologisk. Påfør noen test pulser (0,1 msek varighet) til å fremkalle en fEPSP, og noen reposisjonering av stimulering elektroden kan bidra til å øke fEPSP. En typisk CA1 stratum RADIATum fEPSP er illustrert i figur 2B. Nærmere om posisjonering og respons bølgeformer kan bli funnet i Yuan et al. 2003 2. Den fEPSP amplitude i en sunn hippocampus stykke bør vanligvis være mer enn dobbelt så stor som amplituden av fiberen volley. For nøyaktig kvantifisering av fEPSP amplitude eller skråning, bør fremkalt respons være monosynaptisk, som polysynaptic aktivitet (synlig som en multi-peak respons) indikerer synaptiske aktivitet uavhengig av elektrisk stimulering, noe som kan være et tegn for hyperexcitability. For eksperimenter utført i CA3 regionen av hippocampus, er stimulering og registrering pipetter posisjonert som illustrert i figur 3C. Å identifisere mosegrodd fiber innganger, som er sterkt tilrettelegging, parvise puls stimulering (50 msek interpulse intervall) og 1 Hz stimulering i noen sekunder brukes til massivt forbedre utgangspunktet lav amplitude fremkalt fEPSP responses.At sluttenav eksperimentet, DCGIV, en mGluR2 / 3 reseptorantagonist, kan vaskes i å ytterligere verifisere at faktisk mosegrodd fiber innganger ble stimulert. Anvendelse av denne antagonist bør redusere fEPSP ved ~ 90% på grunn av den høye ekspresjon av mGluR2 / 3-reseptorer, inhibering av presynaptisk utgivelse fra mosegrodd fiber BOUTONS.
- Fyll en patch pipette (~ 2-5 MΩ) med filtrert interne løsninger og montere den på en klorert sølvtråd koblet til den andre headstage, påfør overtrykk med en sprøyte, som er koblet via en slange til en pipetteholder. Stadig bruke en 20 ms test puls på 10 mV og flytte pipetten inn i vevet til du kommer til celleoverflaten og en nedbøyning i membranen blir synlig. Null pipetten offset, fjern overtrykk, og klemme membranen til - 80 mV. Vent til en gigaseal (minst 1 GΩ) er nådd (det bør ikke ta mer enn noen sekunder). Lett anvendelse av noen negative trykket kan bidra til å nå agigaseal. Bryte inn i cellen oppnås ved en kort anvendelse av undertrykk eller med zap funksjonen i multiclamp. Start samtidig opptak av Schaffer sivile evoked fEPSP og astroglial respons i spenning klemme (Vhold - 80 mV, frekvens 0,1 Hz, bessel filter 2 kHz, gain 10). Den astroglial nåværende responsen er bifasisk: Først vil du se en rask transient utover gjeldende, noe som gjenspeiler fEPSPs generert av tilstøtende pyramidale celler. Dette etterfølges av en sakte stigende og råtnende innover nåværende (vedvarende flere sekunder (> 10 sek) etter opphør av nevrale responser). Denne strømmen skyldes i hovedsak kalium oppføring i astrocytes, etter utgivelsen av omkringliggende depolariserte postsynaptiske terminaler. En aktiveres samtidig rask transient glutamat transporter strøm (GLT), utløst av presynaptiske glutamat utgivelsen er maskert av kalium strøm. Avholdelse potensial astrocyte, samt tilgang motstanden plasteret bør være monitored hele eksperimentet og bør ikke variere mer enn ~ 20%, for å unngå unøyaktig overvåking av astroglial Réponses følge av endringer i de opptaksforhold. Bare astrocytes med en innledende holding potensial> -70 mV bør undersøkes for å studere friske celler.
- Bytt fra spenning til gjeldende klemme for å registrere fremkalt astrocytic membran depolarisering. Isolere glial glutamat transporter (GLT) gjeldende ved perfusjon av ionotropic glutamat reseptorblokker kynurenic acid (5 mm), inntil fEPSP er fullt blokkert og GLT amplitude har nådd et platå. Å klart identifisere GLT strøm, bruke den spesifikke antagonist DL-threo-β-Benzyloxyaspartatic acid (DL-TBOA, 200 pM). Øk stimulering styrke med 2 ganger til 5 ganger for å spille neuronal og astroglial svar på ulike synaptiske styrke, og bruke to tett linjeavstand stimuli (50 msek intervall) for å undersøke svar på paret puls stimulering. Stabilitet av serien resistance og membranpotensialet av glial celle bør overvåkes hele opptaket.
- Å visualisere utstrekning av gapet-krysset mediert astroglial nettverk bør dye-koblingsdeler eksperimenter utføres i strømtang modus uten strøminjiseringen, aktivere passiv diffusjon av lavmolekylære fargestoffer (<1,5 kDa), som for eksempel sulforhodamine-B, gjennom gap veikryss kanaler. Å minimalisere fargestoff ringvirkninger til omkringliggende vev, bør overtrykk påføres gjennom plasteret pipetten akkurat når inn i vev og plasteret bør nås så snart som mulig.
Vi her beskriver hvordan du tar opp synaptically-evoked astroglial og neuronal svar, dvs. tiltak indusert av synapse aktivering via afference stimulering ved hjelp av et ekstracellulært elektrode.
Representative Results
En representant samtidig registrering av synaptically-fremkalt astroglial og neuronal responser (fEPSPs) i CA1 området av hippocampus er vist i figur 2 AB. Den utløste astroglial nåværende er bifasisk, dvs. det består av en forbigående utover strøm og en langsomt forfalne innover strøm (> 10 sek) (figur 2B). Ytre strøm reflekterer fremkalt fEPSP, og er blokkert når hemming av ionotropic glutamatreseptorer etter kynurenic syre (mørk grå spor, figur 2B) 3. Flertallet av langsom innover gjeldende reflekterer kalium inntreden i astrocyte følgende postsynaptisk depolarisering, siden det også er avskaffet ved kynurenic syre, som hemmer postsynaptiske ionotropic glutamat reseptor aktivitet (figur 2B og fig 2C 1) 3-6, kjent for å representere den største kilde (80%) kalium utgivelsen 7. De resterende raskt økende end råtnende innover strøm hemmes av GLT antagonist DL-TBOA (lysegrå spor, figur 2B og fig 2C 2). Post-hoc subtraksjon av det gjenværende treg strømmen i TBOA (lysegrå spor) fra strømmen i kynurenic syre (mørk grå spor) tillater isolering av den rene astroglial glutamat transportør nåværende (svart spor), som illustrert i figur 2C 2. Vedvarende langsomt råtnende strøm i kynurenic syre og TBOA (lysegrå spor, figur 2B og fig 2C 2) kan bli blokkert av TTX (data ikke vist), og reflekterer sannsynligvis akkumulering av ekstracellulære K + frigjøres under presynaptiske afferent avfyring 3. Moderat enkelt stimulering av Schaffer collaterals induserer en relativt stor synaptically-fremkalt astroglial strøm sammenlignet med små fremkalt depolarisering registrert i den samme cellen (figur 2D). Dette er på grunn avlav membran motstand av astrocytes. Opptak av de synaptically-fremkalt astroglial membranpotensiale dynamikk, som illustrert i figur 2D, er et direkte mål av lokale ekstracellulære kaliumnivå 8. Normalisering av fremkalt astroglial svar på den underliggende nevrale aktiviteten gjør at direkte sammenligning av ulike eksperimenter, som nylig vist 6. Astroglial strømninger kan videre overvåke svært pålitelig endringer i eksitatorisk transmisjon, som den totale synaptically-fremkalt astroglial current følger lineært økningen i fEPSP (figur 2E). Astroglial strømmer også reflektere kortsiktige synaptisk plastisitet, siden de viser, som nevroner, sammen-puls tilrettelegging (Figur 2F). Sammenkoblet hel-celle opptak av et CA1 pyramidal celle og en astrocyte avsløre svært forskjellige elektrofysiologisk atferd i begge celletyper, siden neuron displayet aksjonspotensialer i respons til en depolariserende puls,mens nabolandet astrocyte er lydløs (figur 3A-B). Imidlertid kan moderat stimulering av Schaffer collaterals fremkalle samtidig en hurtig eksitatorisk posynaptic potensial i CA1 pyramidisk cellen og en rask ytre og treg innover strømninger i tilstøtende astrocyte (Figur 3B 2). Dual opptak av synaptically-fremkalt neuronal og astroglial responser kan også bli registrert i CA3 området av hippocampus, som vist i figur 3C. Faktisk vekker enkelt stimulering av CA3 mosegrodd fiber i basal forholdene svært små nevrale responser, innspilt som lokale fEPSPs, knyttet til små raske ytre og treg innover strømninger i astrocytes (figur 3D 1). I kontrast, potensierer 1 Hz stimulering av CA3 mosegrodd fibre i noen sekunder sterkt fEPSP, mens det bare moderat øker astroglial respons (figur 3D 2).
Figur 1. Hippocampus isolasjon å forberede tverrgående skiver. Å dissekere hjernen, kutte scull langs midtlinjen (a). Gjør en koronale snitt på nivå av luktelappen (b) og deretter på nivået av lillehjernen (c). Forsiktig fjerne scull med hjelp av en pinsett (d), skille de to halvkuler med et blad (e), og overføre dem på en liten skje i kald oksygenert ACSF (f). Etter ~ 5 min likevekt, plasserer en halvkule på tørr vev med den mediale overflaten opp (g). Med hjelp av to skjeer fjerne diencephalon (hj). Hippocampus er nå synlig, som illustrert ved de stiplede linjer (k). Dissekere hippocampus med en skje ut, fra fimbria, synlig som hvite strukturen (lm). Overfør hippocampus tilbake inn i den kalde ACSF. Forbered en liten agarose-blokk, posisjon de to hippocampi med alveus side opp og ventrale hippocamposs mot kanten av agar blokken, og suge nøye all væske bort for å tillate en god festing til agar (n). Lim hippocampus festet til agar blokken bort ventrale delen (o).
Figur 2. Samtidige neuronal og astroglial svar fremkalt-synaptically i CA1 område av hippocampus. A) Reaksjonsskjema for hippocampus stykke illustrerer arrangementet av den stimulerende elektrode, å aktivere Schaffer collaterals (SC), lappen pipette elektrode, for å spille inn astrocytic strømninger, og ekstracellulære elektroden, for å spille inn fEPSP, fremkalt av SC stimulering i hippocampus CA1 området. B) Representative spor av samtidige opptak av fEPSPs (øvre panel) og astrocytic strøm (nedre panel) vakte-synaptically av SC stimulering i presence av farmakologiske stoffer. Svarene blir først registrert i nærvær av en GABA A reseptorblokker (picrotoxin, 100 uM, svart spor) for å isolere eksitatoriske responser. Etterfølgende anvendelse av et ionotropic glutamat reseptorblokker (kynurenic syre, 5 mM, mørkegrå spor), hemmer fEPSP og hoveddelen av den langvarige astroglial strøm, avsløre en liten og hurtig transient komponenten av astrocytic gjeldende respons, som er følsomme for en glutamat transporter blocker (TBOA, 200 pM, lys grå spor). Målestokk, 0,1 fEPSP mV, astrocytic dagens 15 pA, 10 millisekunder. C 1). Sample spor av astroglial kalium gjeldende (1-2), som kan isoleres fra den fremkalt respons, vist i B (lavere panel, svart spor), ved å subtrahere den nåværende komponent gjenværende i kynurenic syre (2) fra den totale strøm ( 1). Målestokk, 20 Pa, 1 sek. C 2) Eksempel spor av glutamat transporter gjeldende (2-3), erholdt ved subtraksjon av TBOA jegnsensitive treg komponent (3) fra strømmen i kynurenic syre (2). Målestokk, PA 2.5, 25 msek. D) Eksempel spor innover strøm opp i spenning-klemme (nedre panel) og den tilsvarende membran depolarisering nedtegnet i nåværende-klemme (øvre panel) indusert i en astrocyte av SC stimulering. Skala bar, strøm-klemme 1,5 mV, spenning-klemme 5 pA, 1 sek. E) input-output kurver illustrerer forholdet mellom den presynaptiske fiber volleys (inngang) og det totale astroglial strøm (utgang) registreres samtidig i respons til SC stimulering (n = 6). De astroglial strømmen øker lineært med den økte fiber volleys, som neuronal fEPSP. F) Eksempel spor av nerveaktivitet (fEPSP) og astrocytic strøm er vist for parvise puls stimulering på en 40 msek interpulse intervall. De synaptically-fremkalt astroglial aktuelle utstillinger, som nevroner, parvise puls tilrettelegging. Målestokk, 0,1 mV, 5 pA, 20 ms.
Figur 3. Dual opptak av synaptically-indusert neuronal og astroglial svarene i CA1 og CA3 områder av hippocampus. A) Rekonstruksjon av en CA1 pyramidal celle injisert med sulforhodamine-B (rød, 0,1%) og en astrocyte fylt med fluorescein dekstran (grønn, 0,1%), ved hjelp av hel-celle patch-clamp teknikken. Skala bar, 10 mikrometer. B 1) Representative spor av samtidige hel-celle opptak av membran potensialene registrert i current-klemmen fra en CA1 pyramidal celle og en tilstøtende astrocyte. Neuronal aksjonspotensial avfyring (svart spor), fremkalt av injeksjon av en 20 pA depolariserende nåværende puls, fremkaller ingen respons i det tilstøtende astrocyte (grå spor). Målestokk, 20 mV, 10 pA, 100 msek. B 2) Eksempel spor av to hel-celle opptak av en CA1 pyramidal celle i gjeldende-muslingp og en nærliggende astrocyte i spenning-klammeret etter SC stimulering i nærvær av picrotoxin (100 uM). SC stimulering fremkaller en eksitatoriske postsynaptiske potensial (EPSP, svart spor), knyttet til en liten og langvarig astrocytic strøm (grå spor). Målestokk, 5 mV, 10 pA, 100 msek. C) Scheme av hippocampus skive som viser i dentate gyrus (DG) og CA3 områder sammenstilling av den stimulerende elektrode, for å aktivere mosegrodd fiber, lappen pipette elektrode (grå), for å ta opp astrocytic strøm, og den ekstracellulære elektroden, til rekord fEPSP, fremkalt av CA3 mosegrodd fiber stimulering. D, E) Representative spor av sammenkoblede opptak av CA3 fEPSPs (øvre paneler, svarte spor i D 1 og D 2) og astrocytic hel-celle responser (nedre paneler, grå spor i D 1 og D 2) til én stimulering av CA3 mosegrodd fibre ved 0,02 Hz (zoom i det innfelte) (D 1), eller ved 1 Hz stimulering frekvens (D 2). Målestokk for D
Discussion
Dual innspilling av synaptically-indusert neuronal og glial svar er en nyttig metode for å studere på nettet endringer i pre-og postsynaptiske aktiviteter knyttet til endringer i astroglial egenskaper. Den synaptically-fremkalt glial membran depolarisering er et direkte mål på den ekstracellulære kalium stige 8, delvis på grunn av presynaptiske aksjonspotensiale avfyring, men mest for å postsynaptiske depolarization 7. Derfor opptak av glial membranpotensiale dynamikk kan brukes til å undersøke modifikasjoner i presynaptiske eksitabilitet, postsynaptiske aktivitet, ekstracellulære rommet volum og kalium buffermuligheter kapasiteter 6, 8. Den astroglial glutamat transporter strøm er en følsom mål på presynaptisk glutamat utgivelsen, i stand til å overvåke kortsiktige endringer i utgivelsen sannsynlighet 3, 5, 9. Det kan videre brukes til å karakterisere de funksjonelle synapse-gliaceller interaksjoner på forskjellige synapser eller på forskjellige utviklingsmessige stalderen 10. Det bør understrekes at GLTs er svært temperaturavhengig følsomme 11 og er drevet av den elektrokjemiske gradient av Na +, K + og H 12. Dermed amplituden og kinetikk av GLT gjeldende sterkt avhenge valgte forsøksbetingelser. Videre, er den faktiske tidsforløpet av astroglial glutamat klaring avledet fra det innspilte GLT var kjent å være delvis uklart. Dette skyldes filtreringen av GLT strømmer av faktorer som de electrotonic egenskaper astrocytes eller asynkron senderen utgivelse, som vrir sine kinetikk 13. Metoder utpakking av temporale funksjonene filtreringselementene mekanismer er blitt utviklet og kan brukes til å utlede den faktiske glutamat clearance tidsforløpet i fysiologiske eller patologiske situasjoner, som recenly utført 6,13,14. I tillegg er samtidig opptak av astroglial membran depolarisering, i strømtang, kan gi insigHTS til mulige endringer av ekstracellulære kalium transienter. Enkelt astrocytes kontakte opp til 100.000 synapsene ~ 100 forskjellige nevroner, og trenger derfor integrere og modulere aktiviteten til lokale nevrale nettverk.
Når du bruker teknikken som presenteres her, dvs. opptak elektrofysiologiske hel-celle responser fra astrocytes å få innsikt i basal synaptic aktivitet, bør man huske på at i astrocytes, patch-clamp opptak på soma nivå tillate oppdage strømmer det meste stammer fra cellen soma eller proksimale prosesser. Faktisk, strømmene detektert ved soma bare delvis stammer fra fine distale prosesser når en sterk aktivering av reseptorer og kanaler opptrer i flere fin prosesser kan generere strøm forplanter til cellen soma. Dermed basal reseptor og kanal aktivitet i enkelte små astroglial prosesser som dekker synaptiske seksjonene er knapt synlig. Dette skyldes delvis den begrensede spyttetial og tidsmessige kontroll av membran strømmer og spenninger etter hel-celle patch-clamp opptak fra astrocytes i situ. Imidlertid bør det bemerkes at overflaten av rikelig ørsmå astrocytic prosesser overstiger langt membranen området Soma og viktigste prosesser. I tillegg er disse perisynaptic astroglial microdomains inneholder funksjonelt relevant reseptorer og kanaler, noe som trolig spiller en viktig rolle i neuroglial kommunikasjon og synaptisk regulering. Teknikken vi presentert her er derfor hovedsakelig nyttig å studere astrocytic integrering av synkron aktivitet fra nevrale ensembler, forekommer særlig i afference stimulering. Det bør ikke brukes til å studere dialogen mellom individuelle synapser og tilstøtende fin astrocytic prosesser som oppstår under basal spontan aktivitet. En alternativ metode for å studere lokale astroglial responser indusert av basal synaptiske aktivitet ville være å utføre patch-clamp innspillinger fra fine prosesser, som den i dendritter 15. Selv patching disse fine astroglial prosessene er sannsynligvis utfordrende på grunn av sin lille størrelse, er det sannsynligvis en vei å forfølge å rakne mer intimt dialog mellom astroglial microdomains og individuelle synapser. Imidlertid kan de sannsynlige små elektrofysiologiske astroglial responser resulterer fra individuelle fin astroglial prosesser være under terskel deteksjon, siden elektrisk støy når i gjennomsnitt 3-5 pA i patch-clamp-opptak. En annen metode for å studere astroglial svar på synaptic aktivitet er kalsium bildebehandling, siden aktivering av astrocytic membran reseptorer eller transportører av neuroactive stoffer kan utløse intracellulære kalsium transienter. Imidlertid kan bulk lasting av astrocytes med kalsium indikatorer også gjenspeiler i hovedsak somatiske aktivitet 16. Kombinasjonen av elektrofysiologi og kalsium avbildning muliggjør også detektere små kalsium signaler fra fine astroglial prosesser, enten forekommende spontant eller utløst by minimal synaptisk stimulering 17, 18.. Imidlertid bør man huske på at høy affinitet kalsium indikatorer kan opptre som kalsium buffere, hemme viktige kalsium signalveier, mens lav affinitet indikatorer kan fungere under deteksjonsgrensen. Endelig består en elegant og ikke-invasiv teknikk for å studere kalsium hendelser i fine astrocytic prosesser, som også omgår utvasking av intracellulære signalmolekyler under hel-celle patch-clamp, i å bruke en membran målrettet kalsium sensor, som kan uttrykkes i astrocytes in situ, samt in vivo 19. Men kan kalsium bildebehandling bare gi informasjon om en signalering molekyl, som er involvert i mange, men ikke alle celleaktiviteter, mens hel-celle patch-clamp gir kvantitativ informasjon om alle de forskjellige ioniske strømninger utløst ved kanalen og reseptor aktivering. Derfor samtidige elektrofysiologiske opptak fra nevroner og astrocyteser en unik og kraftig metode for å løse online dynamikken i neuroglial ionisk signalering og dens rolle hjernen informasjonsbehandling.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dana Kamalidenova, Morgan Autexier, og Roch Chopier, som gjorde video og animasjoner, samt Florian Beck for fotografier og post-produksjon av video voice-over. Dette arbeidet ble sponset av Olympus og støttet med tilskudd fra HFSPO (Career Development Award), ANR (Programme Jeunes chercheurs og Program Blanc Neurosciences), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM og La Pitié Salpêtrière sykehus (Translasjonell forskning kontrakt) til NR, fra fransk forskning departementet og Deutsche Forschungsgemeinschaft postdoc stipend til UP, og fra doktorgrads skolen "Frontiers i Life Science", Paris Diderot University, Bettencourt Schuller fundament, og FRM (Fondation pour la Recherche Medicale) doc til JS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
- Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
- Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
- Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
- Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
- Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
- Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
- Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).
