Summary
Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.
Abstract
fibroblasts סרטן הקשורים (cafs) הוא סוג התא הבולט ביותר בתוך stroma הגידול של סוגי סרטן רבים, בסרטן השד בפרט, והנוכחות הבולטת שלהם קשורה לעתים קרובות עם 1,2 פרוגנוזה גרוע. Cafs הוא subpopulation הופעל של fibroblasts סטרומה, שרבים מהם להביע את סמן myofibroblast α-SMA ל 3. Cafs מקורן fibroblasts רקמות המקומיים, כמו גם מתאי מוח עצם שהופקו גויסו לגידול לפתח ולאמץ פנוטיפ CAF תחת השפעת גידול microenvironment 4. Cafs הוצג כדי להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות גידול תא, אנגיוגנזה, ופלישת 5-8. אנחנו הוכחנו כי cafs לשפר את צמיחת גידול על ידי תיווך דלקת גידול מקדם, החל בשלבים המוקדמים מראש neoplastic 9. למרות ראיות גוברות של cafs לשחק תפקיד המפתח בקידום צמיחת גידול,Cafs לומד כבר אתגר מתמשך בשל חוסר הסמנים CAF ספציפיים וההטרוגניות העצומה של תאים אלה, עם תת רבים שיתוף קיים בגידול microenvironment 10. יתר על כן, לומד fibroblasts במבחנה מתעכבת עקב העובדה שפרופיל ביטוי הגנים שלהם לעתים קרובות שינה בתרבית הרקמה 11,12. כדי לטפל בבעיה זו ולאפשר ביטוי פרופיל גנטי משוחד של fibroblasts מעכבר רענן ורקמות אדם, פתח שיטה המבוססת על פרוטוקולים קודמים למיון תא Fluorescence-Activated (FACS) 13,14. הגישה שלנו מסתמכת על ניצול PDGFRα כסמן משטח לבודד מעכבר fibroblasts טרי ורקמה אנושית. PDGFRα מתבטא בשפע על ידי שני fibroblasts וcafs 9,15 הנורמלים. שיטה זו מאפשרת בידוד של אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הרגיל, כולל, אך לא מוגבלת ל- SMA α + הופעל myofibroblasts. fibroblasts מבודד אז יכול להיותהמשמש לאפיון והשוואה של האבולוציה של ביטוי גנים המתרחשת בcafs במהלך tumorigenesis. ואכן, אנו ואחרים דיווחו על פרופיל ביטוי של fibroblasts בודד על ידי תא מיון 16. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה לבודד ופרופיל אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts מרקמות עור שד, סרטן לבלב וסרטן ריאות. יתר על כן, השיטה שלנו מאפשרת גם culturing של תאים ממוינים, על מנת לבצע ניסויים פונקציונליים וכדי למנוע זיהום על ידי תאים סרטניים, אשר לעתים קרובות מכשול גדול כאשר מנסה cafs התרבות.
Protocol
1. ביתור רקמת שד או עור מעכברים
- לפני ביתור הרקמה הרצויה מעכברים, להכין את הציוד וריאגנטים הבאים:
ספקים:
- כלי ניתוח (שטף עם חומר ניקוי ולאחר מכן טבל באתנול 70%).
- משטח הקלקר לנוח על העכבר במהלך נתיחה.
- סיכות או מחטים להחזיק עכברים במהלך נתיחה.
- צנצנת זכוכית עם מכסה לעיכול, מכילה סרגל סערה מגנטי (autoclaved).
- אמבט מים ב 37 ° C, המכיל stirrer מגנטי צולל ומספיק מים כדי להטביע את צנצנת העיכול, בזמן מנוחה על הצלחת והמערבבים.
ריאגנטים:
- FACS חיצי: (4 ° C): פוספט של Dulbecco נאגר מלוח CMF (מגנזיום סידן חינם) + 0.5% BSA
- פתרון collagenase (שנעשה מייד לפני שימוש):
0.05 גרם collagenase השני
0.05 גרם collagenase IV
0.01 Deoxyribonuclease גרם
20מיליליטר FACS החיץ ראשון שמור על פתרון collagenase על קרח עד לשימוש. - PharmLyse (מגיב Lysing אמוניום כלוריד).
- FACS חיץ השני: פוספט של Dulbecco נאגר מלוח CMF + 1% FCS.
- נתיחה של בלוטות חלב (ראה גם 17).
- להרדים נקבות עכברים באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) שאיפה.
- על משטח קלקר, הנח את העכבר על הגב שלו ולהצמיד את כל ארבעת הגפיים באמצעות 25 מחטי מד (איור 1 א ') בתקיפות. רסס את העכבר בנדיבות עם אתנול 70%.
- באמצעות מלקחיים, להרים את עור הבטן בקו האמצע ולעשות חתך קטן במספריים חדים.
- החל מהחתך, לחתוך את העור עד לצווארו של בעל החיים, תוך הימנעות בפגיעה בחללי בטן או חזה.
- חותך את העור על רגליו האחוריות מחתך קו האמצע לכיוון הרגל, וכתוצאה מכך "צורת Y".
- משוך עור מגוף של עכבר ולהצמיד, חשיפהבלוטות החלב צמוד לחלק התחתון של העור (1B איור).
- השתמש Q-טיפים בעדינות כדי להפריד בלוטות חלב מעור תוך חיתוך רקמות "ו חיבור עם מספריים חדים קטנים כדי להפריד את בלוטת החלב לכיוון עמוד השדרה של העכבר.
- בלוטות הבטן (מס '4, 5) הן טובות ביותר עבור פרוטוקול זה. ניתן גם להשתמש בבלוטת החלב -2, אבל לקחת בחשבון שבלוטות אלה נמצאות בסמיכות אנטומית לשריר pectoralis אשר עשוי להיות קשה להיפרד, וכתוצאה מכך תאים ממקור רקמה מעורבת.
- הערה: כאשר מנתחי רקמת גידול, מומלץ להסיר את אזורי נימקים.
- דיסקציה של רקמות עור: הדרך הקלה ביותר להשיג רקמת עור, מבלי להתמודד עם הסרת שיער היא להשתמש באוזני עכבר. אם כמות גדולה יותר של רקמה נדרשת, אתה יכול לגלח את השיער מגוף עכבר ולנתח עור.
- להרדים עכברים באמצעות 2 משאיפת CO.
- בעזרת מספריים חדים, לחתוך את שתי אוזניים ואת המקום מייד בצנצנת המכילה עיכול נפח קטן (~ 0.5 מ"ל) של PBS על קרח.
2. הכנת השעית תא חלב בלוטה / עור היחידה
- הנח בלוטות / עור בצנצנת המכילה עיכול נפח קטן של PBS על קרח חלב. אם רקמה היא דמים לשטוף x2 עם PBS, ולאחר מכן למחוק את PBS העודף.
- ברר ביסודיות עם מספריים מעוגלים.
- הוסף 20 פתרון collagenase מ"ל (הערה: כמות זו של פתרון collagenase תהיה יעיל לנתק כ 5 גרם של רקמה ואוזני חלב או גידול מעכברים עד 15).
- הנח מייד על צלחת מערבבים ב37 ° C אמבט מים, ודגירה במשך 15 דקות תוך ערבוב בקצב בינוני.
הערה: זמני דגירה אופטימליות עשויים להשתנות אם לעכל רקמות אחרות.
- כדי להפסיק את התגובה, להוסיף 30 מ"ל הקר DMEM + 10% FCS.
- מסנן את תערובת throug רקמה / מדיהמסננת תא 70 מיקרומטר חה מונחת על גבי צינור 50 מיליליטר חרוטים.
- צנטריפוגה צינור החרוטים למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C.
3. אדומה תמוגה תאי דם
הערה: בשלב זה הוא אינו נחוץ אם עכברים היו לב perfused-עם PBS לפני שהם הקריבו.
- לשאוב supernatant באמצעות פיפטה זכוכית מחוברת לואקום, מבלי להפריע לתא הגלול.
- לlyse RBC, resuspend תא גלול ב 10 מיליליטר פתרון PharmLyse ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- לנטרל את פתרון PharmLyse ידי ההוספה כ 40 מ"ל של חיץ FACS I.
- ספין צינור החרוטים עם תאים למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C.
- לשאוב supernatant.
4. חסימה של Fc אנדוגני
- אופציונלי: תאי ספירה כדי לקבוע את הנפח המתאים לשלבים הבאים.
- תאי resuspend ב1-3 מ"ל FACS חיצי (תלוי oתא מספר n, וכמות הנוגדנים ברצונך להשתמש).
- הוסף FcBlock (אנטי עכבר CD16/CD32) להגיע 1:50 דילול (10 מיקרוגרם / מ"ל), ולדגור על קרח למשך 10-20 '.
אין צורך לשטוף את FcBlock.
5. הכתמה
- קח את 100 aliquots μl לצינורות Eppendorf כדי לשמש כשליטה בלתי מוכתמת ופקדי צבע אחד (לפי מספר נוגדני ניאון משמשים).
- לfibroblasts תווית: להוסיף אנטי PDGFRα (ישירות מצומדת לfluorophore) לדילול 01:50 (10 מיקרוגרם / מ"ל).
- כדי לתייג את אוכלוסיות תאים אחרות (תאי מערכת חיסון, למשל, תאי האנדותל מקרופגים וכו '): להוסיף נוגדנים מצומדות fluorescently מתאימים לסמני פני שטח, ל1:50 דילול.
הערה: למרות שPDGFRα הוא סמן חזק לfibroblasts, מומלץ לכלול נוגדנים לתאי מערכת חיסוניים ותאי האפיתל במטרה שלא יכלול חיובי כפולאוכלוסיות ובכך לשפר את הטוהר של fibroblasts המבודד.
- הוסף 2 μl של כל נוגדנים לכל אחת ממבחנות אפנדורף בקרת הצבע האחד.
- דגירת תאים עם נוגדני 1 שעה על קרח בחושך.
- לשטוף: למלא צינורות עם חיץ FACS אני וספין למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C.
- לשאוב תאי supernatant, resuspend בFACS חיצי לריכוז של כ 2 10 x 6 תאים / מ"ל, או בכל הריכוז המתאים ביותר למיון עם סדרן FACS הזמין שלך.
אופציונלי: תאים ניתן resuspended בFACS חיץ השני לתקופת מיון. זה עשוי לשפר את כדאיויות תא. עם זאת, חשיפה לגורמים בסרום עשויה להיות השפעת ביטוי גנים, שיש לבדוק, ונלקח בחשבון.
- העברת תאים שכותרתו לתוך צינורות FACS עם מסנן עליונים: תאי סינון לחצוצרות למניעת גושים סלולריים.
- על מנת להוציא את התאים מתים, להוסיף 7AAD (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) או נכסיודיד idium (PI) קטעים (פרט לשליטה בלתי מוכתמת).
הערה: כדי להימנע מבזבוז תאים, אתה יכול להוסיף ל7AAD/PI מדגם בלתי מוכתם, לאחר הרישום בFACS, ולהשתמש בו שוב כשליטת 7AAD בלבד.
- שמור דגימות על קרח בעת ניתוח.
6. בידוד של תאים על ידי FACS
(הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש ידע קודם בהפעלת סדרן FACS, למשל BD FACS AriaII, או הסיוע של טכנאי מיומן).
- באמצעות FACS סדרן התוכנה (BD FACSDiva), להכין חלקות ניתוח מתאימות לניתוח פיזור קדימה (FSC), פיזור הצד (SSC), 7AAD, FITC, PE וכל fluorophore אחר המשמש לתאי תווית (איור 2).
- לפני טעינת מדגם זה לסדרן התא, מערבולת בקצרה resuspend תאים.
- התחל על ידי ניתוח מדגם הכתם כדי להגדיר gating לאוכלוסיית התאים המוחלטות, לשער החוצה celפסולת הליטר, וכדי לקבוע autofluorescence או כתמי רקע.
- לנתח דגימת כתם + 7AAD לקבוע שער והאוכלוסייה של תאי חיים מאוכלוסיית התא.
- לנתח כל שליטת צבע אחד כדי לקבוע וכיול פרמטרים כגון פיצויים.
- לנתח דגימה המוכתמת להגדיר את המיקום של שערים למיון.
- ברגע שפרמטרים ושערים לאוכלוסיות התאים הרצויים הוגדרו, מתחיל במיון אוכלוסיות התאים שכותרתו לתוך צינורות Eppendorf או 15 צינורות חרוטי מ"ל המכילים מדיום תרבות או בולם תמוגה רנ"א (כגון RLT חיץ או Trizol).
הערה: אם מיון מספר גדול של תאים, זה לא מומלץ למיין ישירות לתוך מאגר תמוגה רנ"א, כנפח הגדול של נוזל נדן מלווה את התאים ידללו את מאגר תמוגה ולהפחית את התשואה.
- ספין למטה תאים מייד לאחר מיון הוא סיים, והעברה למדיום טרי או חיץ תמוגה רנ"א, דהתלוי ועומד על מטרת הניסוי שלך.
- אם מיון כדי תאים מבודדים תרבות, לבצע סוג סטרילי. להתאוששות טובה יותר של תאים, להשתמש באדום ללא DMEM פנול + 5% FCS במקום FACS חיץ השני ולאסוף תאים לתרבות בינונית עם 20% FCS.
- אם culturing מסודר fibroblasts, קולגן alwaysplate על צלחות מצופות ולא ישירות על פלסטיק כזה תוצאות בהפעלה של fibroblasts המוביל לשינויים בביטוי הגנים שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש PDGFRα כסמן לתוצאות פיברובלסטים בבידוד של אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts רקמות. רמת הטוהר לאחר המיון הייתה 99%, כלכמת את הניתוח שלאחר המיון (איור 2 א). הערכת אחוז תאים שאינם מזהם פיברובלסטים על ידי הביטוי היחסי של גני בקרת תא ספציפיים (האיור 2B) בדרך כלל מראה זיהום 0.1-0.6%. רמה זו של טוהר מאפשרת יצירת פרופילי transcriptome איכות גבוהה של fibroblasts המבודד 9.
בבלוטות חלב, אחוז פיברובלסטים ברקמה נע בין 5-20% ברקמת שד נורמלית, ו1-5% בגידולים MMTV-PyMT. האחוז היחסי של הפיברובלסטים רקמת גידול הוא נמוך יותר מאשר ברקמה טרום גידולים, למרות גידול במספר הכולל של fibroblasts, בשל ההתרחבות המסיבית של התא האפיתל. % המופחתים של fibroblasts שבודד מרקמת גידול הוא גם תוצאה שלהוסיף קושי טכני ומפחית את היעילות של מיון תא מרקמות נמקית מאוד.
fibroblasts המבודד יכול להיות מתורבת ישירות לאחר המיון, אך עשוי לדרוש כמה ימים כדי להתאושש (האיור 2D). זה חיוני כדי לבצע את כל ניסויים נוספים עם תאי מעבר נמוכים, כfibroblasts העיקרי עובר הזדקנות במהלך ההתקדמות בתרבות.
איור 1. טיהור של fibroblasts מבלוטות חלב טריות. -FVB / n / PyMT עכבר. B-חשוף בלוטות חלב. בלוטות חלב C-טריות נותחו מFVB / n / עכברי PyMT ומתעכלות בcollagenase להשעית תא בודדה. תאים חיסוניים שכותרתו עם נוגדני סמן פיברובלסטים משטח (PDGFRα) ואמאסמן המשטח crophages (F4/80) ואחרי הפרדה על ידי FACS. fibroblasts ממוין בתרבית או lysed לטיהור רנ"א. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. אפיון של fibroblasts הממוין. A-יחידות השעיות תא של בלוטות חלב עכבר הוכתמו F4/80 נוגדני PDGFRαand. עלילת מיון FACS מוצגת (פנל שמאלי). P2 הוא שער fibroblasts (PDGFRα + תאים) ו-P4 הוא שער מקרופאגים (F4/80 + תאים). ניתוח סוג הודעה בוצע כדי לקבוע את הטוהר של fibroblasts ומקרופגים (לוחות בינוניים וימין) הממוין. B-ניתוח של טוהר מיון לפי qRT-PCR של גני בקרת תא ספציפיים לfibroblaרח (PDGFRα, קול-1α), תאי מערכת חיסוניים (CD45, CSF-1R) ותאי אפיתל (E-cadherin). התוצאות היו מנורמלות לשני גני שמירה על הבית (וGAPDH mGUS). ביטוי ביחס לGAPDH מוצג. C-כימות של ביטוי PDGFRα באוכלוסייה ממוינת כוללת של fibroblasts חלב. תרבות D-רקמות של fibroblasts הממוין. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד הניסויים שבוצעו בתרביות רקמה יכולים להיות אינפורמטיבי ולהציע עקרונות פונקציונליים כי ניתן מאומת in vivo, ידוע ששינויים גדולים מתרחשים בביטוי גן בתאים בתרבית 11,12. על מנת להימנע מצעד תרבית רקמה כאשר אפיון ביטוי גנים בfibroblasts, פתחו פרוטוקול המאפשר בידוד של כמו גם פיברובלסטים נורמלים, סרטן הקשורים מעכבר טרי או רקמה אנושית. פרוטוקול זה מיושם בהצלחה ברקמות עור, לבלב ושד מעכבר ואדם מ9. בידוד של fibroblasts באמצעות מיון FACS דורש סמן משטח שfibroblasts תוויות. הקמנו שPDGFRα הוא סמן משטח יציב המאפשר הבידוד של אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts 9. יתר על כן, PDGFRα מתבטא בשני fibroblasts רקמות הנורמליות ועל cafs, ובכך מאפשר בידוד משוחד ואפיון של fibroblasts רקמות ולא focusing על תת אוכלוסיות ספציפיות.
Fibroblasts הוא אוכלוסייה הטרוגנית תא בהקשר לביטוי של מולקולות סמן כמו גם במוצאם ותכונות איתות 8,10,18. בעוד PDGFRα הוא סמן משטח יציב לfibroblasts, זה לא לתייג את 100% של fibroblasts בכל הרקמות וכתוצאה מכך תת אוכלוסיות של תאים ללא תווית, בהתאם לסוג הרקמה. בעור, כ 90% מfibroblasts הם PDGFRα + (לא מוצג) ואילו בבלוטות חלב כ 85% מכלל הרקמות fibroblasts הם PDGFRα + (איור 2C). אחוז fibroblasts מבטא PDGFRα עשוי להשתנות בסוגי רקמות אחרים, וצריך להיות מוגדר לכל רקמות. עם זאת, בעור ובבלוטות חלב, ניצול PDGFRα כסמן תא שטח יגרום אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של רוב fibroblasts רקמות, המאפשר ביטוי פרופיל או culturing של תאים ממוינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר יצחק וOschry ד"ר אורית שגיאה, אסיף על עזרו במיון FACS. מחקר זה נתמך על ידי מענקים לNE מהתכנית השביעית של האיחוד האירופית Framework (FP7/2007-2013) תחת הסכם המענק n ° [276890], מהמלחמה בסרטן האגוד (# 20110078), ומישראל לחקר הסרטן בקרן (המחקר פרס פיתוח קריירה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 Forthcoming.
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
