Summary
토끼의 무릎 관절 chondral 결함의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 매트릭스 시드자가 연골 세포의 이식은 만족 장기적인 결과를 제공 관절 연골 병변의 개조 및 수리를위한 잘 받아 들여진 방법입니다. 매트릭스를 이용한자가 연골 세포 이식 (MACT)는 표준화 된 임상 설립 주입 방법을 제공합니다.
Abstract
관절 연골 자체 재생 1 제한된 용량을 가지고 있기 때문에 관절 연골의 결함이 주요 건강 문제로 간주됩니다. 치료 연골 병변이 지속적으로 통증을 초래할 부정적인 삶의 질에 영향을 미치는 관절염에 대한 걸리기. 지난 수십 년 동안 여러 가지 수술 기법은 이러한 병변을 치료하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 지금까지이 유리 모양의 연골과 결함을 취재하거나 만족 장기적인 복구 2-4을 제공하는 측면에서 전체 복구를 달성 할 수 없었습니다. 따라서 관절 연골의 부상은 조직 공학 등의 재생 기술에 대한 주요 대상 남아 있습니다. 흔히 섬유 또는 섬유 연골 조직의 형성으로 이어질 다른 수술 기법과는 달리 조직 공학은 완전히 이식 세포의 연골 잠재력을 사용하여 원래의 관절 연골의 복잡한 구조와 특성을 복원 목표로하고있다. Recent 발전은 재생 연골 치료를위한 유망한 가능성을 열었다.
전층 연골이나 골 연골 병변의 치료를위한 첫 번째 셀 기반의 접근 방식은 임상자가 연골 세포 이식 (ACI) 5 개척 라스 피터슨과 매트 Brittberg에 의해 1994 년에 수행되었다. 오늘날, 기술은 임상 적으로도 10~20년 주입 6 후에 좋은 임상 결과를 유지 무릎의 대형 유리 모양의 연골 결손의 치료에 잘 설정됩니다. 최근에는자가 연골 세포의 주입은 빠른 진행을 받았다. 세포가 연속적으로 심어되어있는 인공 입체 콜라겐 매트릭스의 사용은 점점 더 인기를 7-9되었다.
MACT 두 수술의 구성 : 연골 세포를 수집하기 위해, 첫째, 연골 조직 검사는 t의 비 체중 부하 연골 영역에서 수행해야그는 무릎 관절입니다. 그런 다음, 연골 세포 추출 정제 및 체외에서 충분한 세포 수로 확장되고있다. 연골 세포는 다음의 3 차원 매트릭스에 분주하고 이후에 다시 이식 할 수 있습니다. 조직 공학 이식을 준비 할 때, 확산 속도와 분화 능력은 성공적인 조직 재생 10 중요합니다. 전지 캐리어와 같은 3 차원 매트릭스의 사용은 이러한 세포의 특성 11을 지원하는 것으로 생각됩니다.
다음과 같은 프로토콜을 요약하고 연골 조직 검사에서 연골 세포의 분리에 대한 기술, 3D 매트릭스 (콘드-지드, Geistlich 생체 적합 물질, Wollhusen, 스위스) 위에 생체과 파종에서의 확산을 보여줍니다. 마지막으로, 토끼의 무릎 관절의 인위적으로 만든 chondral 결함에 셀 매트릭스 구조의 주입을 설명한다. 이 기술은 실험 설정으로 사용할 수 있습니다연골의 추가 실험.
Protocol
A. 연골 생검 (수술 룸, 비 무균 준비실에서 1-5 단계)
- 적절하게 투여 약물 수와 수술 이후의 체중을 모니터링하기 위해 토끼 (6 개월 뉴질랜드 화이트 토끼, 여성, 3.5-4.0 kg 체중)의 최종 체중 조절을 수행합니다.
- 10 ㎎ / ㎏ 프로포폴의 정맥 주사하여 토끼에 마취를 유도.
- 삽관 후 1.5 ㎎ / ㎏ / 분 프로포폴과 정맥 0.05 ㎎ / ㎏ 펜타닐로 마취를 유지합니다. 호 기말 이산화탄소 분압, 산소 포화도와 맥박수를 사용하여 마취를 모니터링합니다.
- 전기 어선 및 진공 모피에서 운영되는 무릎을 면도.
- 철저하게 면도 무릎을 소독 및 멸균 드레싱 토끼의 나머지 부분을 커버한다.
- 슬개골을 만져 및 슬개골의 내측 피부 절개를 수행합니다.
- 무균 조건 하에서 중간 parapatellar arthrotomy하여 무릎 관절을 엽니 다. 어떤 작은 스와 절단 피하려고perficial 혈관.
- 옆으로 슬개골을 치환.
- 어떤 이상과 거시적 연골 병변 무릎 관절을 검사합니다.
- 조심스럽게 멸균 메스 (그림 1) 활차 ossis 대퇴의 밖으로 작은 연골 조각 (2-3 ㎜) 껍질.
- 즉시 완료 배지로 50 ML 튜브에 이러한 연골 조직 검사를 배치 (DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FCS) + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep의)가) 수술 후 체외 배양 오른쪽을 계속합니다.
- 결함을 청소하고 멸균 생리 식염수로 헹구어.
- 활차 홈에서 슬개골의 위치를 변경.
- 하나의 버튼 봉합사 (4-0 Vicryl)와 지속적인 피부 봉합 (4-0 Monocryl)와 레이어 상처 폐쇄. 흡수성 봉합사를 사용합니다.
- 마지막으로, 수증기 침투성 드레싱 스프레이로 상처를 밀봉하십시오.
체외 배양 B.
- 생검 C를 처리가능한 한 빨리 멸균 층류 조직 문화 후드에서 수술 후 artilage 조각.
- RT에서 3 분 500 XG에서 다음 원심 분리와 PBS의 멸균 수확 연골 배를 씻으십시오.
- 30 분 1mm 3, 50 ML 팔콘로 전송의 조각 연골을 잘라 10 ML 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 %), 10 ML PBS로 30 분 동안 통에 그들을 소화
- 30 분 후, 완전 배지를 추가하여 트립신을 중지합니다. 그런 다음, 혈청 배지에서 콜라게나 (0.21 U / MG) (DMEM +는 1 % 펜 / Strep의) 12 시간 동안 서로에 대한 연골 조각을 흔들어.
- RT에서 3 분 170 XG에서 용액을 원심 분리기.
- 5 ML 완전 배지에서 세포 펠렛을 resuspend을.
- 시드 5ml를 완전 배지와 37 가습 조직 문화 인큐베이터에 보관 ° C, 5 % CO 2에서 25cm 2 조직 문화 플라스크에에 고립 된 연골 세포를.
- 80 %의 농도로 연골 세포를 성장.
- 세포 F를 해제3 분 동안 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 노출되기 전에 PBS 배에서 세척하여 롬 플라스 크입니다. 연골 세포가 분리되면, 10 μL 완전 배지의 첨가에 의해 트립신을 중지합니다.
- 완전 배지에서 300 XG (3 분)와 펠렛을 Resuspend에 현탁액을 원심 분리기.
- 조직 배양 플라스크 (75cm 2)와 1:3 비율 (~ 5,000 세포 / cm 2) 매 5 번째 날 또는 confluency에 80 %에 따라 분할의 씨앗 세포.
- 판 블루로 염색하여 세포 수와 생존을 결정합니다.
매트릭스의 C. 세포 시딩
- 위에서 설명한대로 주입 세척 및 해제 세포에 이전. 세포 수를 수행하고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 5 × 10 4 세포를 전송합니다. 다음 RT에서 5 분 500 XG에 원심 분리기.
- 매트릭스의 완전한 채도 15 μL 완전한 매체를 Resuspend 펠릿.
- 멸균 생검에 의해 활차 결함의 정확한 치수로 이중층 콜라겐 발판을 잘라펀치.
- 적절한 크기의 조직 배양 접시 (예를 들어, 24 - 웰 플레이트)에 자리 행렬.
- 매트릭스의 다공성, 세포 접착면 위에 씨앗 세포. 이 행렬에서 멀리 세포의 이동 방지 할 수 있습니다.
- 연골 세포의 전체 준수 할 수 있도록 1 시간 동안 인큐베이터에서 더 세포 배양액없이 세포 시드 행렬을 남겨주세요.
- 신선한 완전 배지로 배양 용기 (예 : 24 - 웰 플레이트)에 다음 장소 셀 매트릭스 구조. 강한 부착이 예상되는 경우에도 매트릭스 떨어져있는 세포를 씻어 않도록주의하십시오.
- 이제 셀 매트릭스 구조는 재 이식에 대한 수술 방으로 이동 할 수 있습니다.
D. 매트릭스를 이용한자가 연골 세포 이식
- (A. 1-8) 위에서 설명한대로 반대쪽 무릎에 parapatellar arthrotomy을 수행합니다.
- 무균 공기 operatin와 활차 홈에 두 개의 고립 된 chondral 결함을 생성G 파워 드릴 (직경 3.6 mm).
- 결함을 청소하고 멸균 식염수로 씻어.
- 주의 언제든지 골수 구멍을 열 수 없습니다 지불해야한다. 필요한 경우, 출혈에 대한 전기 소작과 결함의 바닥을 밀봉하십시오.
- 다공성 옆 얼굴 아래 (그림 2)와 함께 배양 된 연골 세포와 시드 행렬을 이식. 그런 다음 드릴 구멍에 압입과 주변의 표면을 세척하십시오.
- 안전한 고정을 보장하기 위해 피브린 접착제 (Tissucol 듀오 S)의 작은 비트 이식 행렬을 밀봉하십시오.
- 응고 후, 활차 홈에서 슬개골의 위치를 변경하고 무릎 관절 몇 번 운동의 전체 범위를 적용합니다.
- 옆으로 다시 한번 슬개골을 치환하고 불안정한 고정의 이벤트 나 기호를 확인합니다. 행렬은 아직도 그 자리에 유지해야합니다.
- 다시 슬개골을 교체하고 위에서 설명한대로 드레싱 레이어와 스프레이 상처 폐쇄 작업을 마무리합니다.
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Representative Results
설명 수술 기술은 인공 chondral 결함으로자가 연골 세포를 성공적으로 분리 및 주입을 허용합니다. 실험 장치는 주변 연골에 임플란트의 성공적인 통합 결과.
생체의 12 주 후에, chondral 결함 임플란트 (그림 4)에 전단 응력 손상을 감소 균질하고 그대로 표면에 수리 조직에 의해 채워졌다. 또한, 임플란트의 더 비대 또는 석회화는 보이지 않았다. 수리 조직은 건강한 주변의 연골 조직에 비교했다 뻣뻣하고 단단한 품질을 보여 주었다. 임플란트의 부족 역학적 특성으로 인해 인접 연골 증가 부하가 조기 변성의 위험이 될 수 있기 때문에 이것은 중요한 측면이다. 또한, 박리 이식은 발생되지 않았습니다. 모든 fissu는 수술 결함의 같은 크기로 막 잘라 갖는임플란트 주위의 연골 사이에 링이나 쪼개진은 피해야했다.
그림 1. 80 %의 confluency에의 연골 차 문화의 단층.
그림 2. 연골은 대퇴 활차 홈에서 생검을 복용.
그림 3. 인위적으로 활차 연골 결함을 만들었습니다.
그림 4. 오픈 무릎 관절 12주 사전에자가 연골 세포와 시드 막 이식 후- 드릴 chondral 결함 (빨간색 화살표).
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Discussion
제시된 프로토콜은 토끼 무릎 인위적으로 생성 된 연골 결손에 후속 증식과 재 이식을위한자가 연골 세포를 분리하는 9,12,13를 설립하고 쉽게 재현 기술을 제공합니다. 관절 연골 병변의 개조 및 수리를위한자가 연골 세포의 사용은 임상 적 사용이 만족 장기적인 결과는 6을 제공하는 이미 있습니다.
골막 비후 및 석회화 예를 들어 같은 주요 문제, 이식은 박리 또는 공여부 이환율은자가 연골 세포 이식 (14)의 첫 번째와 두 번째 세대가 발생했습니다. 따라서 연구진은 결점이 사이트에 연골 세포를 제공하는 외인성 흡수성 재료를 사용하여 기술을 개발했습니다. 아가 15를 사용할 때 연골 세포의 특성 유지에 3 차원 배양 시스템의 긍정적 인 효과는 반복적으로, 예를 들어 증명되었다폴리 - dioxanon 및 polyglactin 16, 폴리 폴리 (L-락 타이드) (PLLA) 및 폴리 (D, L-락 타이드-coglycolide) (PLGA) 17, 섬유소 12, 히알루 론산 18, 알긴산 19, 콜라겐 20 콜라겐 매트릭스 9 .
본 연구에 사용 된 이중층 콜라겐 막 콘드-지드가 성공적으로 9,21,22 전에 여러 임상 연구에 적용되고 이미 임상 응용 21,23의 일부입니다되었습니다. 콜라겐 멤브레인의 이중층 구조는 연골 통합 및 확산을위한 안정적인 미세을 제공하는 매트릭스 내에서 세포의 균일 한 분포를 허용하고 그것이 기존 ACI 11에서 볼 수 있습니다으로 세포 누출의 가능성을 제거합니다. 이 MACT 기술의 사용에 의해, 이식 된 연골 세포는 로컬로 유지 가능성으로 유지됩니다. 매트릭스를 이용한자가 연골 세포 이식의 합성에 이르게재생 조직의 연골과 같은 21 임상 적으로 적용 할 수 있습니다.
설명 동물 모델은 잘 관절 연골 병변 11,24,25의 실험 치료에 허용됩니다. 그러나 제시된 기법을 사용하여 실험 가능한 결과의 임상 적 루틴에 대한 번역은 여러 가지 이유로 어렵습니다. 동물 모델에서 일반적으로 이식 세포가 초기 통합 프로세스를 시작할 수 있도록하는 것이 좋습니다 것입니다 수술 후 첫 일 / 주 체중 부하 비 또는 일부를 달성하는 것은 거의 불가능하다. 즉시 수술 후 베어링 전체 무게는 잠재적으로 이식을 해칠 수 있으므로 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 하지만이 설정은 9,12 비교 모든 동물 모델에서 유사했다. 더 밀접하게 인간의 상황을 닮은 큰 동물과 실험은 더욱 동물 연구에서 보증됩니다.
요약하면, 그러나, 전자를 설립그것은 위에서 설명한대로 xperimental 동물 모델은 연골의 추가 실험 연구를위한 기초를 제공하고 복잡한 연구 설정의 실현과 성능을 용이하게 할 수 있습니다. 이 동물 모델을 사용하여 성장 인자 유전자의 유도 변화 행렬 속성 실험 시험은 확립 된 임상을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 프로젝트는 독일 연구 협회 (DFG, HE 4578/3-1)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
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