Summary
Экспериментальной методики для лечения дефектов хряща в коленном суставе кролика описано. Имплантация аутологичных хондроцитов высевали на матрице это общепринятый метод для реконструкции и ремонта повреждений суставного хряща обеспечивать удовлетворяя долгосрочные результаты. Матрица-Assisted аутологичных хондроцитов трансплантации (МАСТ) предлагает стандартизированные и клинически подтвержденной метод имплантации.
Protocol
А. Хрящ биопсию (хирургия номер; действия пунктов 1-5 Нестерильные подготовка залов)
- Выполнение окончательный контроль веса кроликов (Новозеландские белые кролик, самка, 3,5-4,0 кг массы тела, 6 месяцев) для того, чтобы иметь возможность правильно дозы препаратов и контроля веса после операции.
- Вызвать анестезии кролика внутривенной инъекции 10 мг / кг пропофола.
- После интубации поддержания анестезии с 1,5 мг / кг / мин пропофола и 0,05 мг / кг фентанила внутривенно. Монитор анестезии с помощью капнографических, пульсоксиметрии и частоту пульса.
- Бритье колена, которыми оперирует с электрической машинки и вакуумные меха.
- Лечить бритой колена тщательно и покрыть остальную часть кролика с стерильную повязку.
- Пропальпируйте коленной чашечки и выполняют разрез кожи медиальной части коленной чашечки.
- Открытый коленного сустава при медиальных парапателлярный артротомия в стерильных условиях. Старайтесь избегать резки любого малого Суperficial кровеносных сосудов.
- Смещение коленной чашечки боков.
- Осмотр коленного сустава для любой аномалии и макроскопические поражения хряща.
- Тщательно очистите маленькие кусочки хряща (2-3 мм) из trochlea Ossis бедра стерильным скальпелем (рис. 1).
- Сразу же месте этих хрящей биопсии в 50 мл трубки с полной среде (DMEM + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) + 1% пенициллина / стрептомицина (пенициллина / стрептомицина)), чтобы продолжить в правой культуре пробирке после операции.
- Очистите дефектов и промыть их стерильным физиологическим раствором.
- Измените положение коленной чашечки в канавке trochlea.
- Закрытие ран в слоях с одной кнопкой швов (4-0 Vicryl) и продолжает кожного шва (4-0 Monocryl). Используйте рассасывающийся шовный материал.
- Наконец, запечатать рану с распылителем туалетный пропускает водяной пар.
B. В пробирке культуры
- Процесс биопсии Cartilage части, как можно скорее после операции в стерильном ламинарном боксе культуры ткани.
- Промыть стерильной хряще 2x собрано в PBS с последующим центрифугированием при 500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Cut хряща в части 1 мм 3, перевода в 50 мл сокола и переваривают их на шейкере в течение 30 мин с 10 мл трипсин-EDTA (0,25%) и 10 мл PBS в течение 30 мин
- Через 30 мин остановить трипсином добавлением полной среде. Затем встряхнуть хряща части на другую в течение 12 часов с коллагеназы (0,21 ед / мг) в бессывороточной среде (DMEM + 1% пенициллина / стрептомицина).
- Центрифуга полученный раствор при 170 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл полной среды.
- Семенной изолированных на хондроциты до 25 см 2 культуре ткани колбы в 5 мл полной среды и держать во влажной тканевой культуре инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО 2.
- Grow хондроцитов до плотности 80%.
- Отпустите клетки FПЗУ колб путем промывки в PBS 2x перед экспонированием до 0,05% трипсин-EDTA, в течение 3 мин. После отсоединения хондроцитов, остановка трипсином добавлением 10 мкл полной среды.
- Центрифуга подвески при 300 мкг (3 мин) и ресуспендируют осадок в полной среде.
- Семенной клеток в культуре ткани колбы (75 см2) и разделяются в соотношении 1:3 (~ 5000 клеток / см 2), каждый 5-й день или на 80% слияния.
- Определить число клеток и жизнеспособности путем окрашивания трипановым синим.
C. посева клеток Матрицы
- До имплантации и мыть клетки выпускают, как описано выше. Выполните клеток и передачи 5 х 10 4 клеток в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Затем центрифугируют при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют осадок в 15 мкл полной среды для полного насыщения матрицы.
- Разрежьте двухслойных коллагена эшафот, чтобы точные размеры блоковый дефекта стерильной биопсииудара.
- Место матрицы в соответствующих размеров блюдо культуры ткани (например, 24-луночные планшеты).
- Семенной клеток на пористой, клетки клейкой стороне матрицы. Это сдерживает миграцию клеток от матрицы.
- Оставьте ячейки семенами матриц без дальнейшего среду для культивирования клеток в инкубаторе в течение 1 часа, чтобы позволить полное присоединение хондроциты.
- Затем место клетка-матрикс-конструкции в культивировании контейнеры (например, 24-луночные планшеты) свежей полной среды. Заботьтесь, чтобы не смыть любые клетки пределы матрицы, хотя строгое соблюдение не ожидается.
- Теперь, клетка-матрикс-конструкции могут быть приняты в комнату хирургии для повторной имплантации.
D. Матрица-Assisted аутологичной трансплантации хондроцитов
- Выполнение парапателлярный артротомия на контралатеральной колено, как описано выше (А. 1-8).
- Создайте два изолированных хрящевые дефекты в блоковый паз с стерильным воздухом Operatinг дрель (3,6 мм в диаметре).
- Очистите и промойте дефект стерильным физиологическим раствором.
- Следует обратить внимание не открывать полость кости в любое время. При необходимости уплотнения нижней части дефектов с электрическим прижиганием с кровотечением.
- Имплантировать матрицы засевают культурными хондроцитов с пористым вниз лицевой стороны (рис. 2). Тогда пресс-вписываются в отверстия и промойте окружающей поверхности.
- Печать имплантированных матриц с немного фибринового клея (Tissucol Duo S) для обеспечения надежной фиксации.
- После свертывания, переместите коленной чашечки в блоковый канавку и применять полный диапазон движения в коленном суставе несколько раз.
- Смещение коленной чашечки сбоку еще раз и проверить его на любое событие или знак нестабильной фиксации. Матриц следует держать неподвижно на месте.
- Заменить коленная чашечка снова и завершить операцию с закрытием раны в слоях и спрей туалетный как описано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанная хирургическая техника позволяет успешно изоляции и имплантация аутологичных хондроцитов в искусственную хрящевого дефекта. Экспериментальная установка привела к успешной интеграции имплантата в окружающие хряща.
После 12 недель в живом организме, хрящевой дефект был заполнен восстановления тканей с однородной поверхностью и нетронутыми, что позволило снизить напряжение сдвига и повреждения имплантата (Рис. 4). Более того, ни гипертрофии или кальцификации имплантата не было замечено. Восстановление тканей показал, жесткой и твердой качества, которое было сравнимо с окружающим здоровым хрящевой ткани. Это было важным аспектом, поскольку увеличение нагрузки на соседних хряща из-за недостаточной биомеханические свойства имплантат будет риска преждевременной дегенерации. Кроме того, трансплантат расслаивание не произошло. После вырезать мембраны к тому же размер дефекта до операции, любые fissuкольцо или расселины между имплантатом и окружающих хрящ удалось избежать.
Рисунок 1. Однослойные хондроцитов первичной культуры при 80% слияния.
Рисунок 2. Взяв хрящей биопсию из бедренных trochlea канавку.
Рисунок 3. Искусственно созданный дефект блоковый хряща.
Рисунок 4. Открыта коленного сустава 12 недель после имплантации мембраны затравку аутологичных хондроцитов в предварительноПросверленные хрящевой дефект (красная стрелка).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный протокол обеспечивает установленный 9,12,13 и легко воспроизводимые техники, чтобы изолировать аутологичных хондроцитов для последующего распространения и повторной имплантации в искусственно созданные дефекты хряща кролика в коленях. Использование аутологичных хондроцитов для реконструкции и ремонта повреждений суставного хряща уже используется в клинической практике обеспечивать удовлетворяя долгосрочный результат 6.
Основными проблемами, как, например периостальный гипертрофии и кальцификации, привитые расслаивание или заболеваемости донорской произошло с первым и вторым поколением аутологичной имплантации хондроцитов 14. Поэтому исследователи разработали методы использования экзогенных саморассасывающихся материалов для доставки хондроцитов к дефекту сайта. Положительный эффект трехмерной системы культуры на содержание chondrocytic характеристики неоднократно продемонстрировано, например, при использовании 15 агарозном, Поли - dioxanon и полиглактином 16, полиэфиры поли (L-лактид) (PLLA) и поли (D, L-лактид-согликолид) (PLGA) 17, фибрин 12, 18 гиалуроновой кислоты, альгинат 19, 20 коллаген или коллаген-матрицы 9 .
Двухслойная мембрана коллагена Chondro-Жид используемые в этом исследовании был успешно применен в ряде доклинических исследований до 9,21,22 и уже является частью клинического применения 21,23. Двухслойной структуры коллагеновой мембраны предлагает стабильную микроокружение хондроцитов интеграции и пролиферацию, обеспечивает равномерное распределение ячеек в матрице и исключает возможность утечки клетки как видно в обычных ACI 11. При использовании этого ТМДОВ техники, пересаженных хондроциты локально сохранена с сохранением жизнеспособности. Матричный помощь аутологичной трансплантации хондроцитов приводит к синтезухрящ, как регенерация тканей и клинически применимый 21.
Описанная модель животного хорошо принята в экспериментальном лечении повреждений суставного хряща 11,24,25. Однако перевод в повседневной клинической практике возможных результатов экспериментов с использованием представленной техники трудно по нескольким причинам. В животной модели это практически невозможно достичь без или частичное несущие в первые дни / недели после операции, которая будет обычно рекомендуется, чтобы имплантированные клетки, чтобы начать с ранней интеграционных процессов. Полный вес несущих сразу после операции может нанести вред пересадку и, следовательно, может влиять на результат. Но эта установка была сходной во всех моделях животных сопоставимо 9,12. Эксперименты с крупными животными, более напоминающий человеческую ситуацию, предоставляется гарантия в дальнейших исследованиях на животных.
В целом, однако, установлено электроннойXperimental животной модели, как это описано выше, обеспечивает основу для дальнейших экспериментальных исследованиях восстановления хряща и даже может способствовать реализации и выполнения комплексных параметров исследования. Экспериментальных исследований с факторами роста, генной индукции и изменения свойств матрицы использованием этой модели на животных могут быть полезны для улучшения установленных клинических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Этот проект был профинансирован немецкой ассоциации исследований (DFG Его 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
