Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

Published: October 22, 2012 doi: 10.3791/4420
Automatic Translation
1, 1
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, and Pulmonary and Critical Care Unit, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام الببتيد: MHC tetramers وmicrobeads المغناطيسي لعزل السكان التردد المنخفض من الخلايا T-حاتمة محددة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تمكن من الدراسة الذاتية المباشرة السكان خلية T من الاهتمام من

Abstract

ضرورة أساسية للباحثين الذين يدرسون الحصانة التكيف مع نماذج تجريبية في الجسم الحي هو القدرة على تحديد الخلايا T T بهم على أساس خلية مستقبلة المستضد (TCR) خصوصية. العديد من الطرق غير المباشرة التي تتوفر في عدد سكانها ويتم تحفيز الخلايا T الأكبر من في المختبر مع مستضد معين وحاتمة محددة خلايا T وتحديدها من خلال قياس استجابة وظيفية مثل انتشار الأسلحة النووية، إنتاج السيتوكينات، أو التعبير عن علامات التنشيط 1. ومع ذلك، هذه الأساليب تحديد حاتمة محددة فقط خلايا T واظهار واحدة من العديد من الوظائف المحتملة، وأنها ليست حساسة بما يكفي للكشف عن خلايا محددة حاتمة T على ترددات السلائف السذاجة. وثمة بديل شعبية هو المعدلة وراثيا TCR نموذج نقل بالتبني، والتي هي خلايا T المصنف حيدة النسيلة من الماوس المعدلة وراثيا في TCR المضيفين متوافق نسيجيا لخلق السكان السلائف كبير من الخلايا T-حاتمة محددة يمكن أن تكون EASIلي مع تعقب استخدام الأجسام المضادة علامة 2،3 مسانج مشترك. بينما قوية، وهذه الطريقة يعاني من التحف التجريبية المرتبطة تردد من الخلايا T unphysiological مع خصوصية لحاتمة واحدة 4،5. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن تستخدم هذا النظام للتحقيق في عدم التجانس الوظيفي للحاتمة محددة استنساخ الخلايا T للسكان من بولكلونل.

يجب أن الطريقة المثلى لدراسة الحصانة التكيف تنطوي على الكشف المباشر للحاتمة محددة خلايا T T من مرجع الخلية المحلية باستخدام أسلوب الذي يميز خصوصية TCR فقط من قبل ملزم لالمشابهة الببتيد: مجمعات MHC (PMHC). استخدام tetramers PMHC والتدفق الخلوي يحقق هذا 6، ولكن يقتصر على الكشف عن السكان تيرة عالية من الخلايا T-حاتمة محددة لا توجد إلا مستضد التالية التي يسببها التوسع نسيلي. في هذا البروتوكول، ونحن تصف الطريقة التي تنسق استخدام tetramers PMHC وماغنيتيك تكنولوجيا تخصيب الخلية لتمكين الكشف عن خلايا T التردد المنخفض للغاية حاتمة محددة من الأنسجة اللمفاوية 3،7 الماوس. مع هذه التقنية، يمكن للمرء أن تتبع شامل كامل حاتمة محددة من الخلايا T السكان الذاتية في الفئران في جميع مراحل الاستجابة المناعية.

Protocol

1. عزل الخلايا من الأنسجة اللمفاوية

  1. إضافة 1 مل من الجليد الباردة cEHAA (+ 10٪ EHAA FBS، القلم / بكتيريا، جنتاميسين، 2 مم L-الجلوتامين، 55 مم 2-المركابتويثانول) أو غيرها من الخلايا T المتوسطة ما يعادلها، إلى صحن الثقافة 60 مم يحتوي على مربع صغير من 100 شبكة النايلون ميكرومتر ومكان على الجليد.
  2. الموت ببطء الماوس.
  3. إزالة الطحال والغدد الليمفاوية ما يصل يمكن الوصول إليها بسهولة ممكن. ينبغي أن تشمل هذه على الأقل، الإبطين الأربية، العضدية، والعقد اللمفاوية العنقية، والمساريقي. وضعها على رأس شبكة النايلون في طبق الثقافة.
  4. باستخدام الأعلى المسطح من 1،5 أنبوب مغلق microfuge مل، الهريس بلطف الأنسجة اللمفاوية خلال شبكة من النايلون لتحرير الخلايا الليمفاوية. إضافة 1 مل من آخر cEHAA والماصة صعودا وهبوطا للعمل الخلايا في التعليق. نقل الخلايا من خلال قطعة أخرى من النايلون وضعت على شبكة أعلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل مادة البولي بروبيلين. شطف الأطباق وشبكة مع آخر 1 مل من الجليد الباردة cEHAA، صأولينغ وحدات التخزين في أنبوب واحد. تكرار لتحقيق التعليق الخلية النهائي حجم 4 مل.
  5. إضافة الباردة العازلة فارز (PBS + 2٪ FBS، أزيد 0.05٪) إلى الحجم النهائي من 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C.
  6. نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في كتلة FC (فارز عازلة + 2.4G2 الضد) إلى وحدة تخزين النهائي يساوي تقريبا ضعف من بيليه نفسه. على سبيل المثال، الطحال والغدد الليمفاوية على فأرة الحاسوب ساذجة تنتج عادة بيليه خلية من حوالي 100 ميكرولتر. في هذه الحالة، إضافة 100 ميكرولتر من كتلة التيسير لتبرزي حجم إلى 200 ميكرولتر. إذا كان درجة كبيرة من التثاقل خلية حدث، وإزالة بعناية تتجمع الخلايا في هذه المرحلة مع طرف الماصة.

2. Tetramer تلوين

  1. إضافة PE-APC-المسمى أو PMHC tetramer إلى تركيز النهائي من 10 نانومتر (أو تركيز الأمثل تجريبيا).
  2. ومزيج incubaالشركة المصرية للاتصالات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (أو الوقت الأمثل تجريبيا ودرجة الحرارة).
  3. إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. الحفاظ على العينات على الجليد أو عند 4 ° C من الآن فصاعدا.
  4. نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. لتخصيب tetramer مزدوجة، إعادة تعليق النهائية إلى وحدة تخزين من 150 ميكرولتر.

3. المغناطيسية التخصيب

  1. إضافة 50 ميكرولتر من microbeads Miltenyi مكافحة PE أو مكافحة APC. لتخصيب tetramer مزدوجة، إضافة 50 ميكرولتر من كل من.
  2. خلط واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C.
  4. أثناء انتظار، إعداد عمود LS Miltenyi المغناطيسي المغناطيس على MidiMACS أو QuadroMACS. وضع مفتوح البولي بروبلين 15 مل أنبوب الطرد المركزي علىرف مباشرة تحت العمود.
  5. أضف 3 مل من العازلة فارز إلى أعلى العمود، والسماح لها لاستنزاف في أنبوب 15 مل.
  6. وضع النايلون مساحة 100 ميكرومتر شبكة على رأس العمود.
  7. عندما تنتهي من الخلايا الغزل ونضح بعناية طاف بيليه و resuspend في 3 مل من العازلة فارز.
  8. نقل التعليق الخلية من خلال شبكة من النايلون على الجزء العلوي من العمود.
  9. عندما توقف خلية استنزفت تماما في العمود، وشطف الأنبوب الأصلي مع آخر مل 3 من فارز العازلة ونقل المخزن المؤقت من خلال شبكة من النايلون في العمود، الشطف شبكة في هذه العملية. تجاهل شبكة النايلون.
  10. عندما استنزفت تماما عازلة في العمود، إضافة آخر مل 3 من المخزن المؤقت فارز إلى العمود.
  11. كرر الخطوة 10 لما مجموعه 3 مل يغسل X 3.
  12. إزالة عمود من المغناطيس ومكان أكثر من أنبوب جديد 15 مل الطرد المركزي البولي بروبلين.
  13. إضافة 5 مل من العازلة فارز لرانه العمود.
  14. إدراج فورا الغواص في أعلى العمود في واحد وحركة مستمرة، ودفع المكبس على طول الطريق، مما اضطر العازلة من العمود في أنبوب.
  15. أجهزة الطرد المركزي أنابيب تحتوي على جزء محدد مزال وجزء غير منضم التدفق من خلال لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C.
  16. نضح بعناية طاف من الكسر محدد، مع التأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 95 ميكرولتر بالضبط. نضح و resuspend الكسر غير منضم إلى الحجم النهائي من 2 مل.

4. تدفق الخلوي

  1. لكل جزء، وإزالة وإضافة 5 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر من الخرز العد (معدلة لتركيز مل / 200،000 في المخزن المؤقت فارز) في أنبوب مل 5 FACS. توضع جانبا في 4 لتحليل C ° في وقت لاحق. لتوفير الوقت، يمكن الخرز مسبقا aliquoted لأنابيب المسمى قبل بدء التجربة.
  2. إعداد صباحاأستر مزيج من الأجسام المضادة لعلامات وصمة عار على سطح الخلايا (الجدول 1). لتوفير الوقت، ويمكن أن يتم ذلك قبل بدء التجربة.
  3. لجزء محدد، إضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل مباشرة إلى ميكرولتر من 90 ~ الخلايا في الأنبوب. إذا هو المطلوب تحليل الكسر غير منضم، بتحويل 90 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب 5 مل FACS وإضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل.
  4. تشكيل لجنة للضوابط التعويض أحادية اللون لتدفق عداد الكريات. لكل ملون تألقي لاستخدامها، مزيج 50 ميكرولتر من الخلايا بقايا جزء غير منضم في أنبوب مل 5 FACS مع 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD4 مترافق إلى ملون تألقي المقابلة. تذكر لإنشاء عنصر تحكم غير ملوثين أيضا.
  5. دوامة واحتضان جميع العينات لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. إضافة 5 مل من العازلة فارز لكل أنبوب الطرد المركزي ولمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C.
  7. لجزء محدد، نضح بعناية طاف و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من BUF فارزFER. نقل الخلايا إلى microtube 1،2 مل FACS. شطف الأنبوب مع آخر ميكرولتر العازلة 200 من فارز والمسبح في نفس microtube. إذا كتل الخلايا واضحة، تمر الخلايا من خلال مرشح ميكرون 50.
  8. لجزء غير منضم وضوابط التعويض، أو صب نضح طاف و resuspend في فارز 2 مل العازلة.
  9. إعداد قياس التدفق الخلوي باستخدام عناصر التحكم التعويض أحادية اللون. حدد الجانب مبعثر ذات العرض (SSC-W) كمعلمة إضافية ليتم تسجيلها.
  10. تحليل عينات الملون باستخدام سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة CD4 + لتحديد أو CD8 + T الخلايا كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. لكسور محدد، جمع خلايا أكبر عدد ممكن بحد أقصى 2،000،000 مجموع الأحداث. لكسور غير منضم، وجمع 1000000 مجموع الأحداث. الحفاظ على معدل الاستحواذ في 3000 أو أقل الأحداث في الثانية الواحدة.
  11. باستخدام إعدادات الجهاز نفسه، وتحليل عينات العد حبة. جمع 10000 مجموع الأحداث. </ لى>
  12. حفظ كافة البيانات في ملفات FCS.

5. تحليل البيانات

  1. تحليل FCS ملفات البيانات لعينات العد باستخدام حبة FlowJo البرمجيات. مبعثر مؤامرة قدمها FITC ووضع بوابة أرونج عد حبات (أنظر الشكلين 1 و 2). تحديد العدد الإجمالي للعد الخرز الكشف عن في كل عينة. طرح من إجمالي عدد الأحداث التي تم جمعها لتحديد عدد الخلايا التي تم جمعها من الأحداث.
  2. حساب العدد الإجمالي للجميع الخلايا في كل عينة باستخدام المعادلات المبينة في الإطار 1.
  3. تحليل FCS ملفات البيانات لعينات الملون جزء محدد وغير منضم. إعداد سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة لتحديد اللمفاوية +، لو الجانبية مبعثر العرض، تفريغ، CD3 +، + CD4 CD8 + أو، tetramer + الخلايا التائية في كل عينة كما هو موضح في الشكلين 1 و 2.
  4. مضاعفة العدد الإجمالي للخلايا في العينة من الترددات لكل من بوابات إدراج تستخدم لتحديد CD4 + tetramer+ + CD8 أو tetramer + الخلايا لحساب العدد الإجمالي للخلايا T-حاتمة محددة (الإطار 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1 يصور ممثل المؤامرات التدفق الخلوي من الطحال pMHCII المخصب tetramer وعينات من الفئران العقدة الليمفاوية السذاجة، بينما يصور الشكل 2 بيانات تمثيلية للتحصين الفئران سابقا مع الببتيد ذات الصلة + CFA. مسلسل الأحداث النابضة يزيل autofluorescent غير المرغوب فيها وغيرها من CD4 + تحليل السكان خلية T. وCD8 + T الخلية السكان بمثابة السيطرة مفيدة السلبية الداخلية لتلطيخ tetramer pMHCII من CD4 + الخلايا التائية. نلاحظ أن الكسور متجهة من تخصيب عادة ما تحتوي على نسبة أعلى بكثير من الخلايا autofluorescent من الكسور غير منضم، مما يجعل النابضة أكثر تحديا.

وتحسب الأعداد المطلقة للخلايا T حاتمة محددة في عينة بضرب العدد الإجمالي لجميع الخلايا في جزء محدد من العينة التخصيب، كما هو محدد من تحليل عدد حبة، مع نسبة هذه الخلايا التي هي tetramer +، ومحدداتNED من الخلية تحليل تلطيخ (الإطار 1).

لالسذاجة الماوس في الشكل 1، وتركيز جميع الخلايا في جزء محدد من العينة (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6،31 × 10 6 / مل. إجمالي عدد الخلايا في جميع العينة (6.31 × 10 6 / مل) (0.095) = 6.00 × 10 5. وأخيرا، فإن العدد الإجمالي للحاتمة محددة CD4 + T الخلايا هي (6.00 × 10 5) (41.5٪) (96.6٪) (10.2٪) (62.3٪) (0.64٪) = 98.

لتحصين الماوس في الشكل 2، وتركيز جميع الخلايا في جزء محدد من العينة (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1،43 X 10 7 / مل. إجمالي عدد الخلايا في جميع العينة (1.43 × 10 7 / مل) (0.095) = 1.36 × 10 6. وأخيرا، فإن العدد الإجمالي للحاتمة محددة CD4 + T الخلايا هي (1.36 × 10 6) (40.9٪) (93.9٪) (9.54٪) (72.0٪) (42.7٪) = 1.53 × 10 4 </ STRONG>.

انخفاض كفاءة التخصيب وعدد الخلايا T-حاتمة محددة يزيد 8، بحيث يمكن أن ينظر إليها tetramer + الخلايا في جزء من العينات تحتوي على غير منضم الترددات العالية جدا من الخلايا T-حاتمة محددة. ويمكن حساب في مثل هذه الحالات، وعدد من الخلايا T-حاتمة محددة موجودة في جزء غير منضم على حدة، وأضاف أن عدد جدت في جزء محدد. لذلك، في الشكل 2، وتركيز جميع الخلايا في جزء من العينة غير منضم هو (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7،46 X 10 7 / مل، فإن العدد الإجمالي لجميع الخلايا هو (7.46 X 10 7 / مل) (2.0) = 1.49 × 10 8، والعدد الإجمالي للحاتمة محددة CD4 + الخلايا T هو (1.49 × 10 8) (62.7٪) (96.4٪) (44.5٪) (54.7٪) (0.0409 ٪) = 8.97 × 10 3. إضافة الأرقام في الكسور غير منضم منضم و، هناك 1،53 × 10 4 + 8.97 × 10 3 = 2.43 X10 4 مجموع حاتمة محددة CD4 + T الخلايا في العينة كلها. في الواقع، إذا حاتمة محددة التوسع خلية قوية بما فيه الكفاية، يمكن تخطي عملية التخصيب.

ملون تألقي الجسم المضاد
المحيط الهادئ الأزرق تفريغ (B220، CD11b، CD11c، F4/80)
أورانج المحيط الهادئ CD8
FITC CD3
PE PMHC tetramer أو علامة المظهري
PerCP CD4
APC PMHC tetramer أو علامة المظهري
AlexaFluor 700 CD44

واقترح الجدول 1. الضد استراتيجية تلطيخ

الشكل 1 : عرض المحتوى = "6in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1.jpg" />
الشكل 1. تحليل تدفق cytometric من حاتمة محددة CD4 + T الخلايا في الفئران بعد السذاجة تخصيب tetramer القائم على pMHCII. وتظهر قطع ممثل عن كسور (B) منضمة (A) وغير منضم. يتم تعيين A خلافة جيتس لتحديد اللمفاوية +-مبعثر، جنبا إلى مبعثر-widthlo، تفريغ، CD3 + الأحداث. من هذه، CD4 + + CD8 أو الأحداث بوابات لتحليل الخلايا T-حاتمة محددة أو تلطيخ الخلفية. كانت مختلطة مأخوذة من الخلايا غير ملوثين من الكسر (D) منضمة (C) وغير منضم مع الخرز الفلورسنت العد وتحليلها بشكل منفصل. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

oad/4420/4420fig2.jpg "/>
تحليل التدفق الرقم 2. cytometric من حاتمة محددة CD4 + T الخلايا في الفئران الببتيد تحصين بعد تخصيب tetramer القائم على pMHCII. وتظهر قطع ممثل عن كسور (B) منضمة (A) وغير منضم. يتم تعيين A خلافة جيتس لتحديد اللمفاوية +-مبعثر، جنبا إلى مبعثر-widthlo، تفريغ، CD3 + الأحداث. من هذه، CD4 + + CD8 أو الأحداث بوابات لتحليل الخلايا T-حاتمة محددة أو تلطيخ الخلفية. كانت مختلطة مأخوذة من الخلايا غير ملوثين من الكسر (D) منضمة (C) وغير منضم مع الخرز الفلورسنت العد وتحليلها بشكل منفصل. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الإطار 1. حساب حاتمة محددة أعداد الخلايا T

وتحسب أفضل الأعداد المطلقة للخلايا T-حاتمة محددة مع المعونة من الخرز الفلورسنت العد. وقسامة من غير ملوثينيتم خلط الخلايا من كل عينة بحجم محدد من عد حبات تعيين بتركيز المعروف ومن ثم تحليلها من قبل التدفق الخلوي. ويمكن أن يستدل من تركيز الخلايا في عينة من المقارنة بين وتيرتها مع تركيز معروف من الخرز الفلورسنت العد.

المعادلة 1
ثم يتم حساب إجمالي عدد الخلايا في العينة عن طريق ضرب تركيز الخلية مع حجم العينة الكلية.

المعادلة 2
العدد الإجمالي للحاتمة محددة خلايا T في العينة هو ببساطة العدد الإجمالي لجميع الخلايا في العينة مضروبا في نسبة الخلايا التي هي tetramer إيجابية.

المعادلة 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وtetramer PMHC تخصيب خلية مقرها طريقة التي قدمها هذا البروتوكول هو أداة قوية لدراسة حاتمة محددة خلايا T من الخلايا T الذاتية ذخيرة. استخدام tetramers PMHC تمكن الكشف عن خلايا T حاتمة محددة تستند مباشرة على قدرة TCRs لربط يغاندس PMHC وما شابه ذلك. إثراء يوفر مستوى من الحساسية بحيث يمكن الكشف عن السكان نادرة للغاية من الخلايا T-مستضد محددة من ذخيرة الذاتية من الخلايا T دون اي مس تكوينهم الوراثي أو تردد السلائف. ونتيجة لذلك، وهذا الأسلوب يسمح المحقق لتتبع مباشرة الذاتية مستضد محددة الخلايا T من السكان في النظم التجريبية المجراة من السذاجة مستوياتها خلال جميع مراحل الاستجابة المناعية.

وقد تم تحسين هذا البروتوكول لاستخدام PMHC الدرجة الثانية (pMHCII) tetramers لتخصيب حاتمة محددة CD4 + T الخلايا اللمفاوية من الجهاز الثانويق من الفئران. ومع ذلك، فإن تقنية ينطبق أيضا على tetramers (pMHCI) PMHC فئة I + CD8 الخلايا وT 9. على عكس CD4، وcoreceptor CD8 تلعب دورا هاما في تحقيق الاستقرار TCR-MHC التفاعلات، وهذا يمكن أن يكون لها آثار عملية لتلطيخ tetramer pMHCI 10. وأبرزها، ينبغي أن يقتصر استخدام الأجسام المضادة لاستنساخ CD8 التي لا تضر CD8-tetramer ملزمة، وينبغي إضافتها إلى الخلايا بعد تلطيخ tetramer. في الواقع، لقد تم تصميم بعض tetramers pMHCI مع تحور مواقع CD8 MHCI ملزمة للتخفيف ملزمة لغير محددة CD8 + T الخلايا 11،12.

يمكن Tetramer التركيز، وفترة حضانة، وحرارة الحضانة تؤثر بشكل كبير على كفاءة تلطيخ tetramer، وينبغي أن يكون الأمثل لتحقيق ظروف أفضل مزيج من إشارة tetramer عالية، وانخفاض إشارة الخلفية، وانخفاض استيعاب tetramer، وتغيرات طفيفة في علم وظائف الأعضاء الخلية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون هذه الشروط به تحديد تجريبيا لكل كاشف فريدة من نوعها. في أيدينا، ومع ذلك، فإن تركيز النهائي من 10 نانومتر وحضانة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة توفر ظروف جيدة للعام tetramers معظم pMHCI أو pMHCII. بشكل عام، يبدو أن tetramers pMHCI وصمة عار بسهولة أكثر من tetramers pMHCII، ويمكن في كثير من الأحيان أن يؤديها في تلطيخ C ° 4 مقابل أقل من 30 دقيقة.

هي مناسبة لحجم هذا الإجراء لتحليل ما يقرب من جميع الأجهزة اللمفاوية الثانوية على فأرة الحاسوب في عينة واحدة. لذلك، كل عينة تمثل تحليلا شاملا إلى حد ما من تعميم الطرفية كامل مرجع خلية T على فأرة الحاسوب. ويمكن أيضا حاتمة محددة الخلايا T يمكن المخصب من الأنسجة الأخرى ذات الصلة، بما في ذلك الغدة الصعترية 13،14. عندما يتم تحليل thymii من الفئران الأسبوع 4-5 من العمر، يمكن أن يتم الكشف عن حاتمة محددة thymocytes إيجابية واحدة في أعداد مماثلة لتلك التي الطرفية خلايا T السذاجة. حاتمة محددة نقرا مزدوجا إيجابية thymocytes،ومع ذلك، من الصعب جدا اكتشاف بسبب انخفاض مستويات التعبير TCR.

ويمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول للكشف عن حاتمة محددة CD4 + الإنسان أو CD8 + T الخلايا في الدم أو الأنسجة الأخرى 15-17. تواتر من الخلايا T-حاتمة محددة هو تقريبا نفس بين الفئران والبشر 17، لذلك فإن التحليل 50 - 100 مل من الدم من شأنه أن يعود أرقام مقارنة للحاتمة محددة خلايا T والطحال والغدد الليمفاوية المجمعة على فأرة الحاسوب 18.

ومن التحديات الرئيسية في تحليل تدفق cytometric من الخلايا بعد tetramer القائم على التخصيب المميزة الأحداث الحقيقية من الخلايا الخلفية. هذا يرجع إلى حد كبير إلى حقيقة أن الخلايا هي أيضا العديد من autofluorescent غير المخصب على وجه التحديد أثناء العملية. إن لم يكن من بوابات بعناية، يمكن لهذه الخلايا كخلايا autofluorescent تظهر tetramer إيجابية كاذبة والتخلص من دقة التحليل، وخاصة في حالة نادرة السذاجة الخلايا T عopulations. لدينا بروتوكول توظف استراتيجية النابضة من خطوتين في الأحداث التي CD3 + لأول بوابات بعيدا عن النسب تفريغ + الأحداث، ومن ثم CD4 + الأحداث بعيدا عن بوابات الأحداث CD8 +. في هذه العملية، autofluorescent الخلايا، والتي تميل إلى الكذب على طول مركز قطري من أي مؤامرة FACS، خارج بوابات للتحليل في اثنين متكررة الخطوات. إزالة فعالة للأحداث autofluorescent يأتي على حساب الألوان الفلورية كثيرة، لذلك نحن نوصي بشدة استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي قادرة على المعلمات لا يقل عن 6 الفلورسنت.

tetramers معظم PMHC هي مترافق لPE وAPC نظرا لسطوع هذه fluorochromes، ومكافحة PE-APC ومكافحة microbeads المغناطيسي متوفرة لتمكين تخصيب معهم. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم fluorochromes أخرى طالما microbeads المغناطيسي المقابلة متوفرة. في الواقع، يمكن استخدام tetramers متعددة مع تسميات مختلفة ملون تألقي مع هيئة التصنيع العسكري الأجسام المضادة مترافق المقابلةrobeads متعددة في وقت واحد لتخصيب حاتمة محددة السكان خلية T من نفس العينة. وقد أوجزنا أساسي جدا للأجسام المضادة ملون تألقي الإعداد التي يتم أمثل لاستخدام PE-APC tetramers وصفت-(الجدول 1)، ولكن العديد من تركيبات فعالة أخرى ممكنة لزيادة المرونة في دراسة علامات المظهري.

ويمكن استخدام الخلايا CD8 + T السكان والسيطرة على السلبية الداخلية، لأنها لا ينبغي ربط يغاندس pMHCII (والعكس بالعكس لحاتمة CD8 + محددة تخصيب خلية T). وتيرة + + CD8 خلايا tetramer في عينة يوفر تقييما جيدا لمستوى تلطيخ tetramer الخلفية، على الرغم من حسن النية tetramer CD8 + إيجابية الخلايا T مع الصليب المقيدة لخصوصية الحواتم pMHCII قد تكون موجودة في ترددات صغيرة جدا 19. أحيانا أثناء الاستجابات المناعية قوية جدا، قد تكون هذه الخلايا موجودة في ترددات الموسعة. إذا رغبت، TCR المعدلة وراثيا الطرافة T الخلاياويمكن استخدام ساعة أو دون خصوصية حاتمة ذات الصلة إضافية الضوابط الإيجابية والسلبية. نلاحظ أن لأسباب غير معروفة، وبعض الخلايا المعدلة وراثيا وTCR hybridomas لا صمة بشكل جيد مع tetramers ذات الصلة.

لدينا بروتوكول ينطوي على استخدام الخرز الفلورسنت عد للمساعدة في حساب الأرقام الخلية. بينما يمكن أيضا أن يتحقق عدد الخلايا يدويا مع عدادة الكريات، نجد أن استخدام العد الخرز النتائج التجريبية في الدقة أكبر بكثير، وخصوصا عندما تشارك المحققين متعددة. نظرا لأعداد صغيرة من الخلايا وحدات التخزين التي يتم معالجتها في هذا البروتوكول، يتعين على التقليل من الخطأ التجريبي أن يكون أولوية عالية.

Tetramer تلطيخ متوافق مع تثبيت الخلية وpermeabilization، والعديد من الدراسات وتحليل بنجاح خلوى داخل الخلايا والنسخ التعبير عاملا في الخلايا التالية تخصيب الخلية tetramer المستندة إلى 20،21.ومع ذلك، فإن خطوات إضافية المعنية المساهمة في الخسائر خلية إضافية في العينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر اندريه هان والين لورانس للمساعدة التقنية، وأعضاء المختبر جنكينز للمساعدة في تطوير هذا البروتوكول.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources
Anti-PE conjugated magnetic microbeads Miltenyi 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic microbeads Miltenyi 130-090-855
LS magnetic columns Miltenyi 130-042-401
MidiMACS or QuadroMACS magnet Miltenyi 130-042-302 or 130-090-976
Cell counting beads Life Technologies PCB-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
  2. Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
  3. Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
  4. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  5. Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
  7. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  8. Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
  10. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  11. Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
  12. Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
  13. Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
  14. Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
  15. Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
  16. Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
  17. Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
  18. Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
  19. Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
  20. Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
  21. Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).

Tags

علم المناعة، العدد 68، البيولوجيا الخلوية، البيولوجيا الجزيئية، T الخلية، T مستقبلات الخلية، tetramer، التدفق الخلوي، مستضد محددة، علم المناعة، الاستجابة المناعية، المغناطيسي، والإثراء،
الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legoux, F. P., Moon, J. J.… More

Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells. J. Vis. Exp. (68), e4420, doi:10.3791/4420 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter