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एक खरगोश मॉडल में उपास्थिपरक दोष Remodeling और मरम्मत के लिए मैट्रिक्स की मदद से ऑटोलॉगस उपास्थिकोशिका ट्रांसप्लांटेशन

Published: May 21, 2013 doi: 10.3791/4422
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 1, 3, *2,4, *1
1Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, 2Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, 3Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, 4Department of Radiology, Uniklinik Köln
* These authors contributed equally

Summary

खरगोश के पैर के घुटने में उपास्थिपरक दोष के इलाज के लिए एक प्रयोगात्मक तकनीक का वर्णन किया है. एक मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त ऑटोलॉगस chondrocytes का आरोपण संतोषजनक दीर्घकालिक परिणाम प्रदान जोड़ कार्टिलेज घावों की remodeling और मरम्मत के लिए एक अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते हैं विधि है. मैट्रिक्स की मदद से ऑटोलॉगस उपास्थिकोशिका प्रत्यारोपण (एमएसीटी) एक मानकीकृत और चिकित्सकीय स्थापित आरोपण विधि प्रदान करता है.

Protocol

ए उपास्थि बायोप्सी (सर्जरी कक्ष, गैर बाँझ तैयारी कक्ष में 1-5 कदम)

  1. ठीक खुराक दवाओं के लिए सक्षम होने के लिए और सर्जरी के लिए बाद में वजन पर नजर रखने के क्रम में खरगोश (6 महीने पुरानी न्यूजीलैंड व्हाइट खरगोश, महिला, 3.5-4.0 किलोग्राम शरीर के वजन,) के अंतिम वजन नियंत्रण प्रदर्शन करना.
  2. 10 मिलीग्राम / किग्रा propofol की एक अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा खरगोश को संज्ञाहरण प्रेरित.
  3. इंटुबैषेण के बाद, 1.5 मिलीग्राम / किग्रा / मिनट propofol और नसों 0.05 मिलीग्राम / किग्रा fentanyl साथ संज्ञाहरण बनाए रखें. Capnography, नाड़ी oximetry और पल्स दर का उपयोग करके संज्ञाहरण मॉनिटर.
  4. एक बिजली क्लिपर और वैक्यूम फर के साथ पर संचालित किया जा घुटने दाढ़ी.
  5. पूरी तरह मुंडा घुटने कीटाणुरहित और एक बाँझ ड्रेसिंग के साथ खरगोश के बाकी को कवर किया.
  6. पटेला टटोलना और वुटने की चक्की के मध्यवर्ती एक त्वचा चीरा प्रदर्शन करते हैं.
  7. बाँझ शर्तों के तहत एक औसत दर्जे का parapatellar संधिकर्तन द्वारा संयुक्त घुटने खोलें. किसी भी छोटे सु काटने से बचने की कोशिशperficial रक्त वाहिकाओं.
  8. पार्श्वतः पटेला विस्थापित.
  9. किसी भी विसंगतियों और स्थूल उपास्थि घावों के लिए घुटने के जोड़ का निरीक्षण किया.
  10. ध्यान से एक बाँझ स्केलपेल (चित्रा 1) के साथ घिरनी या चर्खी जैसा पुर्जा या भाग अस्थि ग्रीवा के बाहर छोटे उपास्थि टुकड़े (2-3 मिमी) छील.
  11. तुरंत पूरा मध्यम के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में इन उपास्थि बायोप्सी जगह (DMEM + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / Strep)) आपरेशन के बाद इन विट्रो संस्कृति सही में साथ जारी रखने के लिए.
  12. दोष स्वच्छ और बाँझ खारा के साथ उन्हें कुल्ला.
  13. घिरनी या चर्खी जैसा पुर्जा या भाग नाली भीतर पटेला का स्थान बदलें.
  14. एक बटन टांके (4-0 Vicryl) और एक सतत त्वचीय सिवनी (4-0 Monocryl) के साथ परतों में घाव बंद. Absorbable सिवनी सामग्री का प्रयोग करें.
  15. अंत में, जल वाष्प को पारगम्य ड्रेसिंग एक स्प्रे के साथ घाव मुहर.

इन विट्रो संस्कृति में बी

  1. Biopsied ग संसाधितजितनी जल्दी हो सके एक बाँझ लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में ऑपरेशन के बाद artilage टुकड़े.
  2. आरटी पर 3 मिनट के लिए 500 XG पर बाद centrifugation के साथ पीबीएस में बाँझ काटा उपास्थि 2x धो लें.
  3. 30 मिनट के लिए 1 मिमी 3, एक 50 मिलीलीटर बाज़ को हस्तांतरण टुकड़ों में उपास्थि कटौती और 10 मिलीलीटर trypsin EDTA (0.25%) और 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर उन्हें पचाने
  4. 30 मिनट के बाद, पूरा मध्यम जोड़कर trypsinization बंद करो. फिर, सीरम मुक्त माध्यम में Collagenase ए (0.21 यू / मिलीग्राम) (DMEM के 1% पेन / Strep) के साथ 12 घंटे के लिए किसी अन्य के लिए उपास्थि टुकड़े हिला.
  5. आरटी पर 3 मिनट के लिए 170 XG पर जिसके परिणामस्वरूप समाधान अपकेंद्रित्र.
  6. 5 मिलीलीटर पूरा मध्यम में सेल छर्रों Resuspend.
  7. बीज 5 मिलीलीटर पूरा मध्यम और 37 पर एक humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखने डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 25 सेमी 2 टिशू कल्चर बोतल पर पृथक chondrocytes.
  8. 80% की एक घनत्व को chondrocytes आगे बढ़ें.
  9. कोशिकाओं च रिलीज3 मिनट के लिए 0.05% trypsin-EDTA को प्रकाश में लाने से पहले पीबीएस 2x में धोने से रॉम बोतल. Chondrocytes अलग एक बार, 10 μl पूरा मध्यम के अलावा द्वारा trypsinization बंद करो.
  10. पूरा मध्यम में 300 XG (3 मिनट) और resuspend गोली पर निलंबन अपकेंद्रित्र.
  11. टिशू कल्चर बोतल (75 सेमी 2) और 01:03 के अनुपात (~ 5000 कोशिकाओं / 2 सेमी) हर 5 वें दिन में या confluency 80% पर विभाजन में बीज कोशिकाओं.
  12. Trypan नीले धुंधला द्वारा सेल नंबर और व्यवहार्यता का निर्धारण करते हैं.

मैट्रिक्स की सी. सेल बोने

  1. ऊपर वर्णित के रूप में आरोपण धोने और रिहाई कोशिकाओं से पहले. सेल गिनती प्रदर्शन करना और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं हस्तांतरण. फिर आरटी पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र.
  2. मैट्रिक्स की एक पूरी संतृप्ति के लिए 15 μl पूरा मध्यम में resuspend गोली.
  3. एक बाँझ बायोप्सी द्वारा घिरनी जैसा दोष का सटीक आयामों को बाईलेयर कोलेजन पाड़ कटपंच.
  4. एक उचित आकार टिशू कल्चर पकवान (जैसे 24 अच्छी तरह प्लेटें) में जगह मैट्रिक्स.
  5. मैट्रिक्स के झरझरा, सेल चिपकने वाला पक्ष पर बीज कोशिकाओं. इस मैट्रिक्स से दूर सेल प्रवास deters.
  6. Chondrocytes का पूर्ण पालन करने की अनुमति के लिए 1 घंटे के लिए एक मशीन के भीतर आगे सेल संस्कृति माध्यम के बिना सेल वरीयता प्राप्त matrices के लिए छोड़ दें.
  7. ताजा पूरा मध्यम के साथ संवर्धन कंटेनर (उदाहरण के लिए 24 अच्छी तरह प्लेटें) में तो, जगह सेल मैट्रिक्स निर्माणों. मजबूत पालन की उम्मीद है, भले ही मैट्रिक्स बंद किसी भी कोशिकाओं को धोने के लिए नहीं ख्याल रखना.
  8. अब, सेल मैट्रिक्स निर्माणों फिर आरोपण के लिए शल्य चिकित्सा कक्ष में ले जाया जा सकता है.

डी. मैट्रिक्स की मदद से ऑटोलॉगस उपास्थिकोशिका ट्रांसप्लांटेशन

  1. (ए 1-8) से ऊपर वर्णित के रूप में contralateral घुटने parapatellar संधिकर्तन प्रदर्शन करना.
  2. एक बाँझ हवा operatin साथ घिरनी जैसा नाली में दो अलग उपास्थिपरक दोष बनाएँछ शक्ति ड्रिल (व्यास में 3.6 मिमी).
  3. दोष स्वच्छ और बाँझ खारा से कुल्ला.
  4. ध्यान किसी भी समय मज्जा गुहा को खोलने के लिए नहीं दिया जाना चाहिए. यदि आवश्यक हो, खून बह रहा है के खिलाफ विद्युत दाग़ना साथ दोषों के नीचे सील.
  5. झरझरा ओर चेहरा नीचे (चित्रा 2) के साथ सुसंस्कृत chondrocytes साथ वरीयता प्राप्त matrices के प्रत्यारोपण. फिर छेद ड्रिल में प्रेस फिट और आसपास के सतह फ्लश.
  6. सुरक्षित निर्धारण को आश्वस्त करने के आतंच गोंद (Tissucol डुओ एस) का एक छोटा सा के साथ प्रत्यारोपित मेट्रिसेस सील.
  7. थक्के के बाद, घिरनी जैसा नाली भीतर पटेला स्थानांतरित करना और संयुक्त घुटने एक बार कुछ करने के लिए गति की पूरी रेंज लागू होते हैं.
  8. पार्श्वतः एक बार फिर से पटेला विस्थापित और अस्थिरता निर्धारण की किसी भी घटना या हस्ताक्षर के लिए जाँच करें. matrices के स्थान पर अब भी आयोजित किया जाना चाहिए.
  9. फिर पटेला बदलें और ऊपर वर्णित के रूप में ड्रेसिंग परतों और स्प्रे में घाव बंद होने के साथ आपरेशन खत्म.

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Representative Results

वर्णित सर्जिकल तकनीक एक कृत्रिम उपास्थिपरक दोष में ऑटोलॉगस chondrocytes का एक सफल अलगाव और आरोपण परमिट. प्रयोगात्मक सेटअप आसपास के कार्टिलेज में प्रत्यारोपण के एक सफल एकीकरण में हुई.

Vivo में 12 सप्ताह के बाद, उपास्थिपरक दोष प्रत्यारोपण (चित्रा 4) के लिए कतरनी तनाव और नुकसान कम है, जो एक समरूप और बरकरार सतह, साथ मरम्मत ऊतक से भर गया था. इसके अलावा, प्रत्यारोपण का कोई अतिवृद्धि या कड़ा हो जाना देखा गया था. मरम्मत ऊतक स्वस्थ आसपास उपास्थि ऊतक के बराबर था जो एक कड़ी और ठोस गुणवत्ता, दिखाया. प्रत्यारोपण की अपर्याप्त biomechanical गुणों के कारण आसन्न उपास्थि पर बढ़ा लोड समय से पहले अध: पतन के लिए एक खतरा होगा क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण पहलू था. इसके अलावा, delamination एक भ्रष्टाचार नहीं हुआ है. किसी भी fissu, preoperatively दोष का एक ही आकार के लिए झिल्ली में कटौती करने के बादप्रत्यारोपण और आसपास उपास्थि के बीच अंगूठी या clefts टाला गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. 80% confluency पर chondrocytes प्राथमिक संस्कृति की monolayer.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक उपास्थि ऊरु घिरनी या चर्खी जैसा पुर्जा या भाग नाली के बाहर बायोप्सी ले रही है.

चित्रा 3
चित्रा 3. कृत्रिम रूप से घिरनी जैसा उपास्थि दोष बनाई.

चित्रा 4
4 चित्रा. खोले गए संयुक्त घुटने 12 सप्ताह के एक पूर्व में ऑटोलॉगस chondrocytes साथ वरीयता प्राप्त एक झिल्ली के आरोपण के बाद-Drilled उपास्थिपरक दोष (लाल तीर).

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल खरगोश घुटनों में कृत्रिम रूप से बनाया उपास्थि दोष में बाद के प्रसार और फिर आरोपण के लिए ऑटोलॉगस chondrocytes अलग करने के लिए एक 9,12,13 स्थापित और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक प्रदान करता है. जोड़ कार्टिलेज घावों की remodeling और मरम्मत के लिए ऑटोलॉगस chondrocytes का उपयोग नैदानिक ​​इस्तेमाल संतोषजनक दीर्घकालिक परिणाम 6 उपलब्ध कराने में पहले से ही है.

Periosteal अतिवृद्धि और कड़ा हो जाना उदाहरण के लिए जैसे प्रमुख समस्याओं, भ्रष्टाचार delamination या दाता साइट रुग्णता ऑटोलॉगस उपास्थिकोशिका आरोपण 14 की पहली और दूसरी पीढ़ी के साथ हुई. इसलिए शोधकर्ताओं दोष साइट के लिए chondrocytes देने के लिए एक्सोजेनस bioresorbable सामग्री का उपयोग करने की तकनीक विकसित की है. agarose 15 का उपयोग करते समय chondrocytic विशेषताओं के रखरखाव पर तीन आयामी संस्कृति प्रणाली के सकारात्मक प्रभाव को बार बार उदाहरण के लिए, प्रदर्शन किया गया है, पाली - dioxanon और polyglactin 16, पॉलिएस्टर पाली (एल Lactide) (PLLA) और पाली (डी, एल Lactide-coglycolide) (PLGA) 17, आतंच 12, hyaluronan 18, alginate 19, कोलेजन 20 या कोलेजन matrices के 9 .

इस अध्ययन में इस्तेमाल बाईलेयर कोलेजन झिल्ली Chondro-Gide सफलतापूर्वक 9,21,22 पहले कई preclinical अध्ययन में आवेदन किया है और पहले से ही नैदानिक ​​अनुप्रयोगों 21,23 का हिस्सा है किया गया है. कोलेजन झिल्ली की बाईलेयर संरचना, उपास्थिकोशिका एकीकरण और प्रसार के लिए एक स्थिर microenvironment प्रदान करता है मैट्रिक्स कोशिकाओं के भीतर एक भी वितरण के लिए अनुमति देता है और यह पारंपरिक एसीआई 11 में देखा जाता है के रूप में सेल रिसाव की संभावना समाप्त. इस एमएसीटी तकनीक का उपयोग करके, प्रतिरोपित chondrocytes स्थानीय स्तर पर बनाए रखा व्यवहार्यता के साथ रखा जाता है. मैट्रिक्स की मदद से ऑटोलॉगस उपास्थिकोशिका प्रत्यारोपण के संश्लेषण के लिए सुरागउत्थान ऊतक उपास्थि की तरह है और 21 चिकित्सकीय लागू है.

वर्णित पशु मॉडल अच्छी तरह से जोड़ कार्टिलेज घावों 11,24,25 की प्रयोगात्मक उपचार में स्वीकार किया जाता है. हालांकि, प्रस्तुत तकनीक का उपयोग कर प्रयोगों के संभावित परिणामों के नैदानिक ​​नियमित करने के लिए अनुवाद कई कारणों के लिए मुश्किल है. एक पशु मॉडल में यह आम तौर पर प्रत्यारोपित कोशिकाओं जल्दी एकीकरण की प्रक्रिया के साथ शुरू करने की अनुमति देने की सिफारिश की जाएगी जो सर्जरी के बाद पहले दिन / सप्ताह में वजन असर गैर या आंशिक प्राप्त करने के लिए लगभग असंभव है. तुरंत सर्जरी के बाद असर पूरा वजन संभावित प्रत्यारोपण नुकसान पहुँचा सकता है और इसलिए परिणाम को प्रभावित कर सकता है. लेकिन इस सेटिंग 9,12 तुलनीय सभी पशु मॉडल में समान था. अधिक बारीकी से मानव की स्थिति जैसी बड़े जानवरों,, के साथ प्रयोग आगे जानवरों के अध्ययन में warranted रहे हैं.

सारांश में, हालांकि, एक ई स्थापितयह ऊपर वर्णित है के रूप में xperimental पशु मॉडल उपास्थि की मरम्मत के आगे प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए एक आधार प्रदान करता है और भी जटिल अध्ययन सेटिंग्स की प्राप्ति और प्रदर्शन की सुविधा हो सकती है. इस पशु मॉडल का उपयोग कर वृद्धि कारक है, जीन शामिल है और बदल रहा है मैट्रिक्स गुणों के साथ प्रायोगिक परीक्षाओं की स्थापना नैदानिक ​​सेटिंग में सुधार करने में मददगार हो सकती है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस परियोजना जर्मन रिसर्च एसोसिएशन (DFG, महामहिम 4578/3-1) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of reagent/equipment Company Catalogue Number Comments
DMEM Biochrom AG F 0415
Collagenase A Roche 10 103 586 001 0.21 U/mg
Fetal calf serum (FCS) PAN Biotech GmbH 3702-P103009
Propofol Fresenius Kabi
Penicillin/Streptomycin Biochrom AG A 2213 10,000 U/ml/10,000 μg/ml
PBS Dulbecco (1X) Biochrom AG L1815
Ethanol (70%) Merck KgaA 410230
Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % Biochrom AG L2163 in PBS w/o Ca2+, Mg2+
Fentanyl Delta Select GmBH 1819340
NaCl solution (0.9%) Bbraun 8333A193
Tissue culture dishes 100 mm/150 mm TPP AG 93100/93150 Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2
Tissue culture flasks 25/75 mm2 TPP AG 90025/90075 25 mm2, 75 mm2
Centrifuge Tubes (50 ml) TPP AG 91050 Gamma-sterilized
Hemocytometer Brand GmbH+Co KG 717810 Neubauer
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich L8154
Spray dressing (OpSite) Smith&Nephew 66004978 Permeable for water vapor
Chondro-GideÒ Geistlich Pharma AG 30915.5
Biopsy Punch pfm medical ag 48351
Tissucol Duo S Baxter 3419627 0.5 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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