Summary
Una tecnica sperimentale per il trattamento dei difetti condrali in ginocchio di coniglio è descritto. L'impianto di condrociti autologhi seminate su una matrice è un metodo ben accettato per il rimodellamento e la riparazione di lesioni della cartilagine articolare che fornisca risultati soddisfacenti a lungo termine. Matrix-assistito trapianto autologo di condrociti (MACT) offre un metodo standardizzato di impianto e clinicamente stabilita.
Abstract
Difetti della cartilagine articolare sono considerati un problema sanitario importante in quanto la cartilagine articolare ha una limitata capacità di auto-rigenerazione 1. Lesioni cartilaginee non trattate portano a dolore in corso, influenzare negativamente la qualità della vita e di predisporre per l'artrosi. Durante gli ultimi decenni, diverse tecniche chirurgiche sono state sviluppate per il trattamento di tali lesioni. Tuttavia, finora non è stato possibile ottenere una riparazione completa in termini di copertura del difetto di cartilagine ialina articolare o di fornire recupero a lungo termine soddisfacenti 2-4. Pertanto, le lesioni della cartilagine articolare rimane un obiettivo primario per le tecniche rigenerative come Tissue Engineering. A differenza di altre tecniche chirurgiche, che spesso portano alla formazione di tessuto fibroso o fibrocartilagineo, Tissue Engineering mira a ripristinare completamente la struttura complessa e le proprietà della cartilagine articolare originale utilizzando il potenziale condrogenico delle cellule trapiantate. Ralcune recenti sviluppi hanno aperto possibilità promettenti per le terapie rigenerative della cartilagine.
Il primo approccio basato cellulare per il trattamento di cartilagine a tutto spessore o lesioni osteocondrali è stata eseguita nel 1994 da Lars Peterson e Mats Brittberg pioniere clinico impianto di condrociti autologhi (ACI) 5. Oggi, la tecnica è clinicamente ben consolidata per il trattamento dei grandi difetti della cartilagine ialina del ginocchio, il mantenimento di buoni risultati clinici anche 10 o 20 anni dopo l'impianto 6. Negli ultimi anni, l'impianto di condrociti autologhi subito una progressione rapida. L'uso di un tridimensionale collageno-matrice artificiale su cui le cellule vengono successivamente reimpiantate diventata sempre più popolare 7-9.
MACT compone di due procedure chirurgiche: in primo luogo, al fine di raccogliere condrociti, una biopsia cartilagine deve essere eseguita da una zona di cartilagine non sostengono pesi tgiunto egli ginocchio. Poi, condrociti vengono estratti, purificati e ampliato per un numero di cellule sufficiente in vitro. I condrociti sono poi seminate su una matrice tridimensionale e possono essere successivamente reimpiantati. Quando si prepara un impianto tissutale, tasso di proliferazione e la capacità di differenziazione sono cruciali per una rigenerazione dei tessuti di successo 10. L'uso di una matrice tridimensionale come vettore cella è pensato per supportare queste caratteristiche cellulari 11.
Il seguente protocollo riassumerà e dimostrare una tecnica per l'isolamento di condrociti da biopsie cartilagine, la loro proliferazione in vitro e loro semina su un 3D-matrice (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Svizzera). Infine, l'impianto degli cellula-matrice-costrutti in artificialmente creati difetti condrali del ginocchio di coniglio sarà descritto. Questa tecnica può essere utilizzata come ambiente sperimentaleper ulteriori esperimenti di riparazione della cartilagine.
Protocol
A. Cartilagine Biopsia (Chirurgia in camera; passaggi 1-5 nella camera di preparazione non sterile)
- Eseguire un controllo finale peso del coniglio (New Zealand White coniglio, femmina, 3,5-4,0 kg di peso corporeo, 6 mesi) per essere in grado di dose droghe correttamente e controllare il peso conseguente alla chirurgia.
- Indurre l'anestesia per il coniglio da una iniezione endovenosa di 10 mg / kg di propofol.
- Dopo l'intubazione, mantenere l'anestesia con 1,5 mg / kg / min propofol e 0,05 mg / kg di fentanil per via endovenosa. Monitorare l'anestesia utilizzando capnography, pulsossimetria e la frequenza cardiaca.
- Shave il ginocchio da operare con un tagliatore elettrico e vuoto la pelliccia.
- Disinfettare il ginocchio rasato accuratamente e coprire il resto del coniglio con una garza sterile.
- Palpare la rotula ed eseguire una incisione cutanea mediale della rotula.
- Aprire l'articolazione del ginocchio da una artrotomia mediale parapatellare in condizioni sterili. Cercate di evitare il taglio di qualsiasi piccola suvasi sanguigni perficial.
- Spostare la rotula lateralmente.
- Ispezionare l'articolazione del ginocchio per eventuali anomalie e lesioni cartilaginee macroscopiche.
- Rimuovere con cautela piccoli pezzi di cartilagine (2-3 mm) fuori della troclea femorale ossis con un bisturi sterile (Figura 1).
- Porre immediatamente queste biopsie cartilaginee in un tubo da 50 ml con terreno completo (DMEM + 10% di siero fetale bovino (FCS) + 1% di penicillina / streptomicina (Pen / Strep)) per continuare con la cultura in vitro destra dopo l'operazione.
- Pulire i difetti e sciacquare con soluzione salina sterile.
- Riposizionare la rotula nel solco trocleare.
- Chiusura della ferita a strati con bottone singolo suture (4-0 Vicryl) e una sutura cutanea continua (4-0 Monocryl). Utilizzare materiale di sutura riassorbibile.
- Infine, sigillare la ferita con uno spray medicazione permeabile al vapore acqueo.
B. In vitro Cultura
- Elabora la biopsia cpezzi il più presto possibile dopo l'operazione in una cappa a flusso laminare sterile cultura del tessuto artilage.
- Lavare la sterile raccolto cartilagine 2x in PBS con successiva centrifugazione a 500 xg per 3 min a RT.
- Tagliare cartilagine in pezzi da 1 mm 3, trasferimento ad un Falcon 50 ml e digerire loro su un agitatore per 30 minuti con 10 ml di tripsina-EDTA (0,25%) e 10 ml di PBS per 30 min
- Dopo 30 min, interrompere tripsinizzazione aggiungendo mezzo completo. Poi, scuotere i pezzi di cartilagine per un altro per 12 ore con collagenasi A (0,21 U / mg) in mezzo privo di siero (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Centrifugare la soluzione risultante a 170 xg per 3 min a RT.
- Risospendere pellet cellulare in 5 ml di terreno completo.
- Seed i condrociti isolati su a 25 cm 2 di tessuto cultura palloni in 5 ml di terreno completo e conservare in un umidificata tessuto cultura incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Condrociti crescere ad una densità di 80%.
- Rilasciare le cellule di from boccette di lavaggio in PBS 2x prima di esporre al 0,05% tripsina-EDTA per 3 min. Una volta condrociti staccano, stop tripsinizzazione con l'aggiunta di 10 microlitri terreno completo.
- Centrifugare la sospensione di 300 g (3 min) e risospendere pellet in terreno completo.
- Cellule di semi in fiasche di coltura tissutale (75 cm 2) e Split con un rapporto di 1:3 (~ 5.000 cellule / cm 2) ogni 5 ° giorno o al momento 80% di confluenza.
- Determinare i numeri di cellulare e la vitalità di blu tripano colorazione.
C. Cell-semina di Matrix
- Prima del lavaggio impianto e cellule di rilascio come descritto sopra. Eseguire la conta cellulare e trasferire 5 x 10 4 cellule in una provetta da 1,5 ml. Quindi centrifugare a 500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Risospendere il pellet in 15 microlitri mezzo completo per una completa saturazione della matrice.
- Tagliare il doppio strato di collagene patibolo per le dimensioni esatte del difetto trocleare da una biopsia sterilepugno.
- Posto matrice in un piatto di coltura tissutale di dimensioni appropriate (come piastre da 24 pozzetti).
- Piastrare sul lato poroso, cellula-adesivo della matrice. Questo scoraggia migrazione cellulare lontano dalla matrice.
- Lascia cellula-teste di serie matrici senza ulteriore mezzo di coltura cellulare all'interno di un incubatore per 1 ora per consentire la piena aderenza dei condrociti.
- Poi, posto cellula-matrice-costrutti in contenitori di coltura (ad esempio piastre da 24 pozzetti) con terreno fresco completo. Fare attenzione a non lavare le cellule fuori della matrice, anche se forte aderenza è previsto.
- Ora, cellula-matrice-costrutti possono essere adottate per la sala operatoria per il re-impianto.
D. matrix-assisted trapianto autologo di condrociti
- Eseguire artrotomia parapatellare al ginocchio controlaterale come descritto sopra (A. 1-8).
- Creare due isolati difetti condrali nel solco trocleare con un operatin aria sterileg trapano (3,6 mm di diametro).
- Pulire il difetto e sciacquare con soluzione salina sterile.
- Occorre prestare attenzione a non aprire la cavità midollare, in qualsiasi momento. Se necessario, sigillare il fondo dei difetti con cauterizzazione elettrica contro sanguinamento.
- Impiantare le matrici seminate con i condrociti in coltura con la porosa lato rivolto verso il basso (Figura 2). Poi press-fit nei fori e lavare la superficie circostante.
- Sigillare le matrici impiantati con un po 'di colla di fibrina (Tissucol Duo S) per assicurare la fissazione sicura.
- Dopo la coagulazione, riposizionare la rotula nel solco trocleare e applicare la gamma completa di movimento al ginocchio un paio di volte.
- Spostare lateralmente, ancora una volta la rotula e verificare la presenza di qualsiasi evento o segno di fissazione instabile. Le matrici devono essere tenute ancora in vigore.
- Sostituire nuovamente la rotula e terminare l'operazione con chiusura della ferita in strati e spray medicazione come descritto sopra.
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Representative Results
La tecnica chirurgica descritta permette un isolamento di successo e l'impianto di condrociti autologhi in un difetto condrale artificiale. Il setup sperimentale ha comportato una integrazione dell'impianto nella cartilagine circostante.
Dopo 12 settimane in vivo, il difetto condrale stato riempito da tessuto di riparazione con una superficie omogenea e intatta, che ha ridotto sforzo di taglio e danneggiamento dell'impianto (Figura 4). Inoltre, nessuna ipertrofia o calcificazione della protesi è stato visto. Il tessuto di riparazione mostrato una qualità rigida e solida, che era paragonabile al tessuto cartilagineo sano circostante. Questo era un aspetto importante perché aumento del carico sulla cartilagine adiacente a causa di insufficiente proprietà biomeccaniche dell'impianto sarebbe un rischio per la degenerazione prematura. Inoltre, un innesto delaminazione non si è verificato. Dopo aver tagliato la membrana alla stessa dimensione del difetto preoperatoria, qualsiasi fissuanello o fessure tra impianto e la cartilagine circostante sono state evitate.
Figura 1. Monostrato di condrociti coltura primaria al 80% di confluenza.
Figura 2. Assunzione di una biopsia cartilagine dalla scanalatura troclea femorale.
Figura 3. Artificialmente creato difetto della cartilagine trocleare.
Figura 4. Inaugurato articolazione del ginocchio 12 settimane dopo l'impianto di una membrana seminato con condrociti autologhi in un pre-Forato difetto condrale (freccia rossa).
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Discussion
Il protocollo presentato fornisce un consolidato 9,12,13 e facilmente riproducibile tecnica per isolare i condrociti autologhi per la successiva proliferazione e re-impianto in difetti della cartilagine creato artificialmente in ginocchio coniglio. L'uso di condrociti autologhi per il rimodellamento e la riparazione di lesioni della cartilagine articolare è già in uso clinico fornire risultati soddisfacenti a lungo termine 6.
Problemi importanti come per esempio l'ipertrofia periostale e calcificazione, innesto delaminazione o morbidità del sito donatore si sono verificati con la prima e la seconda generazione di impianto autologo di condrociti 14. Pertanto i ricercatori hanno sviluppato tecniche che utilizzano materiali riassorbibili esogeni per consegnare condrociti al sito del difetto. L'effetto positivo del sistema di coltura tridimensionale sul mantenimento delle caratteristiche chondrocytic stato ripetutamente dimostrato, ad esempio usando agarosio 15, Poli - dioxanon e poliglattina 16, poliesteri poli (L-lattide) (PLLA) e di poli (D, L-lattide-coglicolide) (PLGA) 17, fibrina 12, acido ialuronico 18, alginato di 19, 20 o collagene collagene-matrici 9 .
Il doppio strato di collagene membrana Chondro-Gide utilizzato in questo studio è stato applicato con successo in diversi studi preclinici prima di 9,21,22 ed è già parte di applicazioni cliniche 21,23. La struttura a doppio strato della membrana collagene offre un microambiente stabile per l'integrazione e la proliferazione di condrociti, permette una distribuzione uniforme delle celle all'interno della matrice ed elimina la possibilità di perdite cellula come si è visto nella convenzionale ACI 11. Con l'utilizzo di questa tecnica MACT, i condrociti trapiantati vengono mantenute localmente con vitalità mantenuta. Matrix-assisted trapianto autologo di condrociti porta alla sintesi dicartilagine-come la rigenerazione dei tessuti ed è clinicamente applicabile 21.
Il modello animale descritto è ben accettato nel trattamento sperimentale di lesioni della cartilagine articolare 11,24,25. Tuttavia, la traduzione di routine clinica dei possibili risultati di esperimenti con la tecnica presentata è difficile per diverse ragioni. In un modello animale è quasi impossibile da raggiungere senza o carico parziale nei primi giorni / settimane dopo l'intervento chirurgico che sarebbe generalmente raccomandato per permettere alle cellule impiantate per iniziare con i processi di integrazione iniziali. Peso completo cuscinetto immediatamente dopo l'intervento chirurgico potrebbe potenzialmente danneggiare il trapianto e quindi potrebbe influenzare il risultato. Ma questa impostazione era simile in tutti i modelli animali comparabili 9,12. Gli esperimenti con gli animali più grandi, che assomigliano più da vicino la situazione umana, sono garantiti in ulteriori studi sugli animali.
In sintesi, tuttavia, un e stabilitoXperimental modello animale come è descritto sopra fornisce una base per ulteriori studi sperimentali di riparazione della cartilagine e potrebbe anche facilitare la realizzazione e la prestazione di impostazioni di studio complessi. Esami sperimentali con fattori di crescita, induzione genica e modifica delle proprietà della matrice che utilizzano questo modello animale potrebbe essere utile per migliorare le impostazioni clinici accertati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato dalla German Research Association (DFG, SE 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
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