Summary
يوصف تقنية تجريبية لعلاج العيوب غضروفي في مفصل الركبة الأرنب. غرس غضروفية ذاتي المصنف على مصفوفة هو وسيلة مقبولة تماما لإعادة عرض وإصلاح الآفات الغضروف المفصلي تقديم نتائج مرضية على المدى الطويل. مصفوفة بمساعدة زرع خلية غضروفية ذاتي (MACT) يقدم طريقة زرع موحدة، وأنشأ سريريا.
Abstract
تعتبر عيوب الغضروف المفصلي مشكلة صحية كبيرة بسبب الغضروف المفصلي لديه قدرة محدودة على التجدد الذاتي 1. الآفات الغضروف دون علاج يؤدي إلى آلام مستمرة، وتؤثر سلبا على نوعية الحياة ويؤهب لالتهاب المفاصل. خلال العقود الماضية، وقد تم تطوير العديد من التقنيات الجراحية لعلاج هذه الآفات. ولكن، حتى الآن لم يكن من الممكن لتحقيق إصلاح كامل من حيث تغطية الخلل مع زجاجي الغضروف المفصلي أو توفير الانتعاش مرضية على المدى الطويل 2-4. ولذلك، لا تزال هناك إصابات الغضروف المفصلي هدفا رئيسيا لتقنيات التجدد مثل هندسة الأنسجة. وعلى النقيض من التقنيات الجراحية الأخرى، والتي غالبا ما تؤدي إلى تكوين أنسجة ليفية أو الليفية الغضروفية، ويهدف هندسة الأنسجة في استعادة كامل البنية المعقدة وخواص الغضروف المفصلي الأصلي باستخدام إمكانات مكون للغضروف من الخلايا المزروعة. Rفتحت التطورات ecent آفاقا واعدة لعلاج الغضروف التجدد.
تم تنفيذ النهج القائم على الخلية الأولى لعلاج الغضروف كامل سمك أو آفات عظمي غضروفي في عام 1994 من قبل لارس بيترسون وماتس Brittberg الذي كان رائدا السريرية زرع خلية غضروفية ذاتي (ACI) 5. اليوم، يتم سريريا راسخة تقنية لعلاج عيوب غضروف زجاجي كبير في الركبة، والحفاظ على نتائج سريرية جيدة حتى بعد مرور 10 إلى 20 سنة غرس 6. في السنوات الأخيرة، وغرس غضروفية ذاتي خضع لعملية التقدم السريع. أصبح استخدام وسيلة ثلاثية الأبعاد الكولاجين مصفوفة الاصطناعية التي يتم زراعتها الخلايا بعد ذلك أكثر وأكثر شعبية 7-9.
MACT تضم اثنين من العمليات الجراحية: أولا، من أجل جمع غضروفية، خزعة الغضروف يحتاج إلى أن يؤديها من منطقة الغضروف تحمل الوزن غير روقال انه مفصل الركبة. ثم، يتم استخراج غضروفية، وتنقيته وتوسيعها لعدد الخلايا في المختبر كافية. ثم هي المصنفة غضروفية على مصفوفة ثلاثية الأبعاد، ويمكن بعد ذلك يتم إعادة زرعها. عند إعداد زرع الأنسجة المهندسة، ومعدل الانتشار وقدرة التفريق الحاسم لتجديد الأنسجة ناجحة 10. ويعتقد أن استخدام مصفوفة ثلاثية الأبعاد باعتبارها الناقل الخليوي لدعم هذه الخصائص الخلوية 11.
سوف بروتوكول التالية تلخيص ويبرهن على وجود تقنية لعزل غضروفية من الخزعات الغضروف، انتشارها في المختبر، وبذر بهم في الصعود إلى 3D مصفوفة (غضروفي جايد، المواد الحيوية Geistlich، Wollhusen، سويسرا). وأخيرا، سوف يمكن وصفها غرس للبنيات الخلية مصفوفة في عيوب غضروفي مصطنع من مفصل الركبة والأرنب. هذه التقنية يمكن استخدامها في بيئة تجريبيةلمزيد من التجارب من إصلاح الغضروف.
Protocol
A. الغضروف خزعة (غرفة الجراحة؛ الخطوات 1-5 في غرفة تحضير غير معقمة)
- إجراء مراقبة الوزن النهائي للأرنب (نيوزيلندا الأرنب الأبيض، أنثى، 3،5-4،0 كجم من وزن الجسم، 6 أشهر من العمر) من أجل أن تكون قادرة على المخدرات جرعة بشكل صحيح ومراقبة الوزن اللاحقة لعملية جراحية.
- لحث على التخدير لأرنب عن طريق الحقن في الوريد من 10 مغ / كغ البروبوفول.
- بعد التنبيب، والحفاظ على التخدير مع 1.5 ملغ / كغ / دقيقة البروبوفول و 0.05 مغ / كغ الفنتانيل عن طريق الوريد. رصد التخدير باستخدام capnography، التأكسج النبض ومعدل النبض.
- يحلق في الركبة وسيتم تشغيلها على مع المقص الكهربائي والفراغ الفراء.
- تطهير الركبة حليق تماما، وتغطي بقية الأرانب بضمادة معقمة.
- جس الرضفة وإجراء شق الجلد بشكل إعلامي من الرضفة.
- فتح مفصل الركبة قبل بضع المفصل المحيط بالرضفة الإنسي تحت ظروف معقمة. في محاولة لتجنب قطع أي سو الصغيرةالأوعية الدموية perficial.
- تهجير الرضفة أفقيا.
- فحص مفصل الركبة لأي الشذوذ والآفات العيانية الغضروف.
- بعناية قشر قطعة الغضروف الصغيرة (2-3 ملم) من بكرة عظم الفخذ مع مشرط معقم (الشكل 1).
- وضع على الفور هذه الخزعات غضروف في أنبوب مل 50 مع المتوسطة كاملة (DMEM + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (القلم / بكتيريا)) إلى مواصلة ثقافة في المختبر مباشرة بعد العملية.
- تنظيف العيوب وشطف لهم مع ملحي معقم.
- إعادة الرضفة داخل أخدود البكرة.
- إغلاق الجرح في طبقات مع الغرز زر واحد (VICRYL 4-0) وخياطة الجلدي المستمرة (Monocryl 4-0). استخدام مواد خياطة الجروح للامتصاص.
- وأخيرا، ختم الجرح مع رذاذ خلع الملابس نفاذا إلى بخار الماء.
B. في المختبر الثقافة
- معالجة الخزعة جقطعة artilage في أقرب وقت ممكن بعد العملية في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة العقيمة.
- غسل العقيمة المقطوع الغضروف 2X في برنامج تلفزيوني مع الطرد المركزي في 500 x ج لاحقة لمدة 3 دقائق على RT.
- قطع الغضروف في قطعة من 1 مم 3، ونقل إلى 50 مل فالكون وهضمها على شاكر لمدة 30 دقيقة مع 10 مل التربسين EDTA-(0.25٪)، و 10 مل PBS لمدة 30 دقيقة
- بعد 30 دقيقة، ووقف trypsinization بإضافة المتوسطة كاملة. ثم، يهز قطعة غضروف لآخر لمدة 12 ساعة مع كولاجيناز A (0.21 U / ملغ) في المتوسط مجانا المصل (DMEM + 1٪ القلم / بكتيريا).
- أجهزة الطرد المركزي في الحل الناتج في 170 x ج لمدة 3 دقائق على RT.
- Resuspend الكريات خلية في 5 مل المتوسطة كاملة.
- البذور غضروفية المعزولة إلى 25 سم 2 قوارير زراعة الأنسجة في 5 مل المتوسطة كاملة والبقاء على ثقافة الأنسجة ترطيب حاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- تنمو غضروفية لكثافة 80٪.
- الإفراج عن جمعة الخلاياالقوارير المضغوطة عن طريق الغسيل في برنامج تلفزيوني قبل تعريض 2X إلى 0.05٪ التربسين EDTA-لمدة 3 دقائق. مرة واحدة غضروفية فصل، ووقف trypsinization بإضافة من 10 ميكرولتر المتوسطة كاملة.
- الطرد المركزي تعليق في 300 x ج (3 دقائق) وبيليه resuspend في المتوسط كاملة.
- خلايا البذور في قوارير زراعة الأنسجة (75 سم 2) والانقسام في نسبة 1:3 (~ 5،000 خلية / سم 2) كل يوم 5 أو عشر على 80٪ confluency.
- تحديد أعداد الخلايا وقدرتها على البقاء من قبل التريبان الأزرق تلطيخ.
C. الخلوي البذر من مصفوفة
- قبل أن يغسل زرع الخلايا والإفراج كما هو موضح أعلاه. تنفيذ عدد خلايا ونقل 5 × 10 4 خلايا في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. ثم الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- بيليه resuspend في 15 ميكرولتر المتوسطة كاملة لالتشبع الكامل للمصفوفة.
- قطع طبقة ثنائية الكولاجين سقالة للأبعاد الدقيق للخلل البكرية بواسطة خزعة العقيمةلكمة.
- مكان المصفوفة إلى الحجم المناسب الأنسجة صحن الثقافة (على سبيل المثال لوحات 24 أيضا).
- خلايا البذور على مسامية، الجانب الخلية لاصقة من المصفوفة. هذا تردع الهجرة الخلية بعيدا عن المصفوفة.
- ترك المصفوفات المصنفة الخلية دون مزيد من الخلايا المتوسطة الثقافة في حاضنة لمدة 1 ساعة للسماح للالتزام الكامل للغضروفية.
- ثم، مكان الخلية مصفوفة يبني في حاويات زراعة (على سبيل المثال لوحات 24 أيضا) مع المتوسطة كاملة جديدة. والحرص على عدم غسل خارج أي خلايا قبالة مصفوفة على الرغم من الالتزام القوي من المتوقع.
- الآن، يمكن أن تؤخذ خلية مصفوفة بنيات إلى غرفة الجراحة لإعادة التوطين.
D. مصفوفة بمساعدة زرع خلية غضروفية ذاتي
- أداء بضع المفصل المحيط بالرضفة إلى الركبة المقابل كما هو موضح أعلاه (A. 1-8).
- إنشاء اثنين من العيوب غضروفي معزولة في الأخدود البكرية مع operatin الهواء العقيمز قوة الحفر (3.6 مليمتر في القطر).
- تنظيف عيب وشطف مع ملحي معقم.
- وينبغي إيلاء اهتمام لا لفتح تجويف نخاع في أي وقت. إذا لزم الأمر، وختم الجزء السفلي من العيوب مع مكواة الكهربائية ضد النزيف.
- زرع المصفوفات المصنف مع غضروفية مثقف مع مسامية الجانب السلبي الوجه (الشكل 2). ثم الصحافة تنسجم مع الحفر وتدفق سطح المحيط.
- ختم المصفوفات مزروع مع قليلا من الغراء الليفين (Tissucol الثنائي S) لضمان تثبيت آمن.
- بعد تخثر الدم، انتقال الرضفة داخل أخدود البكرية وتطبيق مجموعة كاملة من الحركة لمفصل الركبة عدة مرات.
- تهجير الرضفة أفقيا مرة أخرى والتحقق من أي حدث أو علامة على عدم استقرار تثبيت. يجب أن تعقد يزال المصفوفات في المكان.
- استبدال الرضفة مرة أخرى، وإنهاء العملية مع إغلاق الجرح في طبقات ورذاذ خلع الملابس كما هو موضح أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح تقنية جراحية وصفت العزلة الناجحة وغرس غضروفية ذاتي إلى خلل غضروفي الاصطناعي. نتج عن الإعداد التجريبية في الاندماج الناجح للزرع في الغضروف المحيطة بها.
بعد 12 أسبوعا في الجسم الحي، وقد شغل العيب غضروفي بواسطة إصلاح الأنسجة مع سطح متجانسة وسليمة، مما قلل إجهاد القص والأضرار التي لحقت زرع (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، كان ينظر إلى أي تضخم أو تكلس من عملية الزرع. أظهرت إصلاح الأنسجة نوعية قاسية وصلبة، والتي كانت مماثلة لأنسجة السليمة المحيطة الغضروف. وهذا جانب مهم لزيادة الحمل على الغضاريف المجاورة نظرا لعدم كفاية خصائص النشاط الحيوي من عملية الزرع سيكون خطرا على انحطاط سابق لأوانه. وعلاوة على ذلك، والكسب غير المشروع التبطين لم يحدث. بعد أن قطع الغشاء إلى نفس حجم الخلل قبل الجراحة، أي fissuتم تجنبها حلقة أو انشقاقات بين زرع والغضاريف المحيطة بها.
الشكل 1. أحادي الطبقة من غضروفية ثقافة الأساسي في 80٪ confluency.
الشكل 2. أخذ غضروف خزعة من بكرة الأخدود الفخذ.
الشكل (3). مصطنع عيب غضروف البكرية.
الشكل 4. بعد فتح الركبة 12 أسبوعا مشتركة زرع غشاء المصنف مع غضروفية ذاتي إلى ما قبلحفر عيب غضروفي (السهم الأحمر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر بروتوكول المعروضة على تأسيس 9،12،13 واستنساخه بسهولة تقنية لعزل غضروفية ذاتي لالانتشار اللاحقة وإعادة غرس في عيوب الغضروف مصطنع في الركبتين أرنب. استخدام غضروفية ذاتي لإعادة وإصلاح الآفات الغضروف المفصلي هو بالفعل في الاستخدام السريري تقديم نتائج مرضية على المدى الطويل 6.
مشاكل كبيرة كما هو الحال مثلا تضخم السمحاق وتكلس، الكسب غير المشروع التبطين أو موقع الاعتلال المانحة حدث مع الجيل الأول والثاني من ذاتي زرع خلية غضروفية 14. ولذلك فقد طور الباحثون تقنيات باستخدام مواد قابلة للامتصاص بالجسم الخارجية لتقديم غضروفية إلى موقع الخلل. وقد ثبت مرارا وتكرارا على الأثر الإيجابي لنظام الثقافة ثلاثي الأبعاد على الحفاظ على الخصائص chondrocytic، على سبيل المثال عند استخدام الاغاروز 15، وبولي - dioxanon وpolyglactin 16، البوليستر بولي (L-lactide) (PLLA) وبولي (D، L-lactide-coglycolide) (PLGA) 17، 12 الليفين، حمض الهيالورونيك 18، 19 الجينات، والكولاجين 20 أو الكولاجين المصفوفات 9 .
الكولاجين غشاء طبقة ثنائية غضروفي جايد المستخدمة في هذه الدراسة تم تطبيقها بنجاح في العديد من الدراسات قبل السريرية قبل 9،21،22، وبالفعل جزء من التطبيقات السريرية 21،23. هيكل طبقة ثنائية الغشاء الكولاجين يقدم المكروية مستقرة للاندماج خلية غضروفية والانتشار، ويسمح لتوزيع عادل للخلايا داخل المصفوفة ويلغي إمكانية تسرب الخلية كما ينظر إليه في ACI التقليدية 11. عن طريق استخدام هذه التقنية MACT، يتم الاحتفاظ غضروفية المزروعة محليا مع بقاء المحافظة عليها. مصفوفة بمساعدة زرع خلية غضروفية ذاتي يؤدي إلى تخليقالغضروف مثل الأنسجة وتجديد ينطبق سريريا 21.
يتم قبول نموذج حيواني وصفا جيدا في علاج تجريبي من الآفات المفصلية غضروف 11،24،25. ومع ذلك، فإن الترجمة إلى روتين السريرية من النتائج الممكنة من التجارب باستخدام تقنية قدمت من الصعب لعدة أسباب. في نموذج حيواني فإنه يكاد يكون من المستحيل تحقيق غير أو جزئية تحمل الوزن في الأيام الأولى / أسابيع بعد الجراحة التي من شأنها أن يوصى بها عموما للسماح للخلايا المزروعة لتبدأ عمليات التكامل في وقت مبكر. الوزن الكامل تحمل على الفور بعد عملية جراحية يحتمل أن تضر الزرع، وبالتالي قد تؤثر على النتيجة. ولكن هذا الإعداد كان مماثلا في كل النماذج الحيوانية للمقارنة 9،12. هناك ما يبرر التجارب مع الحيوانات الكبيرة، تشبه أكثر عن كثب الوضع البشري، في الدراسات الحيوانية أخرى.
في ملخص، ومع ذلك، وأنشأت هنموذج حيواني xperimental كما هو وصفها أعلاه يوفر أساسا لإجراء مزيد من الدراسات التجريبية لإصلاح الغضروف وحتى قد تسهل تحقيق وأداء إعدادات دراسة معقدة. امتحانات تجريبية مع عوامل النمو، والحث الجينات وخصائص المصفوفة تغيير استخدام هذا النموذج الحيواني قد تكون مفيدة لتحسين المرافق الصحية القائمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل جمعية البحوث الألمانية (DFG، وسعادة 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
