Summary
Framställningen av akuta hjärnsnitt från isolerad hippocampi, liksom de samtidiga elektrofysiologiska inspelningar av astrocyter och neuroner i
Abstract
Astrocyter bildar tillsammans med nervceller trepartsöverenskommelser synapser, där de integreras och modulera neuronal aktivitet. Faktum astrocyter känner neuronala ingångar genom aktivering av sina jonkanaler och receptorer neurotransmittorer, och bearbeta information dels genom verksamheten beroende frisättning av gliotransmitters. Vidare, astrocyter är den huvudsakliga upptagningssystemet för glutamat, bidra till kalium rumslig buffring, liksom till GABA clearance. Dessa celler därför ständigt övervaka synaptisk aktivitet och är därmed känsliga indikatorer för förändringar i synaptiskt-utsläppt glutamat, GABA och extracellulära kaliumnivåerna. Dessutom kan förändringar i astrogliala upptag aktivitet eller buffertkapacitet har allvarliga effekter på neuronala funktioner och kan förbises när kännetecknar fysiopatologiska situationer eller möss knockout. Dubbel inspelning av neuronala och astrogliala verksamhet är därför en viktig metod för att studera förändringar isynaptisk styrka att samtidig förändringar i astrogliala upptag och kapacitet buffring. Här beskriver vi hur du förbereder hippocampus skivor, hur man identifierar stratum radiatum astrocyter och hur att spela samtidigt neuronala och astrogliala elektrofysiologiska svar. Dessutom beskriver vi hur du isolerar farmakologiskt de synaptiskt-framkallade astrogliala strömmar.
Protocol
1. Beredning av artificiell cerebrospinalvätska och intracellulär lösning
- Före start av experimentet, måste man förbereda inre lösningen för inspelningar patch clamp, liksom artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) för hippocampus beredningen. Du kommer dessutom att behöva en dissektion kit bestående av kirurgisk sax och fina iris sax, två spatlar och pincetter (Fine Science Tools), ett glas gasning enhet (mikrofilter ljus, Robu Tyskland) och vävnad rutnät (myggnät eller nylon tight), liksom superlim (Uhu Dent). Konfigurationen av elektrofysiologi skiva plåstret installationen beskrevs av Finkel & Bookman, 2001 1.
- För den inre lösningen, lös (i mM): 105 K-glukonat, 30 KCl, 10 HEPES och 0,3 EGTA i avjoniserat vatten (i 70-80% av den slutliga volymen). Kyl lösningen till 4 ° C och tillsätt (i mM): 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris och 10 fosfokreatin. Justera pH till 7,4 med KOH och fyllning up med avjoniserat vatten till den slutliga volymen. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtrera denna lösning (porstorlek 0,2 pm). Alikvoterades lösning är stabil under 3-4 veckor vid - 20 ° C. För en experimentell dag, är ~ 1 ml intern lösning behövs.
- Om inte annat anges, innehåller ACSF används för hippocampus beredning och inspelningar av celler i CA1 regionen, (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCb 2, 1,3 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCOs 3 och 11 glukos. Lös dessa salter i avjoniserat vatten (Osmolaritet ~ 320 mOsm) och syresätta denna lösning under åtminstone 10 minuter (pH ~ 7,3 till 7,4) med karbogen (95% O 2 och 5% CO 2). Bered minst 1 liter lösning per experiment. Särskild försiktighet bör iakttas för framställning av hippocampusvävnad som ska användas för att utföra experiment i CA3-regionen av hippocampus. Det är denna region utsatt för epileptiform aktivitet och efterföljande neuronal död. Således synaptic verksamhet bör vara starkt reduceras under skiva förberedelse och detta uppnås genom att utföra hippocampus dissektion i iskall sackaroslösning innehållande (i mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCOs 3, 10 Glukos och 75 sackaros. I denna lösning, en kombination av låg natrium, låg kalcium och höga koncentrationer magnesium minskar massivt presynaptisk bränning och frisättning sannolikhet, liksom postsynaptisk NMDA-receptoraktivitet, vilket minimerar spontan aktivitet och celldöd. Efter beredning hippocampala skivor som används för inspelningar av celler från CA3 regionen perfunderades med modifierad ACSF, innehållande 4 mM CaCla 2 och 4 MgSO 4, för att minimera polysynaptiska aktivitet.
2. Akut Hippocampus skiva Förberedelser
- Kyl ned ~ 300 ml ACSF för skivning kammaren, liksom för framställningen vid 4 ° C, medan konstant syresättande medkarbogen. Förbered en liten bägare med ACSF vid rumstemperatur (RT) för segment lagring, vilket också är syresatt med karbogen (Schema Figur 1).
- Söva musen under en huva med en liten pappershandduk indränkt med 1 ml isofluran som läggs in i buren.
- Efter musen är djupt sövda, skär huvudet av och lägg till det direkt i en liten skål med iskallt syresatt ACSF. Ta hårbotten med en liten sax och överföra huvudet på vävnaden för efterföljande steg. Börja att dissekera hippocampus, såsom visas och beskrivs i figur 1.
- Skär 300-400 nm tjocka tvärgående skivor vid låg hastighet (3 um / sek) och vibrationsfrekvens av 70 Hz i iskallt syresatt ACSF, och överföra dem till en förrådskammare. Låt skivor vila vid RT under minst 1 timme före inspelning. Segment för CA3 experiment lagras 25 minuter vid 34 ° C och minst 30 min vid RT, för att återhämta sig från skivning processen. 3. Dubbel inspelning av Evoked astrogliala Currents och neuronala Potentials Field
- Ständigt perfundera inspelningen kammaren med syresatt ACSF (1.5-2 ml / min, RT), innehållande 100 | iM pikrotoxin (GABA A-antagonist) för att isolera excitatoriska svar. Överför en skiva på en poly-L-lysin (1,5 till 3 mg / ml) belagt täckglas, blöt vätskan för att uppnå en god bit vidhäftning och tillsätt en droppe ASCF ovanpå skivan. Placera täckglaset i inspelningen kammaren. Blockad av hämmande överföring genom pikrotoxin kan resultera i epileptiform aktivitet, dvs spontan, synkron bränning av neuronala populationer, vilket kommer att störa mätningen av framkallade händelser. Således, för att förhindra epileptiform aktivitet, gör enplatt snitt (endast ytan) mellan de CA1 och CA3 regioner för att förhindra spridning via Schaffer säkerheter (såsom visas i figur 2a).
- Stratum radiatum astrocyter kan identifieras genom sin ringa storlek soma (~ 10 | im) och stellate processen montering. Välj en cell minst 20-30 um under skiva yta. Montera en elektrod glas stimulering (spets motstånd ~ 1 MQ) på silvertråden som är ansluten till stimulus isolering rutan och jordade till badet (helt enkelt genom att linda den andra silvertråden runt glaspipett). Placera stimuleringselektroden i Schaffer säkerheter regionen, som visas i figur 2A på ett avstånd av 200-300 um bort från den valda astrocyt. Montera elektroden fältet inspelning (~ 2-5 MQ) på en klorerad silvertråd ansluten till huvudsteg av förstärkaren. Båda elektroderna är fyllda innan med ACSF. Välj i multiclamp det läge I = 0, vilket inaktiverar extern komefterfrågan ingång och placera elektroden ~ 50 pm från astrocyt in i stratum radiatum regionen (figur 2A). Registrera svaren med Gain 2 till 10 och filter med en 2 kHz Bessel-filter. Elektrisk ström injektion i hjärnan skiva utlöser aktionspotentialer i de omgivande Schaffer säkerheter axoner och efterföljande transmittorfrisättning vid presynaptiska terminaler som projekt till postsynaptiska CA1 pyramidala nervceller. De frigjorda sändare kommer att utlösa en positiv laddning flöde in i cellerna genom postsynaptiska jonotropa receptorer, vilket är mätbar extracellulärt som en liten negativ potential. Detta fält excitatoriska postsynaptiska potentialen (fEPSP) integrerar verksamhet av en grupp samtidigt aktiva nervceller, medan hämmande överföring blockeras farmakologiskt. Tillämpa vissa testpulser (0,1 msek varaktighet) för att framkalla en fEPSP, vissa ompositionering av stimuleringselektroden kan bidra till att öka fEPSP. En typisk CA1 stratum Radiatum fEPSP illustreras i figur 2B. Ytterligare information om positionering och svarsvågformer kan hittas i Yuan et al. 2003 2. Den fEPSP amplitud i en frisk hippocampus skiva bör vanligtvis vara mer än dubbelt så stor som amplituden av fiber volley. För noggrann kvantifiering av fEPSP amplitud eller lutning, bör framkallade respons vara monosynaptiska eftersom polysynaptiska aktivitet (detekterbar som en multi-topp respons) indikerar synaptisk aktivitet oberoende av elektrisk stimulering, vilket kan vara ett tecken för hyperexcitabilitet. För experiment utförda i CA3-regionen av hippocampus, är stimulering och pipetter inspelning placerad såsom visas i fig 3C. Att tydligt identifiera mossiga fiber ingångar, som är starkt underlättar, parade pulsstimulering (50 ms interpulse intervall) och 1 Hz stimulering under några sekunder tillämpas på kraftigt förbättra initialt låg amplitud framkallat fEPSP responses.At slutetav experimentet, DCGIV, en mGluR2 / 3 receptorantagonist, kan tvättas i att ytterligare verifiera att faktiskt mossiga fiber insatsvaror som stimuleras. Tillämpning av denna antagonist bör minska fEPSP med ~ 90% på grund av den högt uttryck av mGluR2 / 3 receptorer, hämma presynaptisk frisättning från mossiga fiber boutons.
- Fyll en patch-pipett (~ 2-5 MQ) med filtrerad intern lösning och montera den på en klorerad silvertråd ansluten till den andra huvudsteg, tillämpa positivt tryck med en spruta, som är ansluten via slangen till pipetthållare. Ständigt tillämpa ett 20 ms testpuls av 10 mV och flytta pipetten i vävnaden tills du kommer till cellytan och en omläggning i membranet blir synlig. Nollställ pipetten offset, ta det positiva trycket och klämma membranet till - 80 mV. Vänta tills en gigatätning (minst 1 GΩ) har uppnåtts (det bör inte ta längre tid än några sekunder). Gentle tillämpning av vissa undertryck kan bidra till att nå agigaseal. Bryta sig in i cellen uppnås genom en kort applicering av negativt tryck eller med hjälp av ZAP funktionen i multiclamp. Starta samtidig inspelning av Schaffer säkerheter framkallat fEPSP och astrogliala responsen i spänning klämma (Vhold - 80 mV, frekvens 0,1 Hz, Bessel-filtret 2 kHz, förstärkning 10). Den astrogliala nuvarande svaret är bifasisk: först kommer du att se en snabb transient utåt ström, vilket återspeglar fEPSPs genereras av intilliggande pyramidala celler. Detta följs av ett långsamt stigande och avtagande inåt löpande (bestående flera sekunder (> 10 sek) efter avslutad neuronala svar). Denna ström beror främst på kalium inträde i astrocyter, efter utsläpp av omgivande depolariserade postsynaptiska terminaler. En aktiveras samtidigt snabb transient glutamat transportör ström (GLT), utlöst av presynaptisk glutamatfrisättning maskeras av kalium strömmen. Den hållpotential av astrocyt, liksom tillgång hos plåstret bör monitored under hela experimentet och får inte variera mer än ~ 20%, för att undvika felaktiga övervakning av astrogliala REPONSES grund av förändringar i inspelningsförhållandena. Endast astrocyter med en initial innehav potential> -70 mV bör utredas för att studera friska celler.
- Växla från spänning till ström-clamp för att spela in den framkallade astrocytisk membrandepolarisering. Isolera glia glutamat transportör (GLT) ström genom perfusion av jonotropa glutamat receptorblockerare kynurensyra (5 mM), tills fEPSP är helt blockerad och GLT amplituden har nått en platå. Att tydligt identifiera GLT strömmen, tillämpa den specifika antagonisten DL-treo-β-Benzyloxyaspartatic syra (DL-TBOA, 200 M). Öka stimulering styrkan med 2-faldig till 5-faldig spela neuronala och astrogliala svar på olika synaptisk styrka och tillämpa två tätt placerade stimuli (50 msek intervall) för att undersöka svar på parad puls stimulering. Stabilitet av serie Resistance och membran potential gliacell bör övervakas under hela inspelningen.
- För att visualisera graden av gap-förbindelsen medierad astrogliala nätverk, bör färg-kopplingsmedel experiment utföras i strömtång läge, utan att någon ström injektion, för att möjliggöra passiv diffusion av lågmolekylära färgämnen (<1,5 kDa), såsom sulforodamin-B-, genom gap junction kanaler. För att minimera färg spridningseffekter in i den omgivande vävnaden, bör övertryck appliceras genom plåstret pipetten just när du anger vävnaden och plåstret bör nås så snart som möjligt.
Vi beskriver här hur du spelar in synaptiskt-framkallat astrogliala och neuronala svar, dvs svar som induceras av synaps aktivering genom afference stimulering med hjälp av en extracellulär elektrod.
Representative Results
En representativ samtidig inspelning av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar (fEPSPs) i CA1-området av hippocampus visas i figur 2 AB. Den framkallade astrogliala strömmen är bifasisk, dvs den består av en transient ström utåt och en långsamt avklingande inåt ström (> 10 sek) (Figur 2B). Den utåtriktade strömmen återspeglar framkallat fEPSP och blockeras efter hämning av jonotropa glutamatreceptorer av kynurensyra (mörkgrå spår, figur 2B) 3. Majoriteten av den långsamma inre strömmen reflekterar kalium inträde i astrocyt efter postsynaptiska depolarisation, eftersom den också avskaffas av kynurensyra, vilket inhiberar postsynaptisk aktivitet jonotropa glutamatreceptor (Figur 2B och Figur 2C 1) 3-6, känd för att representera den största källa (80%) av kalium frisättning 7. Den återstående stiger snabbt end. avklingande inåt ström inhiberas av GLT antagonisten DL-TBOA (ljusgrå spår, figur 2B och figur 2C 2). Post-hoc subtraktion av den återstående långsamma strömmen i TBOA (ljusgrå spår) från strömmen i kynurensyra (mörkgrå spår) medger isolering av den rena astrogliala glutamat transportör ström (svart spår), såsom illustreras i figur 2C 2. Den ihållande ruttnande sakta ström i kynurensyra och TBOA (ljusgrå spår, figur 2B och figur 2C 2) kan blockeras av TTX (data ej visade), och återspeglar troligen ackumuleringen av extracellulär K + frisätts under presynaptisk afferent bränning 3. Måttlig enda stimulering av Schaffer säkerheter inducerar en relativt stor synaptiskt-framkallade astrogliala ström jämfört med den lilla framkallade depolarisationen registreras i samma cell (Figur 2D). Detta beror på attlågt membran hos astrocyter. Inspelning av synaptiskt-framkallade astrogliala dynamik membranpotentialen, såsom illustreras i figur 2D, är ett direkt mått på lokal extracellulära kaliumnivåer 8. Normalisering av framkallade astrogliala svar på den underliggande neuronala aktiviteten tillåter direkt jämförelse av olika experiment, vilket har framgått 6. Astrogliala strömmar kan vidare övervaka mycket tillförlitligt förändringar i excitatorisk överföring, eftersom den totala synaptiskt-framkallade astrogliala ström följer linjärt ökningen i fEPSP (figur 2E). Astrogliala strömmar också spegla kortsiktiga synaptisk plasticitet, eftersom de visar, som nervceller, parad-puls underlätta (figur 2F). Parat hel-cell inspelning av en CA1 pyramidal cell och en astrocyt avslöjar mycket olika elektrofysiologiska beteende i båda celltyperna, eftersom neuron potentialer displayen åtgärder som svar på en depolariserande puls,medan den angränsande astrocyt är tyst (Figur 3A-B). Däremot kan måttlig stimulering av Schaffer säkerheter frammanar samtidigt en snabb excitatorisk posynaptic potential i CA1 pyramidala celler och snabb utåt och långsamt inåt strömmar i angränsande astrocyt (Figur 3B 2). Dubbla inspelningar av synaptiskt-framkallade neuronala och astrogliala reaktioner kan också registreras i CA3 området av hippocampus, såsom visas i fig. 3C. I själva verket framkallar enda stimulering av CA3 mossiga fibrer i basala förhållanden mycket små neuronala svar, redovisas som lokala fEPSPs, associerade till små snabba utåt och långsamt inåt strömmar i astrocyter (figur 3D 1). I motsats, potentierar 1 Hz stimulering av CA3 mossiga fibrer för några sekunder starkt fEPSP, medan den endast måttligt ökar astrogliala responsen (figur 3D 2).
Figur 1. Hippocampus isolering för att förbereda tvärgående skivor. Att dissekera hjärnan, skär skalle längs mittlinjen (a). Gör ett koronalt snitt vid nivån för luktloben (b) och därefter på nivån av lillhjärnan (c). Ta försiktigt bort skallen med hjälp av en tång (d), separera de två halvkloten med blad (e), och överföra dem på en liten sked i kallt syresatt ACSF (f). Efter ~ 5 minuter jämvikt, placera en hemisfär på torra vävnad med den mediala ytan uppåt (g). Med hjälp av två skedar bort diencefalon (HJ). Hippocampus är nu synlig, såsom visas med de streckade linjerna (k). Dissekera hippocampus med en sked ut, utgående från fimbria, syns som vita strukturen (LM). Överför hippocampus tillbaka i det kalla ACSF. Förbered en liten agaros-block, placera två hippocampi med alveus uppåt och den ventrala hippocampvi inför kanten av agar blocket, och dra försiktigt all vätska bort för att tillåta en god fastsättning på agar (n). Limma hippocampus fäst agar blocket på den ventrala delen (o).
Figur 2. Samtidig neuronala och astrogliala svar framkallade-synaptiskt på CA1-området i hippocampus. A) systematiken i hippocampus skiva illustrerar arrangemanget av den stimulerande elektroden, för att aktivera Schaffer säkerheter (SC), plåstret pipetten elektroden, för att spela in astrocytiska strömmar och den extracellulära elektroden, för att spela in fEPSP, framkallade av SC stimulans i hippocampus CA1 område. B) Representativa spår av samtidiga inspelningar av fEPSPs (övre panelen) och astrocytiska strömmar (undre panelen) framkallat-synaptiskt av SC-stimulering i presence av farmakologiska läkemedel. Svaren först registreras i närvaro av en GABAA-receptor-blockerare (pikrotoxin, 100 pM, svarta spår) för att isolera excitatoriska svar. Efterföljande applicering av en jonotropa glutamat receptorblockerare (kynurensyra, 5 mM, mörkgrå spår), inhiberar fEPSP och den större delen av den långvariga astrogliala ström, avslöja en liten och snabb transient komponent i astrocytiska strömresponsen, vilket är känsliga för en glutamat transportör blockerare (TBOA, 200 M, ljusgrå spår). Skala bar, fEPSP 0,1 mV, astrocytiska ström 15 Pa, 10 msek. C 1). Prov spår av astrogliala kalium ström (1-2), som kan isoleras från det stimulerade svaret, som visas i B (nedre panelen, svart spår), genom att subtrahera den aktuella komponenten kvar i kynurensyra (2) från den totala strömmen ( 1). Skala bar, 20 Pa, 1 sek. C 2) Exempel spår av glutamat transportör ström (2-3), som erhålls genom subtraktion av TBOA Insensitive långsam komponent (3) från strömmen i kynurensyra (2). Skala bar, 2,5 pA, 25 msek. D) Exempel spår av en inre ström som registreras i spänning-klämma (nedre panelen) och motsvarande membrandepolarisering in i ström-klämma (övre panelen) induceras i en astrocyt av SC-stimulering. Skala bar, ström-klämma 1,5 mV, spänning-clamp 5 pA, 1 sek. E) Input-output kurvor som illustrerar förhållandet mellan presynaptiska fibrer salvor (ingång) och den totala astrogliala ström (utgång) in samtidigt som svar på SC-stimulering (n = 6). De astrogliala strömmen ökar linjärt med ökad fiber salvor, som neuronala fEPSP. F) Exempel spår av neuronala svar (fEPSP) och astrocytisk strömmen visas för parade pulsstimulering på 40 ms interpulse intervall. De synaptiskt-framkallade astrogliala aktuella utställningar, som nervceller, parade puls underlätta. Skala bar, 0,1 mV, 5 Pa, 20 msek.
Figur 3. Dubbla inspelningar av synaptiskt-inducerade neuronala och astrogliala svar i CA1 och CA3 områden hippocampus. A) Rekonstruktion av en CA1 pyramidal cell injiceras med sulforodamin-B (röd, 0,1%) och en astrocyt fylld med fluorescein dextran (grön, 0,1%), med användning av helcell-patch-clamp-tekniken. Skala bar, 10 um. B 1) Representativa spår av samtidiga hel-cell inspelningar av membranpotentialer inspelade i ström-clamp från en CA1 pyramidal cell och en angränsande astrocyt. Neuronal aktionspotential bränning (svart spår), framkallad genom injektion av en 20 pA depolariserande strömpuls, framkallar något svar i angränsande astrocyt (grå spår). Skala bar, 20 mV, 10 Pa, 100 msek. B 2) Exempel spår av dubbla hel-cell inspelningar av en CA1 pyramidal cell i ström-musslap och en angränsande astrocyt i spänning-clamp efter SC-stimulering i närvaro av pikrotoxin (100 iM). SC stimulering framkallar en excitatorisk postsynaptisk potential (EPSP, svart spår), associerad med en liten och varaktig astrocytiska ström (grå spår). Skala bar, 5 mV, 10 Pa, 100 msek. C) systematiken i hippocampus skiva visar i gyrus dentatus (DG) och CA3 områden arrangemanget av stimulerande elektroden för att aktivera mossiga fibrer plåstret pipetten elektroden (grå), för att spela in astrocytiska strömmar och den extracellulära elektrod, till rekord fEPSP, framkallad av CA3 mossiga fibrer stimulering. D, E) Representativa spår av parade inspelningar av CA3 fEPSPs (övre paneler, svarta spår i D 1 och D 2) och astrocytiska hel-cell svar (lägre paneler, grå spår i D 1 och D 2) till enkel stimulering av CA3 mossiga fibrerna vid 0,02 Hz (zooma in den infällda) (D 1) eller vid 1 Hz frekvens stimulering (D 2). Skala bar för D
Discussion
Dubbel inspelning av synaptiskt-inducerade neuronala och gliaceller svar är en användbar metod för att studera på nätet förändringar i pre-och postsynaptiska verksamhet i samband med förändringar i astrogliala egenskaper. Den synaptiskt-framkallade gliaceller membrandepolarisering är ett direkt mått på den extracellulära kalium ökningen 8, delvis på grund av presynaptiska aktionspotentialen bränning, men mest till postsynaptiska depolarisation 7. Därför inspelningar av gliala dynamik membran potential kan användas för att undersöka förändringar i presynaptiska retbarhet, postsynaptiska aktivitet, extracellulära utrymmet volym och kalium kapacitet buffrande 6, 8. Den astrogliala glutamat transportör ström är ett känsligt mått på presynaptisk glutamatfrisättning, kunna övervaka kortsiktiga förändringar i utsläpp sannolikhet 3, 5, 9. Det kan vidare användas för att karakterisera de funktionella synaps-glia växelverkan vid olika synapser eller i olika utvecklingsmässiga måldrarna 10. Det bör framhållas att GLTs är mycket temperaturkänsliga 11 och drivs av den elektrokemiska gradienten för Na +, K + och H 12. Således amplituden och kinetik av GLT strömmen beror mycket på de valda experimentella förhållanden. Vidare, är den faktiska tiden under astrogliala glutamat clearance härledd från den inspelade GLT strömmen känt att delvis skymd. Detta beror på filtrering av GLT strömmar av faktorer såsom electrotonic egenskaper astrocyter eller den asynkrona sändaren release, som snedvrider deras kinetik 13. Metoder utvinna de tidsmässiga funktioner i filtreringsmekanismer har utvecklats och kan användas för att härleda de faktiska glutamat kursen clearance tid i fysiologiska eller patologiska situationer, som recenly utförs 6,13,14. Dessutom samtidig inspelning av astrogliala membrandepolarisering i strömtång, kan ge obetydhts av möjliga förändringar av extracellulära kalium transienter. Enstaka astrocyter kontakt upp till 100.000 synapser ~ 100 olika neuroner, och gör därför integrera och modulerar aktiviteten av lokala neuronala nätverk.
När du använder tekniken presenteras här, dvs inspelning elektrofysiologiska hel-cell svar från astrocyter att få insikt i basala synaptisk aktivitet bör man ha i åtanke att i astrocyter, patch-clamp inspelningar på soma nivå kan upptäcka strömmar huvudsakligen härrör från cellen soma eller proximala processer. Faktum strömmar upptäckts vid somat endast delvis härrör från fina distala processer när en kraftig aktivering av receptorer och kanaler som förekommer i flera fina processer kan generera strömmar propagerar till cellen soma. Sålunda basala receptor och kanalaktivitet i enskilda små astrogliala processer omfattar synaptiska fack är knappast detekterbar. Detta beror delvis på den begränsade musselyngelIAL och tidsmässiga reglering av membran strömmar och spänningar genom hel-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter in situ. Emellertid bör det noteras att ytan av de rikliga små astrocytiska processer överskrider vida den membranarean av soma och viktigaste processerna. Dessutom är dessa perisynaptic astrogliala mikroområden innehåller funktionellt relevanta receptorer och kanaler, vilket troligen spelar en viktig roll i neuroglial kommunikation och synaptisk reglering. Tekniken vi presenterade här är därför mest användbar för att studera astrocytisk integration av synkron aktivitet från neuronala ensembler, som förekommer i synnerhet under afference stimulering. Det bör inte användas för att studera dialogen mellan enskilda synapser och angränsande fina astrocytiska processer som inträffar under basal spontan aktivitet. En alternativ metod för att studera lokala astrogliala svar som induceras av basala synaptisk aktivitet skulle vara att utföra patch-clamp inspelningar från fina processer, den i dendriter 15. Även lapp dessa fina astrogliala processer sannolikt utmanande på grund av sin ringa storlek, är det förmodligen en väg att fortsätta att riva intimare dialog mellan astrogliala mikroområden och enskilda synapser. Emellertid kan de sannolika små elektrofysiologiska astrogliala svar till följd av enskilda fina astrogliala processer vara under tröskelvärdet upptäckt, eftersom elektriska störningar når i genomsnitt 3-5 pA i patch-clamp inspelningar. En annan metod för att studera astrogliala svar på synaptisk aktivitet är kalcium avbildning, eftersom aktivering av astrocytiska membranreceptorer eller transportörer av neuroaktiva ämnen kan utlösa intracellulära kalcium transienter. Dock kan bulk laddning av astrocyter med kalcium indikatorer också i huvudsak speglar somatisk aktivitet 16. Kombinationen av elektrofysiologi och kalcium avbildning möjliggör också detektera små kalcium signaler från fina astrogliala processer, antingen förekommande spontant eller utlösas By minimala synaptisk stimulering 17, 18. Man bör dock hålla i minnet att hög affinitet kalcium indikatorer kan agera som kalcium buffertar, hämmar viktiga kalcium signalvägar, medan låg affinitet indikatorer kan fungera under detektionsnivån. Slutligen består en elegant och icke-invasiv teknik för att studera kalcium händelser i fina astrocytiska processer, som också kringgår uttvättning av intracellulära signalmolekyler vid helcells-patch-clamp, att använda ett membran riktad kalcium-sensor, som kan uttryckas i astrocyter in situ, samt in vivo-19. Däremot kan kalcium avbildning ger bara information om en signalmolekyl, som är involverad i många, men inte alla cellulära aktiviteter, medan hela celler patch-clamp ger kvantitativ information om alla olika jonströmmar utlöses vid kanalen och receptor aktivering. Därför samtidiga elektrofysiologiska inspelningar från nervceller och astrocyterär en unik och kraftfull metod för att reda ut på nätet dynamiken i neuroglial joniska signalering och dess roll hjärna informationsbehandling.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dana Kamalidenova, Morgan Autexier och Roch Chopier, som gjorde videon och animationer samt Florian Beck för fotografier och efter produktion av video voice-over. Detta arbete sponsrades av Olympus och stöds av bidrag från HFSPO (Career Development Award), ANR (Program Jeunes chercheurs och program Blanc neurovetenskap), FRC (Fédération pour la Recherche sur le cerveau), INSERM och La Pitié Salpétriéresjukhuset (Överbryggande forskning kontrakt) till NR, från franska Research ministeriet och Deutsche Forschungsgemeinschaft postdoc-stipendier till UP, och från forskarskola "Frontiers in Life Science", Paris Diderot University Bettencourt Schuller Foundation och FRM (Fondation pour la Recherche Medicale) doktorandtjänst till JS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
- Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
- Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
- Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
- Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
- Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
- Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
- Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).
