Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

Published: October 22, 2012 doi: 10.3791/4420
Automatic Translation
1, 1
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, and Pulmonary and Critical Care Unit, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין מ

Abstract

צורך בסיסי לחוקרים הלומדים חסינות אדפטיבית עם במודלי ניסויי vivo הוא יכולת לזהות תאי T המבוססים על קולטן תא T אנטיגן (TCR) הספציפי. שיטות עקיפות רבות זמינות שבחלק ארי של אוכלוסיית תאי T היא מגורה במבחנה עם תאי T epitope ספציפי אנטיגן ספציפי ומזוהים באמצעות המדידה של מענה פונקציונלי כגון הפצה, ייצור ציטוקינים, או ביטוי של סמני הפעלה 1. עם זאת, שיטות אלו רק לזהות תאי T ספציפיים epitope מציגים אחד מפונקציות אפשריות רבות, והם אינם רגישים מספיק כדי לזהות תאי T epitope ספציפיים בתדרים מבשרים נאיביים. אלטרנטיבה פופולרית היא מודל העברת מאמצת TCR המהונדס, שבו תאי T חד שבטיים מעכבר מהונדס TCR הם seeded לתוך מארחי histocompatible ליצור אוכלוסיית מבשר גדולה של תאי T epitope ספציפיים שיכול להיות easily מעקב עם השימוש בנוגדני סמן congenic 2,3. אמנם חזק, שיטה זו סובלת מממצאי ניסויים הקשורים בתדירות לא הפיזיולוגית של תאי T עם ייחוד לepitope 4,5 אחת. יתר על כן, מערכת זו אינה יכולה לשמש כדי לחקור את ההטרוגניות התפקודית של תאי T שיבוטי epitope ספציפיים בתוך אוכלוסיית polyclonal.

הדרך האידיאלית ללמוד חסינות אדפטיבית צריכה לערב זיהוי הישיר של תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר תא T אנדוגני בשיטה המייחדת את הספציפיות TCR אך ורק על ידי הכריכה לאותו מקור פפטיד: מתחמי MHC (pMHC). השימוש בtetramers pMHC וcytometry זרימה משיג זאת 6, אך מוגבל לזיהוי של אוכלוסיות בתדירות גבוהה של תאי T epitope ספציפיים נמצאו התרחבות משובטת אנטיגן מושרה הבאה בלבד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שמתאמת את השימוש בtetramers pMHC וMagneטכנולוגיה להעשרת תאי טיק כדי לאפשר זיהוי של תאים מאוד נמוכים תדר epitope ספציפיים T מרקמות עכבר הלימפה 3,7. בעזרת טכניקה זו, ניתן לעקוב אחר אוכלוסיות שלמות מקיף epitope ספציפיים של תאי T אנדוגני בעכברים בכל שלבי התגובה החיסונית.

Protocol

1. בידוד תא מרקמת הלימפה

  1. הוסף 1 מ"ל של הקרח הקר cEHAA (2-mercaptoethanol EHAA + 10%, עט / סטרפטוקוקוס, gentamycin, 2 מ"מ L-גלוטמין, 55 מ"מ FBS) או בינוני תא אחר שווה ערך T, לצלחת התרבות 60 מ"מימ המכילה ריבוע קטן של רשת 100 מיקרומטר ניילון ומניח על קרח.
  2. להרדים את העכבר.
  3. הסר את הטחול ובלוטות לימפה כנגישות רבות ככל האפשר. אלו צריכות לכלול לפחות את הבלוטות מפשעתי, בית השחי, זרוע, בצוואר רחם, וmesenteric הלימפה. הנח אותם על גבי רשת הניילון בצלחת התרבות.
  4. שימוש בגג השטוח של צינור microfuge סגור 1.5 מ"ל, בעדינות מועך את רקמת הלימפה מעל רשת הניילון לשחרור לימפוציטים. הוסף עוד מיליליטר 1 מתוך cEHAA וpipet למעלה ולמטה כדי לעבוד תאים להשעיה. העברת התאים דרך עוד פיסת רשת ניילון מונחת על גבי צינור צנטריפוגה פוליפרופילן מ"ל 15. יש לשטוף את הצלחת ואת הרשת עם עוד 1 מ"ל של הקרח הקר cEHAA, פוoling הכרכים לתוך אותו הצינור. חזור על פעולה כדי להשיג נפח השעית תא סופי של 4 מ"ל.
  5. הוסף חיץ סדרן קר (PBS + 2% FBS, יזיד 0.05%) לנפח סופי של 15 מ"ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C.
  6. בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend התא גלול ב Fc בלוק (סדרן חיץ + 2.4G2 נוגדנים) להיקף השווה לכ כפול מזו של הכדור עצמו סופי. לדוגמה, בלוטות הלימפה והטחול של עכבר נאיבי בדרך כלל מייצרות תא גלולה של 100 μl. במקרה זה, להוסיף 100 μl של בלוק Fc להביא נפח עד 200 μl. אם מידה רבה של clumping תא התרחשה, להסיר בזהירות את גוש התא בשלב זה עם טיפ pipet.

2. כתמי tetramer

  1. הוסף PE-APC או כותרתו pMHC tetramer לריכוז סופי של 10 ננומטר (או ריכוז מותאם באופן אמפירי).
  2. מערבבים וincubaטה לשעה 1 בטמפרטורת חדר (או זמן וטמפרטורה מותאמים באופן אמפירי).
  3. הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ"ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. שמור על דגימות קרח או ב 4 ° C מעתה והלאה.
  4. בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של 200 μl. להעשרת tetramer כפולה, resuspend לנפח סופי של 150 μl.

3. העשרה מגנטית

  1. הוסף 50 μl של microbeads Miltenyi אנטי PE או אנטי APC. להעשרת tetramer כפולה, להוסיף 50 μl של שניהם.
  2. לערבב ודגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C.
  3. הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ"ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C.
  4. בזמן ההמתנה, להגדיר עמודה מגנטית Miltenyi LS על מגנט MidiMACS או QuadroMACS. מקם צינור פתוח 15 מ"ל פוליפרופילן צנטריפוגה עללצבור ישירות מתחת לעמודה.
  5. הוסף 3 מ"ל של חיץ סדרן לראש הטור, מאפשר לנוזל להתנקז לתוך צינור המ"ל 15.
  6. הנח ריבוע 100 מיקרומטר ניילון רשת על גבי העמוד.
  7. כאשר תאים שסיימו ספינינג, לשאוב בזהירות את supernatant ו resuspend גלול ב 3 מ"ל של חיץ סדרן.
  8. להעביר את השעית התא דרך רשת הניילון על החלק העליון של העמודה.
  9. כאשר השעית התא אזלה לחלוטין בעמודה, יש לשטוף את הצינור המקורי עם 3 מ"ל נוסף של חיץ סדרן ולהעביר למאגר דרך רשת הניילון לעמודה, שטיפת הרשת בתהליך. השלך את רשת הניילון.
  10. כאשר המאגר אזל לחלוטין לעמודה, להוסיף 3 מ"ל נוסף של חיץ סדרן לעמודה.
  11. חזור על שלב 10 עבור סכום כולל של 3 3 כביסות x מ"ל.
  12. הסר את העמודה מהמגנט והמקום מעל צינור חדש 15 מ"ל פוליפרופילן צנטריפוגה.
  13. הוסף 5 מ"ל של חיץ סדרן לtהוא העמודה.
  14. מייד להכניס את הבוכנה לתוך חלק העליון של העמודה ובתנועה רציפה אחת, דוחף את הבוכנה כל הדרך למטה, ואלץ את החיץ את הטור לשפופרת.
  15. צנטריפוגה את הצינורות המכילים את שבר eluted הכבול וזרימה דרך השבריר המאוגד למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C.
  16. בזהירות לשאוב supernatant מהשבריר הכבול, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של בדיוק 95 μl. לשאוב וresuspend השבריר המאוגד לנפח סופי של 2 מ"ל.

4. זרימת cytometry

  1. לכל שבר, להסיר 5 μl ולהוסיף עד 200 μl של חרוזי ספירה (מותאם לריכוז של 200.000 מ"ל / סדרן בחיץ) בצינור 5 מ"ל FACS. מניחים בצד ב 4 ° C לניתוח מאוחר יותר. כדי לחסוך זמן, חרוזים יכולים להיות מראש aliquoted לצינורות שכותרתו לפני תחילת הניסוי.
  2. הכן amתמהיל אסתר של נוגדנים לסמני כתם שעל פני התאים (טבלה 1). כדי לחסוך בזמן, ניתן לעשות זאת לפני תחילתו של הניסוי.
  3. לשבריר הכבול, להוסיף מנה של קוקטייל נוגדן ישירות ל~ 90 μl של תאים בצינור. אם ניתוח של השבריר המאוגד הוא רצוי, להעביר 90 μl של תאים לצינור 5 מ"ל FACS ולהוסיף מנה של קוקטייל נוגדנים.
  4. הגדר את הפנל של בקרות פיצוי חד צבע לcytometer הזרימה. עבור כל fluorochrome לשמש, לערבב 50 μl של תאי שברים לא כרוכי שאריות בצינור 5 מ"ל FACS עם μl 1 של נוגדן מצומד לfluorochrome המקביל אנטי CD4. זכור להגדיר שליטת כתם גם כן.
  5. מערבולת ודגירה כל הדגימות למשך 30 דקות ב 4 ° C.
  6. הוסף 5 מ"ל של חיץ סדרן לכל צינור וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C.
  7. לשבריר הכבול, לשאוב supernatant ו resuspend בקפידה את התאים ב200 μl של buf סדרןfer. להעביר את התאים לmicrotube 1.2 מ"ל FACS. שטוף את הצינור עם 200 μl אחר של חיץ סדרן וברכה לאותו microtube. אם גושים סלולריים הם לכאורה, עובר התאים דרך מסנן מיקרומטר 50.
  8. לשבריר המאוגד ופקדי פיצויים, מזוג או לשאוב supernatant ו resuspend במאגר 2 מיליליטר הסדרן.
  9. הגדרת cytometer הזרימה באמצעות פקדי הפיצוי חד הצבע. בחר צד פיזור רוחב (SSC-W) כפרמטר נוסף שיירשם.
  10. נתח את הדגימות המוכתמות באמצעות רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות CD4 + או CD8 + תאי T כפי שמודגם באיורי 1 ו 2. לשברים כפותים, לאסוף כמה שיותר תאים ככל האפשר עד למקסימום של 2,000,000 אירועים בסך הכל. לשברים לא כרוכים, לאסוף 1,000,000 אירועים בסך הכל. שמור את השיעור ברכישה או מתחת 3000 אירועים לשניים.
  11. שימוש בהגדרות אותן מכונות, לנתח את דגימות חרוזי ספירה. לאסוף 10,000 אירועים כלל. </ Li>
  12. לשמור את כל הנתונים כקבצי FCS.

5. ניתוח נתונים

  1. לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות חרוזי הספירה באמצעות תוכנת FlowJo. פיזור עלילה קדימה על ידי FITC ונקבע שער aroung חרוזי הספירה (ראה איורי 1 ו 2). לקבוע את המספר הכולל של ספירת חרוזים שהתגלו בכל דגימה. לחסר ממספר הכולל של אירועים שנאספו על מנת לקבוע את מספר האירועים סלולריים שנאספו.
  2. לחשב את המספר הכולל של כל התאים בכל דגימה באמצעות המשוואות שהותוו בתיבת 1.
  3. לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות השברים המאוגדות ולא מאוגדות המוכתמות. הגדר את רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות + הלימפה, lo צד פיזור רוחב, מזבלה-, CD3 +, CD4 + או CD8 +, tetramer + תאי T בכל דגימה כמוצג באיורי 1 ו 2.
  4. הכפל את המספר הכולל של תאים במדגם על ידי התדרים של כל אחד משערי ההכללה משמשים להגדרת סוג CD4 + tetramer+ או CD8 + + תאי tetramer כדי לחשב את המספר הכולל של תאי T epitope ספציפיים (תיבה 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מתאר עלילות cytometry זרימה מייצגות של טחול pMHCII tetramer מועשר ודגימות הלימפה מעכברים נאיביים, בעוד איור 2 מציג נתונים יציגים לעכברים שחוסנו בעבר עם פפטיד הרלוונטי + CFA. gating הסידורי מסיר אירועים לא רצויים autofluorescent ואחרים מניתוח מהסוג CD4 + אוכלוסיות תאי T. + אוכלוסיית תאי T CD8 משמשת כשליטה שלילית פנימית שימושית לצביעת pMHCII tetramer של CD4 + T לתאים. שים לב שברים המאוגדים מהעשרת בדרך כלל מכילים שיעור גבוה משמעותי של תאי autofluorescent מהשברים לא הכרוכים, מה שהופך gating יותר מאתגר.

מספרים מוחלטים של תאי T epitope ספציפיים במדגם מחושבים על ידי הכפלת המספר הכולל של כל התאים בשבריר הכרוך של המדגם המועשר, כפי שיקבע מניתוח ספירת החרוז, עם השיעור של תאים אלה ש+ tetramer, כdetermiנד מניתוח מכתים התא (תיבה 1).

לעכבר הנאיבי באיור 1, הריכוז של כל התאים בשבריר הכרוך של המדגם הוא (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 x 10 6 / מ"ל. המספר הכולל של כל התאים במדגם הוא (6.31 x 10 6 / מ"ל) (0.095) = 6.00 x 10 5. לבסוף, המספר הכולל של CD4 epitope הספציפי + תאי T הוא (6.00 x 10 5) (41.5%) (96.6%) (10.2%) (62.3%) (0.64%) = 98.

לעכבר המחוסן באיור 2, הריכוז של כל התאים בשבריר הכרוך של המדגם הוא (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 x 10 7 / מ"ל. המספר הכולל של כל התאים במדגם הוא (1.43 x 10 7 / מ"ל) (0.095) = 1.36 x 10 6. לבסוף, המספר הכולל של CD4 epitope הספציפי + תאי T הוא (1.36 x 10 6) (40.9%) (93.9%) (9.54%) (72.0%) (42.7%) = 1.53 x 10 4 </ Strong>.

היעילות של ירידות העשרה כמספר תאי T epitope ספציפיים מגדילה 8, כך tetramer + תאים ניתן לראות בשבריר המאוגד של דגימות המכילות תדרים גבוהים מאוד של תאי T epitope ספציפיים. במקרים כאלה, מספר תאי T epitope ספציפיים להציג בשבריר המאוגד ניתן לחשב בנפרד והוסיף למספר שנמצא בחלק המאוגד. לכן, באיור 2, הריכוז של כל התאים בשבריר המאוגד של המדגם הוא (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 x 10 7 / מ"ל, המספר הכולל של כל התאים הוא (7.46 x 10 7 / מ"ל) (2.0) = 1.49 x 10 8, והמספר הכולל של CD4 epitope הספציפי + תאי T הם (1.49 x 10 8) (62.7%) (96.4%) (44.5%) (54.7%) (0.0409 %) = 8.97 x 10 3. הוספת המספרים בשברים הכפותים ומאוגדים, יש 1.53 x 10 4 + 8.97 x 10 x 3 = 2.4310 4 CD4 כלל epitope ספציפי + תאי T בכל המדגם. ואכן, אם הרחבת התא epitope הספציפי היא מספיק חזקה, בתהליך ההעשרה ניתן לדלג עליו.

Fluorochrome נוגדן
פסיפיק בלו מזבלה (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
פסיפיק אורנג' CD8
FITC CD3
PE pMHC tetramer או סמן הפנוטיפי
PerCP CD4
APC pMHC tetramer או סמן הפנוטיפי
AlexaFluor 700 CD44

טבלה 1. מוצעת אסטרטגית מכתים נוגדן

איור 1 : תוכן רוחב = "6in" fo: src = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1.jpg" />
איור 1. ניתוח תזרים cytometric של CD4 epitope הספציפי + תאי T בעכברים נאיביים בא העשרת tetramer המבוסס pMHCII. חלקות יציגות מוצגות ל( B) השברים הכפותים () ולא מאוגדים. רצף של שערים נקבעים כדי לבחור בפיזור ימפואידית +, צד פיזור widthlo, טיפרים, CD3 + אירועים. מבין אלה, מסוג CD4 + או CD8 + אירועים הם מגודרים לניתוח תאי T epitope ספציפיים או צביעת רקע. Aliquots של תאי בתוליים מהכבול (C) ולא מאוגד שבריר (ד ') היה מעורב עם חרוזי ספירת ניאון ונותח בנפרד. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

oad/4420/4420fig2.jpg "/>
איור 2. ניתוח cytometric זרימה של CD4 epitope הספציפי + תאי T בעכברים שחוסנו פפטיד-בא העשרת tetramer המבוסס pMHCII. חלקות יציגות מוצגות ל( B) השברים הכפותים () ולא מאוגדים. רצף של שערים נקבעים כדי לבחור בפיזור ימפואידית +, צד פיזור widthlo, טיפרים, CD3 + אירועים. מבין אלה, מסוג CD4 + או CD8 + אירועים הם מגודרים לניתוח תאי T epitope ספציפיים או צביעת רקע. Aliquots של תאי בתוליים מהכבול (C) ולא מאוגד שבריר (ד ') היה מעורב עם חרוזי ספירת ניאון ונותח בנפרד. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

תיבת 1. חישוב כמות תאי ה T epitope ספציפי

מספרים מוחלטים של תאי T epitope ספציפיים מחושבים טוב ביותר בעזרת חרוזי ספירת ניאון. Aliquot של כתםתאים מכל דגימה מעורבבים עם נפח מוגדר של ספירת חרוזים שנקבעו בריכוז ידוע ולאחר מכן נותח על ידי cytometry זרימה. הריכוז של תאים במדגם ניתן להסיק מהשוואה של התדר שלהם עם הריכוז הידוע של חרוזי ספירת ניאון.

משוואה 1
המספר הכולל של תאים בדגימה אז מחושב על ידי הכפלת ריכוז התא עם נפח הדגימה הכוללת.

משוואה 2
המספר הכולל של תאי T epitope ספציפיים במדגם הוא פשוט המספר הכולל של כל התאים במדגם המוכפל באחוז התאים שtetramer חיוביים.

משוואה 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת pMHC tetramer מבוססת תא ההעשרה הוצגה על ידי פרוטוקול זה היא כלי רב עצמה ללימוד תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר התאים T אנדוגני. השימוש בtetramers pMHC מאפשר זיהוי של תאי T epitope ספציפיים המבוססים ישירות על היכולת שלהם להיקשר TCRs ligands pMHC מאותו מקור. ההעשרה מספקת רמת רגישות כך שאוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן יכולות להיות מזוהות ברפרטוארים אנדוגניים של תאי T ללא כל מניפולציה של המבנה הגנטי שלהם או התדירות מבשרת. כתוצאה מכך, טכניקה זו מאפשרת לחוקר ישירות לעקוב אחר אוכלוסיות תאי T אנדוגני אנטיגן ספציפי ממערכות ניסיוניות vivo מרמותיהם התמימות דרך כל השלבים של התגובה החיסונית.

פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש בpMHC כיתה השנייה (pMHCII) tetramers להעשיר CD4 epitope ספציפי + תאי T מאיבר הלימפה המשניהים של עכברים. עם זאת, הטכניקה היא ישימה גם לtetramers pMHC הכיתה (pMHCI) וCD8 + תאי T 9. בשונה מסוג CD4, CD8 coreceptor משחק תפקיד משמעותי בייצוב אינטראקציות TCR-MHC, וזה יכול להיות השלכות מעשיות לצביעת pMHCI tetramer 10. בעיקר, השימוש בנוגדני CD8 צריך להיות מוגבל לשיבוטים שלא לפגוע CD8-tetramer מחייב, והם צריכים להיות נוספו תאים לאחר צביעת tetramer. ואכן, כמה tetramers pMHCI כבר מהונדס עם CD8 MHCI אתרי מוטציה מחייב למתן מחייב ספציפית לתאי T CD8 + 11,12.

ריכוז tetramer, זמן דגירה, וטמפרטורת דגירה יכולים מאוד להשפיע על היעילות של מכתים tetramer, ותנאים צריכים להיות מותאמים כדי להשיג את השילוב הטוב ביותר של אות גבוהה tetramer, אות רקע נמוכה, הפנמת tetramer נמוכה, ושינויים מינימאליים לפיזיולוגיה של תא. באופן אידיאלי, תנאים אלה, צריכים בדואר נקבע אמפירי עבור כל ריאגנט ייחודי. בידות שלנו, לעומת זאת, ריכוז סופי של 10 ננומטר ודגירה של 1 שעה בטמפרטורת חדר מספקים תנאים הגנריות טובים עבור רוב tetramers pMHCI או pMHCII. באופן כללי, tetramers pMHCI נראה כתם בקלות רבה יותר מאשר tetramers pMHCII, וצביעה לעתים קרובות ניתן לבצע ב 4 ° C עבור קטן כמו 30 דקות.

הסולם של הליך זה מתאים לניתוח של כמעט כל איברי הלימפה המשניים של עכבר במדגם יחיד. לכן, כל מדגם מייצג ניתוח מקיף למדי של כל הרפרטואר במחזור ההיקפי תא T של עכבר. תאי T epitope ספציפיים יכולים גם להיות מועשרים מרקמות רלוונטיות אחרות, כולל 13,14 התימוס. כאשר thymii 4-5 עכברים בשבוע ישנים מנותח, thymocytes החיובי היחיד epitope הספציפי ניתן להבחין במספרים דומים לאלו של תאי T נאיביים פריפריה. thymocytes epitope הספציפי הכפול חיובי,עם זאת, קשים מאוד לזיהוי בשל הרמות הנמוכות שלהם ביטוי TCR.

פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לאדם לזהות CD4 epitope ספציפי + או CD8 + תאי T בדם או רקמות אחרות 15-17. התדירות של תאי T epitope ספציפיים היא בערך אותו הדבר בין עכברים ובני אדם 17, ולכן הניתוח של 50-100 המ"ל של דם יניב מספרים דומים של תאי T epitope ספציפיים כמו טחול נקווה ובלוטות לימפה של עכבר 18.

אתגר עיקרי בניתוח cytometric זרימת התאים הבאים העשרה tetramer מבוסס הוא אירועים סלולריים אמיתיים להבחין מרקע. זה בעיקר בשל העובדה שתאים רבים autofluorescent גם העשירו את הלא במיוחד במהלך התהליך. אם לא מתוך זהירות מגודרת, תאי autofluorescent אלה יכולים להופיע כתאי שווא tetramer חיובי ולזרוק את הדיוק של הניתוח, בייחוד במקרה של T הנאיבי הנדיר התא populations. הפרוטוקול שלנו מעסיק אסטרטגית gating שני שלבים שבי CD3 אירועים + 1 הם מגודרים משושלת מזבלה + אירועים, ולאחר מכן מסוג CD4 + אירועים הם מגודרים מאירועים CD8 +. בתהליך זה, תאי autofluorescent, אשר נוטים לשקר לאורך מרכז האלכסון של כל חלקת FACS, נמצאים מחוץ מגודר של הניתוח בשני שלבים איטרטיבי. ההסרה היעילה של אירועי autofluorescent מגיעה במחיר של צבעי ניאון רבים, ולכן אנחנו מאוד ממליצים על השימוש בcytometers תזרים המסוגלים לפחות 6 פרמטרי ניאון.

tetramers pMHC ביותר הם מצומדת לPE ו APC בשל הבהירות של fluorochromes אלה, ונגד PE ואנטי APC microbeads המגנטי זמין כדי לאפשר העשרה איתם. עם זאת, fluorochromes האחר יכול לשמש גם כל עוד microbeads המגנטי המתאים זמין. אכן, tetramers המרובה עם תוויות fluorochrome שונות יכול לשמש יחד עם המיקרופון המקביל נוגדן מצומדותrobeads בו זמנית מעשיר אוכלוסיות תאי T מרובות epitope ספציפיים מאותו המדגם. נציין התקנה בסיסית מאוד בנוגדני fluorochrome כי הוא מותאם לשימוש בPE-וtetramers APC-הכותרת (טבלה 1), אבל הרבה שילובים יעילים אחרים אפשריים כדי להגדיל את הגמישות בחקר סמני פנוטיפי.

CD8 + אוכלוסיות תאי T יכולים לשמש כשליטה שלילית פנימית, שכן הם לא צריכים להיקשר לligands pMHCII (ולהיפך לCD8 + העשרת תא T epitope ספציפית). התדירות של tetramer + CD8 + תאים במדגם מספקת הערכה טובה של הרמה מכתימה tetramer רקע, למרות שתום לב tetramer חיובי CD8 + תאי T עם ייחוד צולב מוגבל לאפיטופים pMHCII יכולים להתקיים בתדרים קטנים מאוד 19. לעתים במהלך תגובה חיסונית חזקה מאוד, תאים אלו יכולים להתקיים בתדרים מורחבים. אם תרצה, TCR T המהונדס שנינות תאיםניתן להשתמש h או בלי סגולי epitope רלוונטי כפקדים חיוביים ושליליים נוספים. שים לב כי מסיבות שאינן ידועות, והחלק מהתאים מהונדסים hybridomas TCR לא יכתימו גם עם tetramers הרלוונטי שלהם.

הפרוטוקול שלנו כרוך בשימוש בחרוזי ספירת ניאון כדי לסייע בחישוב של מספרים סלולריים. אמנם ניתן להשיג ספירת תאים ידניים עם hemacytometer, אנו מוצאים כי השימוש בתוצאות ספירת חרוזים בדיוק ניסויי גדול בהרבה, במיוחד כאשר חוקרים שונים מעורבים. בגלל המספרים והנפחים הקטנים של תאים, המטופלים בפרוטוקול זה, המזעור של שגיאה ניסויית צריך להיות בעדיפות גבוהה.

מכתים tetramer תואם קיבעון תא וpermeabilization, ומספר מחקרים נתחו ציטוקינים תאיים וביטוי גורם שעתוק בתאים בהצלחה לאחר העשרת תאי tetramer המבוסס 20,21.עם זאת, הצעדים הנוספים המעורבים יתרמו להפסדים סלולריים נוספים בדגימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לין לורנס אנדרה האן ולתמיכה טכנית, וחברים של ג'נקינס המעבדה לעזרה בפיתוח של פרוטוקול זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources
Anti-PE conjugated magnetic microbeads Miltenyi 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic microbeads Miltenyi 130-090-855
LS magnetic columns Miltenyi 130-042-401
MidiMACS or QuadroMACS magnet Miltenyi 130-042-302 or 130-090-976
Cell counting beads Life Technologies PCB-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
  2. Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
  3. Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
  4. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  5. Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
  7. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  8. Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
  10. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  11. Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
  12. Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
  13. Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
  14. Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
  15. Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
  16. Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
  17. Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
  18. Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
  19. Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
  20. Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
  21. Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).

Tags

אימונולוגיה גיליון 68 ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית תאי T רצפטור התא T tetramer cytometry זרימה אנטיגן ספציפיים אימונולוגיה תגובה חיסונית מגנטיים העשרה,
פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legoux, F. P., Moon, J. J.… More

Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells. J. Vis. Exp. (68), e4420, doi:10.3791/4420 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter