Summary
Se describe una técnica experimental para el tratamiento de defectos condrales en la articulación de la rodilla del conejo. La implantación de condrocitos autólogos sembrados en una matriz es un método bien aceptado para la remodelación y reparación de lesiones del cartílago articular que proporcionan resultados satisfactorios a largo plazo. Matrix asistida por el trasplante de condrocitos autólogos (MACT) ofrece un método de implantación estandarizada y clínicamente establecida.
Abstract
Defectos del cartílago articular se considera un problema de salud importante porque el cartílago articular tiene una capacidad limitada para la auto-regeneración 1. Lesiones del cartílago no tratadas conducen a dolor en curso, afectar negativamente a la calidad de vida y predisponer para la osteoartritis. Durante las últimas décadas, varias técnicas quirúrgicas se han desarrollado para el tratamiento de estas lesiones. Sin embargo, hasta ahora no era posible lograr una reparación completa en términos de cubrir el defecto de cartílago hialino articular o de proporcionar satisfactoria recuperación a largo plazo 2-4. Por lo tanto, las lesiones del cartílago articular siguen siendo un objetivo prioritario para las técnicas regenerativas como la ingeniería de tejidos. En contraste con otras técnicas quirúrgicas, que a menudo conducen a la formación de tejido fibroso o fibrocartilaginoso, Ingeniería de Tejidos apunta a restaurar completamente la compleja estructura y las propiedades del cartílago articular original utilizando el potencial condrogénico de las células trasplantadas. Rn los últimos desarrollos abren posibilidades prometedoras para las terapias de regeneración del cartílago.
El primer enfoque basado en células para el tratamiento de cartílago de grosor completo o lesiones osteocondrales se llevó a cabo en 1994 por Lars Peterson y Mats Brittberg que fue pionero en la implantación de condrocitos autólogos clínica (ACI) 5. Hoy en día, la técnica está bien establecido clínicamente para el tratamiento de grandes defectos del cartílago hialino de la rodilla, el mantenimiento de buenos resultados clínicos incluso 10 a 20 años después de la implantación 6. En los últimos años, la implantación de condrocitos autólogos se sometió a una rápida progresión. El uso de un tridimensional de colágeno-matriz artificial en el que las células se vuelven a plantar posteriormente se hizo más y más popular 7-9.
MACT comprende de dos procedimientos quirúrgicos: En primer lugar, con el fin de recoger los condrocitos, una biopsia de cartílago necesita ser realizada a partir de una zona de cartílago no soporte de peso de tél articulación de la rodilla. Entonces, los condrocitos se extraen, se purificaron y se expandieron a un número suficiente de células in vitro. Los condrocitos se sembraron a continuación sobre una matriz tridimensional y pueden ser posteriormente reimplantados. Cuando se prepara un implante de tejido modificado, la tasa de proliferación y la capacidad de diferenciación son cruciales para una exitosa regeneración de los tejidos 10. Se cree que el uso de una matriz tridimensional como un portador de células para apoyar estas características celulares 11.
El siguiente protocolo se resumir y demostrar una técnica para el aislamiento de condrocitos a partir de biopsias de cartílago, su proliferación in vitro y su siembra en una matriz en 3D (Condro-Gide, Biomateriales Geistlich, Wollhusen, Suiza). Finalmente, se describirá la implantación de las célula-matriz-constructos en defectos condrales creadas artificialmente de articulación de la rodilla de un conejo. Esta técnica se puede utilizar como un entorno experimentalpara experimentos adicionales de la reparación del cartílago.
Protocol
A. Cartílago biopsia (Cirugía habitación; pasos 1-5 en la sala de preparación no estéril)
- Realizar un control del peso final del conejo (conejo Blanco de Nueva Zelanda, hembra, 3,5-4,0 kg de peso corporal, 6 meses de edad) con el fin de ser capaz de dosis drogas correctamente y para supervisar peso posterior a la cirugía.
- Inducir la anestesia para el conejo mediante una inyección intravenosa de 10 mg / kg de propofol.
- Después de la intubación, mantener la anestesia con 1,5 mg / kg / min propofol y 0,05 mg / kg de fentanilo por vía intravenosa. Supervisar la anestesia mediante capnografía, pulsioximetría y el pulso.
- Afeitado de la rodilla para ser operado con una maquinilla eléctrica y el vacío de la piel.
- Desinfectar la rodilla afeitado a fondo y cubrir el resto del conejo con un apósito estéril.
- Se palpa la rótula y realizar una incisión en la piel en sentido medial de la rótula.
- Abra la articulación de la rodilla por una artrotomía parapatelar medial en condiciones estériles. Trate de evitar el corte de cualquier pequeña dovasos sanguíneos perficial.
- Desplazar la rótula lateralmente.
- Inspeccione la articulación de la rodilla de las anomalías y lesiones de cartílago macroscópicos.
- Retire con cuidado trozos de cartílago pequeñas (2-3 mm) fuera de la tróclea femoral ossis con un bisturí estéril (Figura 1).
- Inmediatamente colocar estas biopsias de cartílago en un tubo de 50 ml con medio completo (DMEM + 10% suero de ternera fetal (FCS) + 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep)) para continuar con el cultivo in vitro en la derecha después de la operación.
- Limpie los defectos y enjuague con solución salina estéril.
- Vuelva a colocar la rótula en el surco troclear.
- Cierre de la herida en capas con suturas solo botón (4-0 Vicryl) y una sutura cutánea continua (4-0 Monocryl). Utilice material de sutura absorbible.
- Por último, sellar la herida con un apósito de pulverización permeable al vapor de agua.
B. In vitro Cultura
- Procesar la biopsia cpiezas artilage tan pronto como sea posible después de la operación en un flujo laminar campana de cultivo de tejido estéril.
- Lavar la estéril cosechada cartílago 2x en PBS con posterior centrifugación a 500 xg durante 3 minutos a TA.
- Cortar cartílago en piezas de 1 mm 3, la transferencia a un Falcon 50 ml y digerir ellos en un agitador durante 30 min con 10 ml de tripsina-EDTA (0,25%) y 10 ml de PBS durante 30 min
- Después de 30 min, dejar de tripsinización mediante la adición de medio completo. Entonces, agitar los trozos de cartílago para otra durante 12 horas con colagenasa A (0,21 U / mg) en medio libre de suero (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Centrifugar la solución resultante a 170 xg durante 3 minutos a TA.
- Resuspender los sedimentos celulares en 5 ml de medio completo.
- Seed los condrocitos aislados de hasta 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos en 5 ml de medio completo y manténgalo en un cultivo de tejidos humidificado incubadora a 37 ° C, 5% CO 2.
- Crecer condrocitos a una densidad de 80%.
- Liberar las células ffrascos rom de lavado en PBS 2 veces antes de exponerse al 0,05% de tripsina-EDTA durante 3 min. Una vez que los condrocitos se desprenden, dejar de tripsinización mediante la adición de 10 l de medio completo.
- Se centrifuga la suspensión a 300 xg (3 min) y se resuspende el precipitado en medio completo.
- Se siembran las células en matraces de cultivo tisular (75 cm 2) y divididas en una proporción de 1:03 (~ 5000 células / cm 2) cada 5 º día o al 80% de confluencia.
- Determinar el número de células y la viabilidad mediante tinción con azul tripán.
C. siembra de células de la matriz
- Antes de la implantación de lavado y las células de liberación como se describió anteriormente. Lleve a cabo el recuento de células y transferir 10 células de 5 x 4 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A continuación, se centrifuga a 500 xg durante 5 min a TA.
- Resuspender el precipitado en 15 l de medio completo para una saturación completa de la matriz.
- Cortar la bicapa de colágeno andamio a las dimensiones exactas del defecto troclear por una biopsia estérilponche.
- Lugar matriz en una placa de cultivo tisular de tamaño adecuado (por ejemplo, placas de 24 pocillos).
- Se siembran las células sobre el lado poroso, célula-adhesivo de la matriz. Esto impide la migración de células lejos de la matriz.
- Deja matrices de células sembradas sin más medio de cultivo celular en una incubadora durante 1 hora para permitir la plena adhesión de los condrocitos.
- Luego, coloque célula-matriz-construcciones en recipientes de cultivo (por ejemplo, placas de 24 pocillos) con medio completo fresco. Tome les importa para lavar las células fuera de la matriz, aunque se espera una fuerte adherencia.
- Ahora, célula-matriz-construcciones pueden ser llevados a la sala de cirugía de reimplantación.
D. Matrix asistida por trasplante de condrocitos autólogos
- Realizar artrotomía parapatelar a la rodilla contralateral como se describió anteriormente (A. 1-8).
- Cree dos defectos condrales aisladas en el surco troclear con una de Operación aire estérilg taladro eléctrico (3,6 mm de diámetro).
- Limpie el defecto y enjuague con solución salina estéril.
- Se debe prestar atención de no abrir la cavidad medular en cualquier momento. Si es necesario, sellar la parte inferior de los defectos con cauterización eléctrica frente a hemorragias.
- Implante las matrices sembradas con los cultivos de condrocitos con la cara lateral hacia abajo porosa (Figura 2). A continuación, encaje a presión en los orificios de perforación y al ras de la superficie circundante.
- Selle las matrices implantados con un poco de pegamento de fibrina (Tissucol Duo S) para garantizar una fijación segura.
- Después de la coagulación, la ubicación de la rótula en el surco troclear y aplicar el rango de movimiento de la articulación de la rodilla un par de veces.
- Desplazar la rótula lateralmente una vez más y comprobar si hay algún evento o señal de fijación inestable. Las matrices deben realizarse todavía en su lugar.
- Vuelva a colocar la rótula de nuevo y terminar la operación con el cierre de la herida en capas y el aerosol de vestir como se describe anteriormente.
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Representative Results
La técnica quirúrgica descrita permite un éxito en el aislamiento y la implantación de condrocitos autólogos en un defecto condral artificial. La configuración experimental dio como resultado una integración con éxito del implante en el cartílago circundante.
Después de 12 semanas in vivo, el defecto condral se llenó por tejido de reparación con una superficie homogénea e intacto, lo que reduce el estrés de cizallamiento y el daño al implante (Figura 4). Por otra parte, no se observó hipertrofia o calcificación del implante. El tejido de reparación mostró una calidad rígido y sólido, que era comparable a la del tejido sano que rodea el cartílago. Este es un aspecto importante debido a aumento de la carga sobre el cartílago adyacente debido a las propiedades biomecánicas insuficientes del implante sería un riesgo para la degeneración prematura. Por otra parte, no se ha producido un injerto de delaminación. Después de haber cortado la membrana para el mismo tamaño del defecto antes de la operación, cualquier fissuse evitaron anillo o hendiduras entre el implante y el cartílago circundante.
Figura 1. Monocapa de condrocitos cultivo primario a 80% de confluencia.
Figura 2. Toma de una biopsia de cartílago de la ranura tróclea femoral.
Figura 3. Artificialmente creado defecto del cartílago troclear.
La Figura 4. Abiertos articulación de la rodilla 12 semanas después de la implantación de una membrana sembrado con condrocitos autólogos en una prePerforados defecto condral (flecha roja).
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Discussion
El protocolo presentado proporciona una técnica establecida 9,12,13 y fácilmente reproducible para aislar condrocitos autólogos para la posterior proliferación y re-implante en defectos del cartílago creados artificialmente en las rodillas de conejo. El uso de condrocitos autólogos para la remodelación y reparación de lesiones del cartílago articular ya está en uso clínico proporcionar resultados satisfactorios a largo plazo 6.
Los principales problemas como por ejemplo la hipertrofia perióstica y calcificación, injerto de delaminación o morbilidad del sitio donante se produjeron con la primera y segunda generación de implantación de condrocitos autólogos 14. Por lo tanto, los investigadores han desarrollado técnicas con materiales reabsorbibles exógenos para entregar los condrocitos en el defecto. El efecto positivo del sistema de cultivo tridimensional en el mantenimiento de las características chondrocytic se ha demostrado en varias ocasiones, por ejemplo cuando se utiliza agarosa 15, Poli - dioxanon y poliglactina 16, poliésteres de poli (L-lactida) (PLLA) y poli (D, L-lactida-coglicolida) (PLGA) 17, la fibrina 12, 18 ácido hialurónico, alginato 19, 20 colágeno o colágeno matrices de 9 .
La membrana de colágeno bicapa Condro-Gide utilizada en este estudio se ha aplicado con éxito en varios estudios preclínicos antes de 9,21,22 y ya forma parte de las aplicaciones clínicas 21,23. La estructura de bicapa de la membrana de colágeno ofrece un microambiente estable para la integración y la proliferación de condrocitos, permite una distribución uniforme de las células dentro de la matriz y elimina la posibilidad de fugas de células como se ve en el ACI convencional 11. Mediante el uso de esta técnica MACT, los condrocitos trasplantados se conservan localmente con la viabilidad mantenido. Asistida por matriz de trasplante de condrocitos autólogos conduce a la síntesis de loscartílago similar a la regeneración de tejidos y es aplicable clínicamente 21.
El modelo animal descrito es bien aceptada en el tratamiento experimental de lesiones del cartílago articular 11,24,25. Sin embargo, la traducción a la rutina clínica de los posibles resultados de los experimentos utilizando la técnica presentada es difícil por varias razones. En un modelo animal es casi imposible de lograr sin o parcial de levantamiento de peso en los primeros días / semanas después de la cirugía que se recomienda generalmente para permitir que las células implantadas para comenzar con los procesos de integración temprana. El peso máximo que lleva inmediatamente después de la cirugía potencialmente podría dañar el trasplante y por lo tanto podría influir en el resultado. Sin embargo, este ajuste fue similar en todos los modelos animales comparables 9,12. Los experimentos con animales más grandes, se asemejan más de cerca la situación humana, se justifican en estudios con animales.
En resumen, sin embargo, estableció un correomodelo animal Xperimental como se ha descrito anteriormente proporciona una base para nuevos estudios experimentales de la reparación del cartílago e incluso podría facilitar la realización y el rendimiento de la configuración de estudio complejos. Exámenes experimentales con factores de crecimiento, la inducción de genes y los cambios en las propiedades de la matriz utilizando este modelo animal podrían ser útiles para mejorar los parámetros clínicos establecidos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por la Asociación Alemana de Investigación (DFG, Excmo 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
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