Summary
कैंसर एसोसिएटेड Fibroblasts (cafs) संकेत है कि प्रसार, angiogenesis, और सूजन को बढ़ावा देता है के माध्यम से ट्यूमर दीक्षा, विकास और प्रगति की सुविधा. यहाँ हम एक ताजा माउस और मानव ऊतकों से सेल छँटाई, एक सतह मार्कर के रूप PDGFRα का उपयोग सामान्य fibroblasts और cafs का शुद्ध आबादी को अलग विधि का वर्णन करता है.
Protocol
1. चूहों से स्तन या त्वचा के ऊतकों विदारक
- चूहों से वांछित ऊतक विदारक से पहले, निम्नलिखित आपूर्ति और अभिकर्मकों तैयार:
आपूर्ति:
- शल्य चिकित्सा उपकरण (डिटर्जेंट से धोया और फिर 70% इथेनॉल में डूबा हुआ है).
- स्टायरोफोम सतह विच्छेदन के दौरान माउस को आराम करने के लिए.
- पिन या सुई विच्छेदन के दौरान चूहों को पकड़ने के लिए.
- पाचन के लिए ढक्कन के साथ ग्लास जार, चुंबकीय हलचल बार (autoclaved) युक्त.
- 37 में जल स्नान डिग्री सेल्सियस, एक पनडुब्बी चुंबकीय उत्तेजक और पाचन जार डूब के लिए पर्याप्त पानी युक्त, जबकि हलचल थाली पर आराम.
अभिकर्मकों:
- FACS बफर मैं: (4 ° C): Dulbecco फास्फेट Saline सीएमएफ Buffered (कैल्शियम, मैग्नीशियम मुफ्त) + 0.5% BSA
- Collagenase समाधान का उपयोग करने से पहले तुरंत किया:
0.05 छ Collagenase द्वितीय
0.05 छ Collagenase चतुर्थ
0.01 छ Deoxyribonuclease
20मिलीलीटर FACS बफर मैं कोलैजिनेज समाधान का उपयोग करें जब तक बर्फ पर रखें. - PharmLyse (अमोनियम क्लोराइड lysing अभिकर्मक).
- FACS बफर द्वितीय: Dulbecco फास्फेट Saline सीएमएफ Buffered + 1% FCS.
- स्तन ग्रंथियों के विच्छेदन (17 भी देखें).
- महिला साँस लेना कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) का उपयोग चूहों euthanize.
- एक स्टायरोफोम सतह पर अपनी पीठ पर माउस जगह है और मजबूती से सभी चार अंगों का उपयोग कर 25 गेज सुई (चित्रा 1 ए) पिन. 70% इथेनॉल के साथ माउस उदारता स्प्रे.
- संदंश का प्रयोग, पेट की त्वचा पर midline खींचने के लिए और तेज कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा बनाने.
- चीरा से शुरू, त्वचा में कटौती जानवर की गर्दन जबकि पेट या वक्ष cavities puncturing परहेज.
- पैर की ओर midline चीरा से पीछे पैरों पर त्वचा में कटौती, एक "वाई आकार" में जिसके परिणामस्वरूप.
- त्वचा माउस शरीर से दूर खींचो नीचे पिन, उजागरस्तन ग्रंथियों त्वचा के नीचे (चित्रा 1B) संलग्न करने के लिए.
- क्यू युक्तियों का उपयोग करने के लिए धीरे त्वचा से स्तन ग्रंथियों को अलग करते हुए छोटे तेज कैंची के साथ संयोजक ऊतक को काटने के लिए माउस के रीढ़ की ओर स्तन ग्रंथि अलग.
- पेट ग्रंथियों (# 4, 5) इस प्रोटोकॉल के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं. तुम भी 2 एन डी स्तन ग्रंथि का उपयोग कर सकते हैं, लेकिन मन में भालू है कि इन ग्रंथियों anatomically pectoralis मांसपेशियों जो अलग करना मुश्किल हो सकता है, मिश्रित मूल के ऊतक कोशिकाओं में उत्पन्न हो सकता है के करीब निकटता में स्थित हैं.
- नोट: जब ट्यूमर ऊतक विदारक, यह परिगलित क्षेत्रों को दूर करने के लिए सिफारिश की है.
- त्वचा के ऊतकों के विच्छेदन: आसान करने के लिए बालों को हटाने के साथ सौदा करने के लिए बिना त्वचा के ऊतकों को प्राप्त करने के माउस कान का उपयोग करने के लिए है. यदि ऊतक की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है, तो आप माउस धड़ से बाल दाढ़ी कर सकते हैं और त्वचा टुकड़े करना.
- मैं सीओ 2 का प्रयोग चूहों euthanizenhalation.
- तेज कैंची का प्रयोग, तुरंत पाचन बर्फ पर पीबीएस (~ 0.5 मिलीलीटर) की एक छोटी मात्रा युक्त जार में बंद दोनों कान और जगह में कटौती.
2. स्तन ग्रंथि / त्वचा एकल कक्ष निलंबन की तैयारी
- स्तन ग्रंथियों / पाचन बर्फ पर पीबीएस की एक छोटी मात्रा युक्त जार में त्वचा का रखें. अगर ऊतक पीबीएस के साथ खूनी धोने x2 है, और फिर अतिरिक्त पीबीएस त्यागें.
- घुमावदार कैंची के साथ अच्छी तरह से क़ीमा.
- 20 मिलीलीटर कोलैजिनेज समाधान (नोट: कोलैजिनेज समाधान की इस राशि कुशलतापूर्वक 5 लगभग छ स्तन या ट्यूमर ऊतक और कान के ऊपर से अलग कर देना जाएगा 15 चूहों के लिए) में जोड़ें.
- थाली हलचल पर तुरंत 37 में जगह ° सी जल स्नान, और 15 मिनट के लिए सेते, जबकि मध्यम दर पर क्रियाशीलता.
नोट: इष्टतम ऊष्मायन बार अगर अन्य ऊतकों को पचाने भिन्न हो सकते हैं.
- प्रतिक्रिया बंद करो, 30 मिलीलीटर ठंड + 10% FCS DMEM.
- Straमिश्रण / ऊतक मीडिया में एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर रखा.
- शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र 450 XG पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस
3. लाल रक्त कोशिकाओं lysis
नोट: यह चरण आवश्यक नहीं है अगर चूहों पीबीएस के साथ दिल perfused थे इससे पहले कि वे बलिदान किया गया.
- एक गिलास वैक्यूम सेल गोली को परेशान करने के बिना, संलग्न विंदुक का उपयोग तैरनेवाला Aspirate.
- 10 मिलीलीटर PharmLyse और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए समाधान सेते में आरबीसी, resuspend सेल गोली lyse.
- FACS बफर मैं के लगभग 40 मिलीलीटर जोड़ने द्वारा PharmLyse समाधान बेअसर
- 5 मिनट के लिए 450 XG पर कोशिकाओं के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर शंक्वाकार ट्यूब स्पिन
- तैरनेवाला Aspirate.
4. अंतर्जात एफसी के अवरुद्ध
- वैकल्पिक: गिनती कोशिकाओं निम्नलिखित कदम के लिए उचित मात्रा का निर्धारण.
- में कोशिकाओं Resuspend1-3 मिलीलीटर FACS बफर मैं (सेल संख्या पर निर्भर करता है, और एंटीबॉडी के राशि है जो आप उपयोग करना चाहते हैं).
- जोड़ें FcBlock (CD16/CD32 विरोधी माउस) 1:50 कमजोर पड़ने (10 ग्राम / एमएल) तक पहुँचने के लिए, और 10-20 'के लिए बर्फ पर सेते हैं.
बंद FcBlock धोने की जरूरत नहीं है.
5. धुंधला हो जाना
- Eppendorf ट्यूब के लिए एक नियंत्रण संयुक्त राष्ट्र से सना हुआ और एक रंग नियंत्रण (फ्लोरोसेंट इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की संख्या के हिसाब से) के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए 100 μl aliquots ले लो.
- लेबल fibroblasts: 1:50 (10 ग्राम / एमएल) की एक कमजोर पड़ने विरोधी PDGFRα (सीधे fluorophore संयुग्मित) जोड़ने.
- अन्य सेल आबादी (जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं, मैक्रोफेज, endothelial कोशिकाओं आदि) लेबल: सतह मार्करों के लिए उपयुक्त fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी एक 1:50 कमजोर पड़ने, जोड़ें.
नोट: हालांकि PDGFRα fibroblasts के लिए एक मजबूत मार्कर है, यह करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए और ord में उपकला कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी को शामिल करने के लिए सिफारिश की है.एर किसी भी डबल सकारात्मक आबादी को बाहर करने के लिए और इस प्रकार पृथक fibroblasts की शुद्धता को बढ़ाने के.
- एकल रंग नियंत्रण Eppendorf ट्यूब में से प्रत्येक के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के 2 μl जोड़ें.
- अंधेरे में बर्फ पर 1 घंटे के लिए एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं सेते हैं.
- धो: FACS बफर के साथ मैं ट्यूब भरने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर 5 मिनट के लिए स्पिन
- FACS में तैरनेवाला, resuspend कोशिकाओं Aspirate मैं लगभग 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल, या जो भी अपने उपलब्ध FACS सॉर्टर के साथ छँटाई के लिए सबसे उपयुक्त एकाग्रता की एकाग्रता के लिए बफर.
वैकल्पिक: कोशिकाओं FACS बफर द्वितीय छँटाई की अवधि के लिए में resuspended किया जा सकता है. यह सेल व्यवहार्यता में सुधार हो सकता है. हालांकि, सीरम में कारकों के लिए जोखिम एक प्रभाव जीन की अभिव्यक्ति है, जो परीक्षण किया जाना चाहिए और खाते में ले लिया हो सकता है.
- ट्यूबों में फिल्टर कोशिकाओं सेल clumps को रोकने: FACS ट्यूबों में फिल्टर शीर्ष के साथ लेबल की कोशिकाओं स्थानांतरण.
- मृत सेल बाहर, ऐड (0.5 ग्राम / मिलीलीटर) 7AAD या Propidium नमूने (नियंत्रण के लिए संयुक्त राष्ट्र के दाग को छोड़कर) के लिए आयोडाइड (पीआई).
नोट: कोशिकाओं को बर्बाद कर से बचने के लिए, आप 7AAD/PI FACS में रिकॉर्डिंग करने के बाद संयुक्त राष्ट्र से सना हुआ नमूना, जोड़ सकते हैं और 7AAD केवल नियंत्रण के रूप में फिर से उपयोग.
- बर्फ पर नमूने रखें जबकि का विश्लेषण.
6. कक्षों की FACS द्वारा अलगाव
(नोट: प्रोटोकॉल के इस हिस्से में एक FACS सॉर्टर, जैसे बी.डी. FACS AriaII, या एक कुशल तकनीशियन की सहायता के संचालन में पिछले ज्ञान की आवश्यकता होती है).
- FACS सॉर्टर सॉफ्टवेयर (बी FACSDiva) का उपयोग करना, उपयुक्त विश्लेषण भूखंडों को तैयार करने के लिए आगे (FSC) तितर बितर, (एसएससी) की ओर तितर बितर, 7AAD, FITC, पीई और किसी भी अन्य लेबल कोशिकाओं (2 चित्रा) के लिए इस्तेमाल किया fluorophore का विश्लेषण.
- सेल सॉर्टर प्रत्येक नमूना लोड करने से पहले, भंवर संक्षेप में कोशिकाओं resuspend.
- में अस्थिर नमूना विश्लेषण करके या प्रारंभder gating कुल सेल की आबादी के लिए सेट, सेल मलबे से बाहर फाटक के लिए, और autofluorescence या पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना निर्धारित है.
- अस्थिर नमूना + 7AAD विश्लेषण निर्धारित करने के लिए और गेट सेल की कुल आबादी से जीवित कोशिकाओं की आबादी.
- विश्लेषण प्रत्येक एकल रंग नियंत्रण के लिए निर्धारित है और मुआवजे के रूप में इस तरह के मानकों जांचना.
- दाग नमूना विश्लेषण छँटाई के लिए फाटकों की स्थिति को परिभाषित करने के लिए.
- वांछित सेल आबादी के लिए एक बार और मापदंडों फाटकों निर्धारित किया गया है, Eppendorf ट्यूब या 15 मिलीलीटर शंक्वाकार संस्कृति मध्यम या शाही सेना lysis बफर (जैसे RLT बफर या Trizol) युक्त ट्यूबों में लेबल सेल आबादी छँटाई शुरू करते हैं.
नोट: यदि कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या छँटाई, यह आरएनए lysis बफर में सीधे सॉर्ट म्यान तरल पदार्थ की बड़ी मात्रा के साथ कोशिकाओं lysis बफर पतला और उपज कम हो जाएगा के रूप में नहीं की सिफारिश की है.
- Immediat नीचे स्पिन कोशिकाओंely छंटाई के बाद समाप्त हो गया, और ताजा मध्यम या शाही सेना lysis बफर, अपने प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है में हस्तांतरण.
- यदि संस्कृति अलग कक्षों करने के क्रम में छंटनी, बाँझ तरह का प्रदर्शन करते हैं. कोशिकाओं की बेहतर वसूली के लिए, phenol लाल मुक्त + 5% की बजाय FCS DMEM द्वितीय FACS बफर का उपयोग करें और संस्कृति के माध्यम में 20% FCS के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा.
- यदि संवर्धन fibroblasts क्रमबद्ध कोलेजन लेपित प्लेटों पर alwaysplate और कभी नहीं सीधे उनके जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए अग्रणी fibroblasts की सक्रियता में इस परिणाम के रूप में प्लास्टिक पर.
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Representative Results
Fibroblasts के ऊतक अत्यधिक समृद्ध आबादी के अलगाव में fibroblasts परिणामों के लिए एक मार्कर के रूप में PDGFRα का उपयोग. छंटाई के बाद शुद्धता का स्तर 99% थी, के रूप में बाद सॉर्ट विश्लेषण (2A चित्रा) द्वारा मात्रा. सेल विशिष्ट नियंत्रण जीन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति (चित्रा 2B) द्वारा गैर fibroblast कोशिकाओं contaminating के प्रतिशत का आकलन आम तौर पर 0.1-0.6% के संदूषण से पता चलता है. पवित्रता के इस स्तर पर उच्च गुणवत्ता transcriptome की रूपरेखा पृथक 9 fibroblasts की अनुमति देता है.
स्तन ग्रंथियों के ऊतकों में fibroblasts प्रतिशत सामान्य स्तन के ऊतकों में 5-20%, और MMTV PyMT ट्यूमर में 1-5% के बीच बदलता है. ट्यूमर के ऊतक में fibroblasts के रिश्तेदार प्रतिशत पूर्व neoplastic ऊतक की तुलना में कम है, fibroblasts की कुल संख्या, उपकला डिब्बे के बड़े पैमाने पर विस्तार करने के लिए कारण में वृद्धि के बावजूद है. ट्यूमर ऊतक से अलग fibroblasts के कम% का परिणाम हैतकनीकी कठिनाई जोड़ा और एक अत्यधिक necrotic ऊतक से सेल छँटाई की क्षमता की कमी हुई.
पृथक fibroblasts छंटाई के बाद सीधे संवर्धित किया जा सकता है, लेकिन कुछ दिनों के (चित्रा 2 डी) को ठीक करने के लिए आवश्यकता हो सकती है. यह कम बीतने के कोशिकाओं, के साथ आगे के प्रयोगों से प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है, के रूप में प्राथमिक fibroblasts संस्कृति में प्रचार के दौरान senescence से गुजरना.
चित्रा 1. ताजा स्तन ग्रंथियों से fibroblasts की शोधन. माउस A-FVB / / n PyMT स्तन ग्रंथियों बी उजागर सी ताजा स्तन ग्रंथियों FVB n / / PyMT चूहों से विच्छेदित किए गए थे और एक एकल कक्ष निलंबन कोलैजिनेज साथ पचा. कोशिकाओं रहे थे fibroblast सतह (PDGFRα) मार्कर और माँ के लिए एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षा लेबलcrophages सतह मार्कर (F4/80) FACS द्वारा जुदाई द्वारा पीछा किया. के आधार पर छाँटे गए fibroblasts या सुसंस्कृत थे आरएनए शुद्धि के लिए lysed. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. हल fibroblasts की रूपरेखा. एक एकल माउस स्तन ग्रंथियों के सेल निलंबन PDGFRαand F4/80 एंटीबॉडी के साथ दाग थे. FACS छँटाई साजिश (बाएं पैनल) दिखाया गया है. P2 fibroblasts फाटक (PDGFRα कोशिकाओं +) और P4 मैक्रोफेज गेट (F4/80 कोशिकाओं +) है. एक के बाद तरह विश्लेषण करने के लिए क्रमबद्ध fibroblasts और मैक्रोफेज (मध्य और सही पैनल) की शुद्धता निर्धारित किया गया था qRT-पीसीआर सेल विशिष्ट नियंत्रण जीनों की द्वारा छँटाई शुद्धता के fibrobla लिए बी विश्लेषण.सेंट (PDGFRα कर्नल 1α), प्रतिरक्षा कोशिकाओं (CD45, सी.एस.एफ.-1R) और उपकला कोशिकाओं (ई cadherin). परिणाम दो हाउस कीपिंग जीन (GAPDH और mGUS) normalized थे. GAPDH के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तन fibroblasts की कुल unsorted आबादी में PDGFRα अभिव्यक्ति की सी मात्रा में दिखाया गया है. D-ऊतक हल fibroblasts की संस्कृति. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
जबकि टिशू कल्चर में प्रदर्शन प्रयोगों जानकारीपूर्ण और कार्यात्मक सिद्धांतों कि vivo में सत्यापित किया जा सकता है सुझाव कर सकते हैं, यह है कि बड़े परिवर्तन होते 11,12 संस्कृति में कोशिकाओं के जीन की अभिव्यक्ति में जाना जाता है. आदेश में एक टिशू कल्चर कदम से बचने के लिए जब fibroblasts में जीन की अभिव्यक्ति की रूपरेखा, हम विकसित एक प्रोटोकॉल है कि सामान्य है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ताजा माउस या मानव ऊतकों से कैंसर से जुड़े fibroblasts के अलगाव की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक माउस से और 9 से मानव त्वचा, अग्न्याशय, और स्तन के ऊतकों के साथ लागू किया गया था. FACS छँटाई द्वारा fibroblasts के अलगाव एक सतह मार्कर है कि लेबल fibroblasts की आवश्यकता है. हम स्थापित है कि PDGFRα एक मजबूत सतह मार्कर है कि 9 fibroblasts की अत्यधिक समृद्ध आबादी के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है. इसके अलावा, दोनों सामान्य ऊतक fibroblasts और cafs पर PDGFRα व्यक्त किया जाता है, इस प्रकार निष्पक्ष अलगाव और ऊतक fibroblasts की रूपरेखा बजाय focusi की अनुमतिएक विशिष्ट subpopulation पर एनजी.
Fibroblasts मार्कर अणुओं की अभिव्यक्ति के संबंध में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने मूल और संकेत 8,10,18 गुण में एक विषम सेल की आबादी हैं. जबकि PDGFRα fibroblasts के लिए एक मजबूत सतह मार्कर है, यह सभी कोशिकाओं के एक unlabeled subpopulation में जिसके परिणामस्वरूप ऊतकों में fibroblasts की 100% लेबल नहीं करता है, ऊतक के प्रकार पर निर्भर करता है. त्वचा में, fibroblasts का लगभग 90% PDGFRα + () नहीं दिखाया जबकि स्तन ग्रंथियों में कुल ऊतक fibroblasts की लगभग 85% PDGFRα + (चित्रा 2C) हैं. PDGFRα व्यक्त fibroblasts का प्रतिशत अन्य प्रकार के ऊतकों में भिन्न हो सकते हैं, और प्रत्येक ऊतक के लिए परिभाषित किया जाना चाहिए. फिर भी, त्वचा में और स्तन ग्रंथियों में, एक सेल सतह मार्कर के रूप PDGFRα का उपयोग ऊतक fibroblasts के बहुमत के अत्यधिक समृद्ध आबादी में परिणाम, अभिव्यक्ति या हल कोशिकाओं की प्रोफाइलिंग संवर्धन की अनुमति होगी.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम FACS छँटाई के साथ उनकी मदद के लिए डॉ. Yitzchak Oschry और डा. Sagi आसिफ Orit धन्यवाद. इस शोध अनुदान समझौते के एन के तहत यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) से पूर्वोत्तर के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ° [276890], इसराइल कैंसर एसोसिएशन (20,110,078 #), और इसराइल कैंसर रिसर्च (फंड रिसर्च से कैरियर विकास) पुरस्कार से सम्मानित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
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