Summary
Kanser İlişkili Fibroblastlar (cafs) proliferasyon, anjiyogenez ve inflamasyon teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyüme ve ilerlemesini hızlandırabilir. Burada bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak hücre sıralama ile taze fare ve insan dokularında normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Kanser ile bağlantılı fibroblast (cafs) özellikle göğüs kanseri olmak üzere birçok kanser tümör stroma içinde en önemli hücre türüdürler ve bunların belirgin durum çoğu zaman zayıf prognoz 1,2 ile ilişkilidir. Cafs stromal fibroblastlann bir aktive alt gruptaki olup, bunların çoğu bu myo işaretleyici α-SMA 3 ifade eder. Cafs lokal doku fibroblast yanı sıra kemik iliği kökenli hücrelerin gelişen tümör içine alınmış ve tümör mikro 4 etkisi altında CAF fenotip kabul kaynaklanır. Cafs tümör hücre proliferasyonu, anjiyogenez ve işgali 5-8 teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyümesi ve ilerlemesi kolaylaştırmak için gösterildi. Bu cafs erken ön-neoplastik aşamaları 9 başlayarak, tümör terfili iltihap aracılık ederek tümör büyümesini artırmak olduğunu göstermiştir. Anahtar rol cafs rağmen artan kanıtlar, tümör büyümesini kolaylaştırmada oynamakokuyan cafs tümör mikro 10 co-mevcut pek çok alt tipi ile CAF-spesifik belirteçler ve bu hücrelerin büyük heterojenliğin eksikliği nedeniyle devam eden bir meydan olmuştur. Üstelik, in vitro olarak fibroblastlar okuyan bunların gen ekspresyonu profiline sıkça doku kültürü 11,12 değiştirildiği gerçeği ile engellenmektedir. Bu sorunu çözmek için ve taze fare ve insan dokularından fibroblastların tarafsız gen ekspresyon profili izin, biz Floresans-Aktif Hücre Ayırma (FACS) 13,14 için daha önceki protokollere dayalı bir yöntem geliştirdi. Bizim yaklaşımımız taze fare ve insan dokusundan fibroblastlar yalıtmak için bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak dayanır. PDGFRα bol, normal fibroblastlar ve cafs 9,15 ikisi tarafından ifade edilir. Bu yöntem de dahil olmak üzere, normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının, izolasyonu ancak α-SMA sınırlı sağlar + miyofibroblastlar aktif. İzole fibroblastlar sonra olabilirkarakterizasyonu ve tümörogenez boyunca cafs meydana gen ifadesinin evrim karşılaştırma için kullanılır. Nitekim, biz ve diğerleri 16 sıralama hücre izole fibroblastların ekspresyon profili bildirdi. Bu protokol başarıyla deri, meme, pankreas ve akciğer dokularından fibroblastların zenginleştirilmiş popülasyonları ayırmak ve profil yapıldı. Bunun yanı sıra, yöntem, aynı zamanda işlevsel deneyler için ve kültür cafs çalışırken sık sık büyük bir engel teşkil tümör hücreleri ile kirlenmesini önlemek üzere, sıralı hücrelerin kültürlenmesi izin verir.
Protocol
1. Fare gelen Meme veya Deri Doku Diseksiyon
- Farelerin istenilen doku diseksiyon önce, aşağıdaki sarf malzemeleri ve reaktifler hazırlamak:
Malzemeleri:
- Cerrahi araçları (deterjan ile yıkandı ve daha sonra% 70 etanol içinde batırılmış).
- Strafor yüzey diseksiyonu sırasında fare dinlenmek için.
- Veya iğne diseksiyonu sırasında fare tutun.
- Manyetik karıştırıcı (otoklav) içeren sindirim için kapaklı cam kavanoz,.
- 37 Su banyosu ° C, heyecan plaka üzerinde dinlenirken, bir dalgıç manyetik karıştırıcı ve batığın sindirim kavanozu için yeterli miktarda su içeren.
Reaktifler:
- FACS tampon I: (4 ° C): Dulbecco Fosfat (Kalsiyum Magnezyum Ücretsiz) Salin CMF Buffered +% 0.5 BSA
- Kollajenaz çözeltisi (kullanımdan hemen önce yapılmış):
0.05 g kollajenaz II
0.05 g kollajenaz IV
0.01 g deoksiribonükleaz
20ml FACS tampon I. kullanıma kadar buz üzerinde kollajenaz çözüm tutun. - PharmLyse (Amonyum Klorür Parçalama Reaktifi).
- FACS tampon II: Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu CMF +% 1 FCS.
- Meme bezlerinin diseksiyonu (ayrıca 17 bakınız).
- Karbon dioksit (CO 2) inhalasyon kullanmaya dişi farelerde Euthanize.
- Strafor yüzey üzerinde, sırtında fare yerleştirin ve sıkıca 25 gauge iğneler (Şekil 1A) kullanarak tüm dört bacağı pin. % 70 etanol ile cömertçe fare püskürtün.
- Forseps kullanarak, orta hatta karın cildi yukarı çekin ve keskin bir makas ile küçük bir kesi yapmak.
- Abdominal veya torasik kavite delinme kaçınarak kesi başlayarak, hayvanın boynuna deri yukarı kesti.
- "Y şekli" ile sonuçlanan, bacak karşı orta hattan bir kesik, arka bacaklar üzerine deri kesin.
- Fare vücuttan uzakta deri çekin ve aşağı pin, teşhirsalgı derinin alt (Şekil 1B) tutturulmuştur.
- Fare omurganın doğru meme bezi ayırmak için küçük keskin bir makas ile katılgandoku kesim sırasında cildi nazikçe gelen meme bezleri ayırmak için Q-ipuçlarını kullanın.
- Karın bezleri (# 4, 5) Bu protokol için en iyisidir. Ayrıca 2. meme bezi kullanabilirsiniz, ancak bu bezlerin anatomik karışık dokusu kaynaklı hücreler neden ayırmak zor olabilir pektoral kas yakın bulunan aklınızda olabilir.
- Not: Tümör dokusunda diseksiyon, bu nekrotik bölgelerin çıkarılması tavsiye edilir.
- Cilt dokusunun Diseksiyonu: epilasyon ile uğraşmak zorunda kalmadan, cilt dokusu elde etmek için en kolay yolu fare kulakları kullanmaktır. Doku büyük miktarda gerekiyorsa, fare gövde saç kapalı tıraş ve cilt teşrih edebilirsiniz.
- CO 2 kullanarak farelerde Euthanize inhalation.
- Keskin bir makas kullanarak, buz PBS küçük hacimli (~ 0.5 ml) içeren sindirim kavanoza hemen kulakları ve yer hem kesti.
2. Meme Bezi / cilt Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması
- Meme bezlerinin / buz PBS küçük bir hacim içeren sindirim kavanoza cilt yerleştirin. Doku sonra PBS ile kanlı yıkama x2 ise ve aşırı PBS atın.
- Kavisli makas ile iyice kıyın.
- 20 ml kollajenaz çözüm (Not: kollajenaz çözüm bu miktar verimli 15 fareleri kadar gelen meme veya tümör dokusunun ve kulakları yaklaşık 5 g ayrıştırmaları) ekleyin.
- 37 plaka karıştırın üzerine hemen yerleştirin ° 15 dakika C su banyosu, ve inkübe orta hızda karıştırmaya devam.
Not: diğer dokuları sindirerek, optimum inkübasyon sürelerinde farklılık gösterebilir.
- Reaksiyon durdurmak için, 30 ml soğuk DMEM +% 10 FCS ekleyin.
- Stra50 ml'lik bir konik boru üzerine yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgecinden doku / medya karışım halinde.
- 4 az 450 x g'de 5 dakika boyunca konik bir tüp Santrifüj ° C.
3. Kırmızı Kan Hücreleri Lizis
Not: öldürülmeden önce fareler PBS ile kalp-perfüze olsaydı bu adım gerekli değildir.
- Hücre peleti bozmadan, vakum bağlı bir cam pipet kullanılarak süpernatan aspire.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10 ml PharmLyse çözelti ve inkübe içinde RBC, tekrar süspansiyon hücre peleti lyse.
- FACS tampon I'in yaklaşık olarak 40 ml ilave edilerek PharmLyse çözelti Nötrleştir
- 4 ° C'de 450 x g'de 5 dakika için hücreler ile konik bir tüp döndürme
- Süpernatant aspire.
4. Endojen Fc Engelleme
- İsteğe bağlı: Aşağıdaki adımlar için uygun hacmini belirlemek için sayım hücreleri.
- Hücreler süspanse1-3 ml FACS tampon I (hücre sayısına bağlı olarak, ve kullanmak istediğiniz antikor miktarı).
- 1:50 seyreltme (10 ug / ml) ulaşır, ve 10-20 'için buz üzerinde inkübe FcBlock (anti-fare CD16/CD32) ekleyin.
Hayır FcBlock yıkayın gerekir.
5. Lekelenme
- Un-lekeli kontrolü ve tek renk denetimleri (kullanılan floresan antikor sayısına göre) olarak kullanılmak üzere Eppendorf tüplere 100 ul hacimde çıkarın.
- Etiket fibroblastlar için: 1:50 seyreltme (10 ug / ml) ile (florofor ile direkt olarak konjuge) anti-PDGFRα ekleyin.
- Diğer hücre popülasyonlarının (örneğin bağışıklık hücreleri, makrofajlar, endotel hücreleri vb) etiketlemek için: 1:50 seyreltme, yüzey belirteçleri için uygun floresan konjuge antikor ekleyin.
Not: PDGFRα fibroblastlar için bir işaretleyici güçlü olmasına rağmen, bağışıklık hücreleri için ve ord epitel hücreleri için antikorları içerir tavsiye edilirer herhangi bir çift pozitif nüfus dışlamak ve dolayısıyla izole fibroblastların saflığı geliştirmek için.
- Tek bir renk kontrol eppendorf tüpleri her birinin her bir antikorun 2 ul ekle.
- Karanlıkta buz üzerinde 1 saat için antikorlar ile hücreler inkübe edin.
- Yıkamak için: FACS tampon I tüpleri doldurmak ve 4 ° C'de 450 x g'de 5 dakika daha dönmeye
- Yaklaşık olarak 2 x 10 6 hücre / mL, veya hangisi uygun FACS sıralayıcı ile sıralama için en uygun konsantrasyon arasında bir konsantrasyonu için bir FACS buffer içinde süpernatant, tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
İsteğe: Hücreler bir sıralama süre için FACS tampon II içinde yeniden süspanse edilebilir. Bu hücre canlılığı artırabilir. Bununla birlikte, serum içinde faktörlere maruz kalma, test edilmiş ve göz önüne alınması gereken bir gen ekspresyonunu etkileyen sahip olabilir.
- Hücre kümeleri önlemek için tüpleri içine filtre hücreleri: Filtre üst FACS tüpler içine etiketli hücreleri aktarın.
- Ölü hücre dışlamak içins, eklenti 7AAD (0.5 mg / ml) veya örnekleri (un-lekeli kontrolü hariç) Propidium İyodür (PI).
Not: hücre kaybını önlemek için, FACS kaydettikten sonra un-lekeli örnek 7AAD/PI eklemek ve 7AAD-tek kontrol yeri olarak tekrar kullanabilirsiniz.
- Analiz ederken buz örnekleri tutun.
6. FACS tarafından Hücre İzolasyonu
(Not: protokol bu bölümü bir FACS sıralayıcı, örn. BD FACS AriaII, ya da bir teknisyen yardımı işletim önceki bilgi gerektirir).
- FACS sıralayıcı yazılımı (BD FACSDiva) kullanarak ileri saçılım (FSC), yan dağılım (SSC), 7AAD, FITC, PE ve etiket hücreleri (Şekil 2) için kullanılan herhangi bir fluorofor analiz etmek için uygun analiz araziler hazırlar.
- Hücre sıralayıcı her örnek yüklemeden önce, vorteks kısaca hücreleri tekrar süspansiyon.
- Veya boyanmamış numune analiz ederek başlayınder hücre artıkları dışarı kapısına, total hücre nüfus için yolluk ayarlamak ve otofloresans veya arka plan boyama belirlemektir.
- Toplam hücre popülasyonunun canlı hücre nüfusu belirlemek ve kapısı unstained örnek + 7AAD analiz edin.
- Tazminat gibi parametrelerin belirlenmesi ve kalibre etmek için her bir renk kontrolü analiz edin.
- Sıralama için kapılarının konumunu tanımlamak için lekeli numune analiz edin.
- Sonra istenilen hücre popülasyonlarının için parametreler ve kapıları set edilmiştir, Eppendorf tüpler veya kültür ortamı veya RNA lizis tamponu (örneğin RLT tampon veya Trizol gibi) içeren 15 ml konik tüpler içine etiketli hücre popülasyonu sıralama başlar.
Not: hücreler, çok sayıda ayırma, bu hücreler lizis tamponu ile seyreltik verimi düşer eşlik eden kılıf sıvının büyük bir hacim olarak, RNA lizis tamponu içine direkt olarak sıralamak için tavsiye edilmez.
- Immediat aşağı Spin hücreleriely sonra sıralama bitmiş ve deneme amacına bağlı olarak taze orta veya RNA lizis tamponu, içine transfer edilir.
- Kültürü izole hücreler için sıralama ise, steril sıralama yapmak. Hücrelerin daha iyi bir iyileşme için, fenol kırmızısı ücretsiz DMEM +% 5 FCS yerine FACS tampon II kullanımı ve% 20 FCS ile kültür ortamında hücreleri toplamak.
- Kültür fibroblastlar kriteri ise, kendi gen ekspresyonu değişiklikleri neden fibroblast aktivasyonunu bu sonuç olarak plastik Kollajen kaplı plakalar üzerinde alwaysplate ve asla doğrudan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doku fibroblast zenginleştirilmiş popülasyonlarının izolasyonu fibroblastlar sonuçları için bir belirteç olarak PDGFRα kullanma. Sıralama sonrasında saflık düzeyi gibi post-tür analizi (Şekil 2A) ile ölçülebilir,% 99 idi. Hücre özel kontrol genlerinin göreceli ifadesi (Şekil 2B) ile non-fibroblast hücreleri kirletici yüzdesi tahmin edilmesi tipik olarak% 0.1-0.6 kirlenme göstermektedir. Saflık Bu düzeyde izole fibroblastlar 9 yüksek kalitede transcriptome profilleme sağlar.
Meme bezleri, doku fibroblastların yüzdesi normal meme dokusunda% 5-20 ve MMTV-PyMT tümörlerde% 1-5 arasında değişmektedir. Tümör dokusunda fibroblastların göreceli yüzdesi epitel bölmesinin masif genişlemesi nedeniyle fibroblastlar toplam sayısı olarak artmasına rağmen, ön-neoplastik dokuda daha düşüktür. Tümör dokusundan izole fibroblastlann indirgenmiş% ayrıca bir sonucudurteknik zorluk eklenir ve bir çok nekrotik doku hücre sıralama etkinliği azalmıştır.
İzole fibroblastlar sıralama sonra doğrudan kültüre edilebilir, ama bir kaç gün (Şekil 2B) kurtarmak için gerekebilir. Primer fibroblast kültürü yayılması sırasında yaşlılığında geçmesi gibi düşük geçiş hücreleri, tüm başka deneyler yapmak esastır.
Şekil 1. Taze meme bezlerinden fibroblastların saflaştırılması. A-FVB / n / PyMT fare. Meme bezlerinin B-Exposed. C-Taze meme bezlerinin FVB / n / PyMT farelerin disseke ve tek bir hücre süspansiyonu kollajenaz ile sindirilir edildi. Hücreler fibroblast yüzey işaretleyici (PDGFRα) ve ma için antikorları ile immün-etiketli edildicrophages yüzey işaretleyici (F4/80) FACS tarafından ayrılması izledi. Sıralayan fibroblastlar ya kültüre veya RNA saflaştırılması için parçalanırlar. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Kriteri fibroblastların profil. Fare meme bezlerinin bir-tek hücre süspansiyonları PDGFRαand F4/80 antikorları ile boyandı. FACS sıralama arsa (sol panel) gösterilir. P2 fibroblastlar kapısı (PDGFRα + hücreler) ve P4 makrofajlar kapısı (F4/80 + hücreler) 'dir. Bir mesaja sıralama analizi kriteri fibroblastlar ve makrofajlar (orta ve sağ panelleri) saflığını saptamak amacıyla yapıldı. Fibrobla için hücre-spesifik kontrol genlerin qRT-PCR ile sıralama saflık B-Analizst (PDGFRα, Col-1α), bağışıklık hücreleri (CD45, CSF-1R) ve epitel hücreleri (E-kaderin). Sonuçlar iki house keeping genler (GAPDH ve MGUS) normalize edildi. GAPDH Bağıl ifade gösterilir. Meme fibroblastlar toplam Sıralanmamış nüfus PDGFRα ifade C-kantitasyonu. Kriteri fibroblastların D-Doku kültürü. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku kültüründe gerçekleştirilen deneyler bilgilendirici ve in vivo olarak kontrol edilebilir fonksiyonel ilkeler önermek mümkün olmakla birlikte, bu kültür içinde 11,12 hücrelerde gen ekspresyonunu büyük değişiklikler meydana geldiği bilinmektedir. Fibroblastlar gen ekspresyonu sırasında bir doku kültürü adım önlemek için amacıyla, sağlar taze fare veya insan dokusu normal hem de kanser-kaynaklı fibroblastlann izole edilmesi. Bir protokol gelişmiş Bu protokol başarıyla fare ve insan 9 deri, pankreas ve meme dokusu ile uygulanmıştır. FACS sınıflandırarak fibroblastların İzolasyon bir yüzey işaretleyici olduğu etiketleri fibroblastlar gerektirir. Biz PDGFRα fibroblastlar 9 zenginleştirilmiş popülasyonlarının izolasyonu sağlayan sağlam bir yüzey işaretleyici olduğu tespit edildi. Ayrıca, PDGFRα böylece tarafsız izolasyon ve profil doku fibroblastlar yerine focusi sağlayan, normal doku fibroblastlar ve hem de cafs üzerinde ifade edilirBelirli bir alt populasyonun üzerinde ng.
Fibroblastlar işaretleyici moleküllerinin ekspresyonu ile ilgili olarak hem de bunların köken ve sinyal özellikleri 8,10,18 içinde heterojen bir hücre popülasyonu oluşturur. PDGFRα fibroblastlar için sağlam bir yüzey işaretleyici ise de, doku tipine bağlı olarak, hücrelerin etiketlenmemiş bir alt grubunda edilen tüm dokularda fibroblastlar% 100 etiket değildir. Meme bezlerinde toplam doku fibroblast yaklaşık% 85 PDGFRα + (Şekil 2C) ise deride, fibroblastlar yaklaşık% 90 (gösterilmemiştir) PDGFRα + vardır. PDGFRα ifade fibroblastların yüzdesi diğer doku tipleri değişir ve her bir doku için tanımlanan gerekiyor olabilir. Bununla birlikte, deri ve meme bezleri, bir hücre yüzey işaretleyici olarak kullanan PDGFRα kriteri hücre ekspresyon profili ya da kültür sağlayan, doku fibroblastların çoğunluğunun yüksek oranda zenginleştirilmiş popülasyonları neden olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz FACS sıralama ile yardım için Dr Yitzchak Oschry ve Dr Orit Sagi-Asif ederim. Bu araştırma hibe sözleşmesi n kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) NE hibe tarafından desteklenen ° [276.890], İsrail Kanser Derneği (# 20110078), gelen ve İsrail Kanser Araştırma Fonu (Research Kariyer Geliştirme Ödülü).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 Forthcoming.
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
