Summary
Krebs Fibroblasten (CAF) zu erleichtern Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass es fördert die Proliferation, Angiogenese und Entzündung. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um reine Populationen normalen Fibroblasten und CAF aus frischen Maus und menschlichen Geweben isolieren durch Zellsortierung unter Verwendung PDGFRα als Oberflächen-Marker.
Abstract
Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAF) sind die bekanntesten Zelltyp innerhalb des Tumorstroma vieler Krebsarten, insbesondere Mammakarzinomen, und ihre höchste Präsenz wird oft mit einer schlechten Prognose assoziiert 1,2. CAF sind aktiviert Subpopulation von Stromafibroblasten, Ausdruck von denen viele die Myofibroblasten Marker α-SMA 3. CAF stammen vom lokalen Gewebe Fibroblasten sowie aus Knochenmark stammende Zellen rekrutiert in die sich entwickelnde Tumoren und Annahme eines CAF Phänotyp unter dem Einfluß des Tumormikroumgebung 4. CAF wurde gezeigt, dass Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass fördert die Proliferation von Tumorzellen, die Angiogenese und Invasion 5-8 erleichtern. Wir haben gezeigt, dass CAF Tumorwachstum verstärken durch Vermittlung tumorpromovierenden Entzündungen, ab den frühesten präneoplastische Stufen 9. Trotz der zunehmenden Nachweis der Schlüsselrolle CAF spielen bei der Förderung des Tumorwachstums,Studium CAF wurde ein fortlaufender Herausforderung aufgrund der mangelnden CAF-spezifische Marker und die überwiegende Heterogenität dieser Zellen, mit vielen Subtypen koexistierenden im Tumormikromilieu 10. Außerdem prüft Fibroblasten in vitro durch die Tatsache, dass ihre Genexpressionsprofils oft in Gewebekultur 11,12 verändert behindert. Um dieses Problem anzugehen und unvoreingenommene Genexpressionsanalysen von Fibroblasten aus frischen Maus und menschlichen Geweben zu ermöglichen, entwickelten wir ein Verfahren bei früheren Protokollen für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) 13,14 basieren. Unser Ansatz beruht auf der Nutzung PDGFRα als Oberflächenmarker zu Fibroblasten aus frischen Maus und menschlichem Gewebe zu isolieren. PDGFRα ist reichlich von beiden normalen Fibroblasten und CAF 9,15 ausgedrückt. Diese Methode erlaubt die Isolierung von reinem Populationen von normalen Fibroblasten und CAF, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt α-SMA + aktiviert Myofibroblasten. Isolierte Fibroblasten können dannverwendet für die Charakterisierung und Vergleich der Entwicklung der Genexpression, die in der Tumorgenese CAF auftritt. Tatsächlich berichteten wir und andere Expression Profiling von Fibroblasten durch Zellsortierung 16 isoliert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich durchgeführt zu isolieren und zu profilieren hochangereichertes Populationen von Fibroblasten aus der Haut, Brust-, Pankreas-und Lungengewebe. Außerdem unserer Methode können auch Kultivieren von sortierten Zellen, um funktionelle Experimente durchzuführen und um die Kontamination durch Tumorzellen, die oft eine große Hürde beim Versuch Kultur CAF vermeiden.
Protocol
Ein. Sezieren Mammary oder Skin Gewebe von Mäusen
- Vor der Zerlegung des gewünschten Gewebe von Mäusen, bereiten Sie die folgenden Lieferungen und Reagenzien:
Supplies:
- Chirurgische Werkzeuge (gewaschen mit Reinigungsmittel getaucht und dann in 70% Ethanol).
- Styropor Oberfläche mit der Maus auf beim Präparieren ruhen.
- Pins oder Nadeln an Mäusen während der Präparation zu halten.
- Glas mit Deckel für die Verdauung, mit Magnetrührstab (autoklaviert).
- Wasserbad bei 37 ° C, mit einer Tauchpumpe Magnetrührer und genug Wasser zu tauchen die Verdauung jar, während es auf der Rührplatte.
Reagenzien:
- FACS-Puffer I: (4 ° C): Dulbeccos Phosphat-gepufferte Saline CMF (Calcium Magnesium Gratis) + 0,5% BSA
- Collagenase Lösung (aus unmittelbar vor der Verwendung):
0,05 g Collagenase II
0,05 g Kollagenase IV
0,01 g Deoxyribonucpachten
20 ml FACS-Puffer I. Halten Kollagenaselösung auf Eis bis zum Gebrauch. - PharmLyse (Ammoniumchlorid Lysereagenz).
- FACS-Puffer II: Dulbeccos Phosphat-gepufferte Saline CMF + 1% FCS.
- Dissection der Brustdrüsen (siehe auch 17).
- Einschläfern weiblichen Mäusen unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2) Einatmen.
- Auf einem Styropor-Oberfläche, platzieren Sie den Mauszeiger auf den Rücken und Pin fest alle vier Gliedmaßen mit 25-Gauge-Nadeln (Abbildung 1A). Sprühen Sie die Maus großzügig mit 70% Ethanol.
- Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Bauchhaut an der Mittellinie und machen einen kleinen Schnitt mit einer scharfen Schere.
- Ausgehend von dem Einschnitt, schneiden die Haut bis zum Hals des Tieres unter Vermeidung Punktieren der Bauch-oder Brusthöhle.
- Schneiden die Haut an den hinteren Beinen von der Mittellinie Einschnitt in Richtung der Schenkel, was zu einer "Y-förmig".
- Ziehen Sie die Haut vom mouse Körper und festzunageln, Freilegung der Milchdrüsen an der Unterseite der Haut (Abbildung 1B).
- Mit Q-Tips vorsichtig trennen Milchdrüsen von der Haut während des Schneidens Bindegewebe mit kleinen scharfen Schere die Brustdrüse Richtung Wirbelsäule der Maus trennen.
- Die Bauch-Drüsen (# 4, 5) sind am besten für dieses Protokoll. Sie können auch die 2. Brustdrüse, aber bedenken Sie, dass diese Drüsen anatomisch sind in unmittelbarer Nähe zu dem Brustmuskel, die nur schwer zu trennen kann, was in den Zellen des gemischten Gewebe Ursprungs befindet.
- Hinweis: Wenn Sezieren Tumorgewebe, empfiehlt es sich, nekrotische Bereiche zu entfernen.
- Dissection des Hautgewebes: Der einfachste Weg, um das Hautgewebe zu erhalten, ohne sich mit Haarentfernung umzugehen ist, Mäuseohren verwenden. Wenn eine größere Menge des Gewebes erforderlich ist, können Sie rasieren Haare von der Maus Oberkörper und sezieren Haut.
- Einschläfern Mäusen usingen CO 2-Inhalation.
- Mit einer scharfen Schere, schneiden Sie beide Ohren und unmittelbar bei der Verdauung Gefäß mit einem kleinen Volumen (~ 0,5 ml) PBS auf Eis.
2. Vorbereitung der Brustdrüse / Haut Single Cell Suspension
- Zeigen Brustdrüsen / Haut Verdauung Gefäß mit einem kleinen Volumen von PBS auf Eis. Wenn Gewebe blutige Wäsche x2 mit PBS und dann entsorgen überschüssiges PBS.
- Hackfleisch gründlich mit gebogenen Schere.
- 20 ml Kollagenase-Lösung (Anmerkung: diese Menge an Kollagenase-Lösung effizient distanzieren ca. 5 g von Mamma-oder Tumorgewebe und Ohren von bis zu 15 Mäuse).
- Zeigen sofort auf Rührplatte in 37 ° C Wasserbad und inkubieren für 15 min unter Rühren bei mittlerer Geschwindigkeit.
Hinweis: optimale Inkubationszeiten kann variieren, wenn verdauen anderen Geweben.
- Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 30 ml kaltem DMEM + 10% FCS.
- Der Stamm der Gewebe / Medien Gemisch durch ein 70 um Zellsieb auf einem 50 ml konischen Röhrchen gegeben.
- Zentrifugieren konischen Röhrchen 5 min bei 450 × g bei 4 ° C.
3. Red Blood Cells Lysis
Hinweis: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn Mäuse wurden mit PBS Herz perfundiert, bevor sie getötet wurden.
- Überstand unter Verwendung einer Glaspipette, die an Vakuum, ohne das Zellpellet.
- Um RBC, Zellpellet in 10 ml PharmLyse Lösung, Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur lysiert.
- Neutralisieren die PharmLyse Lösung durch Zugabe von ca. 40 ml FACS-Puffer I.
- Spin der konischen Rohrs mit Zellen für 5 min bei 450 × g bei 4 ° C.
- Überstand
4. Blockierung der endogenen Fc
- Optional: Zählen von Zellen auf eine angemessene Lautstärke für folgende ste bestimmenps.
- Die Zellen in 1-3 ml FACS-Puffer I (je nach Zellzahl und Menge des Antikörpers die Sie verwenden möchten).
- Fügen FcBlock (anti-Maus CD16/CD32) bis 1:50 Verdünnung (10 ug / ml) zu erreichen, und auf Eis inkubieren für 10-20 ".
Keine Notwendigkeit zu waschen FcBlock.
5. Färbung
- Nehmen Sie 100 ul Aliquots in Eppendorf-Röhrchen als un-gefärbten Steuerung und einfarbig Kontrollen (nach der Anzahl der fluoreszierenden Antikörpern verwendet wird) verwendet werden.
- Um Label Fibroblasten: add anti-PDGFRα (direkt konjugiert Fluorophor) zu einer Verdünnung von 1:50 (10 ug / ml).
- Um andere Zellpopulationen (zB Immunzellen, Makrophagen, Endothelzellen, etc.) bezeichnen: in geeignete fluoreszenzmarkierte konjugierten Antikörpern gegen Oberflächen-Marker, einer 1:50-Verdünnung.
Anmerkung: Obwohl PDGFRα ist eine robuste Marker für Fibroblasten, ist es empfehlenswert, für i Antikörper umfassenmmune Zellen und für Epithelzellen, um etwaige doppelte positive Populationen auszuschließen und somit Verbesserung der Reinheit der isolierten Fibroblasten.
- Add 2 ul jedes Antikörpers zu jeder der einzelnen Farbregelung Eppendorf-Röhrchen.
- Inkubieren von Zellen mit Antikörpern für 1 Stunde auf Eis im Dunkeln.
- Zum Waschen: Füllen Rohre mit FACS-Puffer I und Spin für 5 min bei 450 xg bei 4 ° C.
- Absaugen des Überstandes, resuspendieren Zellen in FACS Puffer I bis zu einer Konzentration von etwa 2 x 10 6 Zellen / ml, oder welche Konzentration am besten geeignete für die Sortierung mit den verfügbaren FACS Sorter.
Optional: Die Zellen können in FACS-Puffer II für die Dauer von Sortier resuspendiert werden. Dies kann die Lebensfähigkeit der Zellen. Jedoch kann die Exposition gegenüber Faktoren in Serum einen Effekt Genexpression, die getestet werden soll und berücksichtigt.
- Übertragen markierten Zellen in FACS-Röhrchen mit Filter oben: Filter Zellen in den Rohrenverhindern Zellklumpen.
- Um tote Zellen auszuschließen, fügen 7AAD (0,5 ug / ml) oder Propidiumiodid (PI) zu Proben (mit Ausnahme der un-gefärbten Steuerung).
Hinweis: Um zu vermeiden, verschwenden Zellen, können Sie 7AAD/PI der un-gefärbten Probe hinzufügen, nachdem die Aufnahme in den FACS, und verwenden Sie wieder als 7AAD nur Kontrolle.
- Die Proben auf Eis während der Analyse.
6. Isolierung von Zellen durch FACS
(Hinweis: dieser Teil des Protokolls erfordert Vorkenntnisse in Betrieb einer FACS-Sorter, zB BD FACS AriaII oder die Hilfe von einem Fachmann).
- Mit dem FACS Sorter Software (BD FACSDiva), bereiten entsprechende Analysen Plots Vorwärtsstreuung (FSC), seitliche Streulicht (SSC), 7AAD, FITC, PE und andere Fluorophor zur Kennzeichnung Zellen (Abbildung 2) zu analysieren.
- Vor dem Laden jeder Probe in die Zelle Sorter, kurz vortexen zu resuspendieren Zellen.
- Beginnen Sie, indem analyzIng. den ungefärbten Probe, um das Gating der gesamten Zellpopulation gesetzt, um Gate aus Zelltrümmern und um Autofluoreszenz oder Hintergrundfärbung zu bestimmen.
- Analysieren ungefärbten Probe + 7AAD zu bestimmen, und Gate die Population lebender Zellen aus der gesamten Zellpopulation.
- Analysieren Sie jede einzelne Farbe Kontrolle zu bestimmen und zu kalibrieren Parameter wie Entschädigung.
- Analysieren der gefärbten Probe, um die Position von Gattern zum Sortieren definieren.
- Sobald Parameter und Toren für die gewünschten Zellpopulationen gesetzt wurden, beginnen Sortieren der markierten Zellpopulationen in Eppendorf-Röhrchen oder 15 ml konischen Röhrchen mit Kulturmedium oder RNA Lysepuffer (wie RLT-Puffer oder Trizol).
Anmerkung: Wenn das Sortieren einer großen Anzahl von Zellen, wird es nicht empfohlen, um direkt zu sortieren in RNA Lysepuffer, wie das große Volumen von Hüllfluid begleitende die Zellen des Lysepuffers verdünnen und die Ausbeute reduzieren.
- Spin Zellen nach unten unmittelbar nach Sortierung ist abgeschlossen, und die Übertragung in frisches Medium oder RNA Lysepuffer, je nach Zweck des Experiments.
- Wenn Sortieranlagen, um Kultur isolierten Zellen, führen sterile sort. Zur besseren Gewinnung von Zellen, benutzt Phenolrot-freiem DMEM + 5% FCS anstatt FACS-Puffer II und sammeln Zellen in Kulturmedium mit 20% FKS.
- Wenn Kultivierung von Fibroblasten sortiert, auf Kollagen beschichteten Platten alwaysplate und nie direkt auf Kunststoff, da dies zu einer Aktivierung von Fibroblasten führt zu Veränderungen in ihrer Genexpression.
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Representative Results
Verwendung PDGFRα als Marker für Fibroblasten führt Isolierung von hochangereicherten Populationen von Gewebe Fibroblasten. Der Reinheitsgrad nach der Sortierung betrug 99%, wie durch post-sort-Analyse (2A) quantifiziert. Schätzen der Prozentsatz der nicht-kontaminierenden Fibroblastenzellen durch die relative Expression von zellspezifischen Kontrollgene (2B) zeigt typischerweise 0,1-0,6% Verunreinigung. Diese Reinheit ermöglicht hohe Qualität Transkriptom-Profiling von isolierten Fibroblasten 9.
In Brustdrüsen, variiert der Prozentsatz der Fibroblasten in dem Gewebe zwischen 5-20% bei normalem Brustgewebe und 1-5% in MMTV-PYMT Tumoren. Der relative prozentuale Anteil von Fibroblasten im Tumorgewebe ist niedriger als in präneoplastischen Gewebes trotz Erhöhung der Gesamtzahl von Fibroblasten durch die massive Expansion der epithelialen Abteil. Die reduzierte% von Fibroblasten aus Tumorgewebe getrennt ist auch eine Folge derdie zusätzliche technische Schwierigkeiten und verminderte Effizienz der Zellsortierung aus einem hoch nekrotischem Gewebe.
Isoliert Fibroblasten kann direkt nach dem Sortieren kultiviert werden, sondern erfordern ein paar Tage erholen (2D). Es ist wichtig, alle weiteren Versuche mit niedrigen Durchgang Zellen, führen als primäre Fibroblasten Seneszenz unterziehen während der Ausbreitung in der Kultur.
Abbildung 1. Reinigung von Fibroblasten aus frischen Brustdrüsen. A-FVB / n / PYMT Maus. Brustdrüsen B-Aufputz. C-Fresh Brustdrüsen von FVB / n / PYMT Mäuse wurden seziert und verdaut mit Kollagenase, um eine einzelne Zellsuspension. Die Zellen wurden mit Antikörpern für Fibroblasten Oberflächenmarker (PDGFRα) und ma Immunsystem-markiertencrophages Oberflächenmarker (F4/80), gefolgt von Trennung durch FACS. Sortiert Fibroblasten wurden entweder kultiviert oder lysiert RNA Aufreinigung. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Profiling von sortierten Fibroblasten. A-Single Zellsuspensionen der Maus Milchdrüsen wurden mit PDGFRαand F4/80 Antikörper gefärbt. FACS-Sortierung Grundstück wird angezeigt (links). P2 ist die Fibroblasten Tor (PDGFRα + Zellen) und P4 ist die Makrophagen-Gate (F4/80 + Zellen). Eine Post sortiert Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der sortierten Fibroblasten und Makrophagen (Mitte und rechte Felder) zu bestimmen. B-Analyse des Sortierens Reinheit durch qRT-PCR von zellspezifischen Kontrollgene für fibroblast (PDGFRα, Col-1α), Immunzellen (CD45, CSF-1R) und Epithelzellen (E-Cadherin). Die Ergebnisse wurden mit zwei Housekeeping Gene (GAPDH und MGUS) normiert. Relative Ausdruck GAPDH gezeigt. C-Quantifizierung von PDGFRα Ausdruck in insgesamt unsortierten Bevölkerung von Mamma Fibroblasten. D-Gewebekultur von sortierten Fibroblasten. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Während Versuche in Zellkultur durchgeführt kann informativ und schlagen Funktionsprinzipien, die in vivo nachgewiesen werden kann, ist es bekannt, dass große Veränderungen in der Genexpression von Zellen in Kultur 11,12. Um eine Gewebekultur Schritt vermeiden beim Profilieren Genexpression in Fibroblasten, entwickelten wir ein Protokoll, das Isolierung von normalen, sowie Krebs assoziierten Fibroblasten aus frischen Maus oder menschlichen Gewebe. Ermöglicht Dieses Protokoll wurde erfolgreich mit der Haut, Bauchspeicheldrüse und Brustgewebe aus Maus und aus menschlichem 9 angelegt. Isolation von Fibroblasten durch FACS-Sortierung erfordert ein Oberflächenmarker, dass Etiketten Fibroblasten. Wir haben festgestellt, dass PDGFRα eine robuste Oberflächen-Marker, die die Isolierung von hoch angereichertem Populationen von Fibroblasten 9 ermöglicht ist. Darüber hinaus wird PDGFRα auf beiden normalen Gewebe Fibroblasten und CAF ausgedrückt, so dass unvoreingenommene Isolation und Profilierung von Gewebe Fibroblasten statt focusing zu einem bestimmten Subpopulation.
Fibroblasten sind eine heterogene Zellpopulation in Bezug auf die Expression des Marker-Moleküle als auch in ihrer Herkunft und Signaleigenschaften 8,10,18. Während PDGFRα ist eine robuste Oberflächenmarker für Fibroblasten, es nicht Etikett 100% von Fibroblasten in allen Geweben, was zu einem unmarkierten Subpopulation von Zellen in Abhängigkeit von Gewebetyp. In der Haut, sind etwa 90% der Fibroblasten PDGFRα + (nicht gezeigt), während in den Brustdrüsen etwa 85% des gesamten Gewebes Fibroblasten PDGFRα + (2C) sind. Der Prozentsatz der PDGFRα exprimierende Fibroblasten kann in anderen Gewebearten variieren und muss für jedes Gewebe definiert werden. Dennoch, in der Haut und in den Brustdrüsen, wird unter Verwendung von PDGFRα als Zelloberflächenmarker in hochangereicherten Populationen der Mehrheit von Gewebe Fibroblasten führen, was die Expression Profiling oder Kultivieren von sortierten Zellen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Yitzchak Oschry und Dr. Orit Sagi-Asif für ihre Hilfe bei FACS-Sortierung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien an NE von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung n unterstützt ° [276890], aus dem Israel Cancer Association (# 20110078), und aus dem Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
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