Summary
Cancro fibroblasti associati (CAF) facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione, l'angiogenesi, e l'infiammazione. Qui si descrive un metodo per isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF dal topo freschi e tessuti umani mediante selezione delle cellule, utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie.
Abstract
Cancro-associate fibroblasti (CAF) sono il tipo cellulare più prominente nello stroma del tumore di molti tumori, in particolare carcinoma mammario, e la loro presenza prominente è spesso associato con 1,2 prognosi. CAF sono una sottopopolazione di fibroblasti attivati stromali, molti dei quali esprimono il marcatore myofibroblast α-SMA 3. CAF provengono da fibroblasti tissutali locali nonché da midollo osseo, cellule reclutati nel tumore sviluppare e adottare un fenotipo CAF sotto l'influenza del microambiente tumorale 4. CAF sono stati dimostrato di facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione delle cellule tumorali, l'angiogenesi e l'invasione 5-8. Abbiamo dimostrato che i CAF migliorare la crescita tumorale di mediazione che promuove l'infiammazione del tumore, a partire al più presto pre-neoplastiche stadi 9. Nonostante la crescente evidenza dei CAF ruolo chiave svolgere nel facilitare la crescita tumorale,CAF studiano è una continua sfida a causa della mancanza di CAF-specifici marcatori e l'eterogeneità parte di queste cellule, con molti sottotipi coesistenti nel microambiente tumorale 10. Inoltre, studiando fibroblasti in vitro è ostacolato dal fatto che il loro profilo di espressione genica è spesso alterato in coltura tissutale 11,12. Per risolvere questo problema e per consentire imparziale profilo di espressione genica di fibroblasti di topo fresco e tessuti umani, abbiamo sviluppato un metodo basato sui protocolli precedenti per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) 13,14. Il nostro approccio si basa su utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie per isolare i fibroblasti di topo freschi e tessuti umani. PDGFRα è abbondantemente espresso da entrambi i fibroblasti normali e CAF 9,15. Questo metodo permette di isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF, tra cui, ma non limitato a α-SMA + attivato miofibroblasti. Fibroblasti isolati possono quindi essereutilizzati per la caratterizzazione e confronto dell'evoluzione di espressione genica che si verifica nei CAFS durante la tumorigenesi. In effetti, noi e gli altri segnalati profilo di espressione di fibroblasti isolati da cellule ordinamento 16. Questo protocollo è stato eseguito con successo per isolare e creare un profilo popolazioni altamente arricchito di fibroblasti dai tessuti della pelle, della mammella, del pancreas e del polmone. Inoltre, il nostro metodo permette anche di coltura delle cellule filtrate, per eseguire esperimenti funzionali e per evitare contaminazione da cellule tumorali, che spesso è un grosso ostacolo quando si cerca di CAF cultura.
Protocol
1. Dissezione tessuto mammario o con la pelle di topi
- Prima di sezionare il tessuto desiderato dai topi, preparare le seguenti forniture e dei reagenti:
Materiali di consumo:
- Strumenti chirurgici (lavato con detergente e poi immersi in 70% etanolo).
- Superficie di polistirolo per appoggiare il mouse su durante la dissezione.
- Pins o aghi per tenere i topi durante la dissezione.
- Vaso di vetro con coperchio per la digestione, contenente barra di agitazione magnetica (autoclave).
- Bagnomaria a 37 ° C, contenente un agitatore magnetico sommergibile e acqua sufficiente per immergere il vaso digestione, mentre appoggio alla piastra di agitazione.
Reagenti:
- FACS buffer di I: (4 ° C): fosfato Dulbecco Buffered Saline CMF (Calcio Magnesio gratuita) + 0,5% di BSA
- Soluzione di collagenasi (immediatamente prima dell'uso):
0,05 g Collagenasi II
0,05 g Collagenasi IV
0,01 g Deoxyribonuclease
20ml FACS tampone I. Tenere soluzione di collagenasi in ghiaccio fino al momento dell'uso. - PharmLyse (cloruro di ammonio Reagente di lisi).
- FACS tampone II: fosfato Dulbecco Buffered Saline CMF + 1% FCS.
- Dissezione delle ghiandole mammarie (vedi anche 17).
- Eutanasia topi di sesso femminile con anidride carbonica (CO 2) inalazione.
- Su una superficie di polistirolo, posizionare il mouse sul dorso e pin saldamente tutti e quattro gli arti con aghi calibro 25 (Figura 1A). Spruzzare il mouse generosamente con il 70% di etanolo.
- Utilizzando pinze, tirare la pelle addominale sulla linea mediana e fare una piccola incisione con le forbici affilate.
- Partendo dall'incisione, tagliare la pelle fino al collo dell'animale evitando pungere cavità addominale o toracica.
- Tagliare la pelle delle gambe posteriori della incisione mediana verso la gamba, risultanti in una "forma Y".
- Tirare la pelle lontano dal corpo del mouse e definire, esponendole ghiandole mammarie fissato al lato inferiore della pelle (Figura 1B).
- Utilizzare Q-tips per separare delicatamente ghiandole mammarie dalla pelle durante il taglio di tessuto connettivo, con piccole forbici affilate per separare la ghiandola mammaria verso la colonna vertebrale del mouse.
- Le ghiandole addominali (# 4, 5) sono i migliori per questo protocollo. È inoltre possibile utilizzare la ghiandola mammaria 2 °, ma tenere a mente che queste ghiandole sono anatomicamente trova in prossimità del muscolo pettorale, che può essere difficile da separare, con conseguente cellule di origine del tessuto misto.
- Nota: Quando la dissezione del tessuto tumorale, si consiglia di rimuovere le aree necrotiche.
- La dissezione del tessuto cutaneo: Il modo più semplice per ottenere tessuto cutaneo, senza avere a che fare con la rimozione dei capelli è quello di utilizzare le orecchie del mouse. Se una maggiore quantità di tessuto è necessario, è possibile radersi i capelli dal tronco del mouse e sezionare la pelle.
- Eutanasia topo, utilizzando CO 2 inalazione.
- Utilizzando forbici affilate, tagliare entrambe le orecchie e mettere subito in vaso di digestione contenente un piccolo volume (~ 0,5 ml) di PBS su ghiaccio.
2. Preparazione della ghiandola mammaria / pelle Sospensione singola cella
- Posizionare ghiandole mammarie / pelle in vaso di digestione contenente un piccolo volume di PBS sul ghiaccio. Se il tessuto è sanguinosa x2 lavaggio con PBS, e quindi eliminare l'eccesso di PBS.
- Tritare accuratamente con le forbici curve.
- Aggiungi (nota: questa quantità di soluzione di collagenasi in modo efficiente dissociare circa 5 g di tessuto mammario o tumore e le orecchie da fino a 15 topi) 20 ml di soluzione di collagenasi.
- Mettere immediatamente mescolare piastra a 37 ° C in bagno d'acqua, e incubare per 15 minuti sotto agitazione al tasso medio.
Nota: i tempi ottimali di incubazione può variare se digerire altri tessuti.
- Per arrestare la reazione, aggiungere 30 ml DMEM freddo + 10% FCS.
- Filtrare il tessuto / media throug miscela70 ha filtro cella um collocato su un tubo da 50 ml.
- Centrifugare la provetta conica per 5 min a 450 xg a 4 ° C.
3. Blood Red Cells Lysis
Nota: questo passaggio non è necessario se i topi sono stati il cuore perfusi con PBS prima di essere sacrificati.
- Aspirare il supernatante usando una pipetta di vetro collegato a vuoto, senza disturbare il pellet.
- Per lisare RBC, risospendere il pellet cellulare in 10 ml di soluzione di PharmLyse e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Neutralizzare la soluzione PharmLyse con l'aggiunta di circa 40 ml di FACS tampone I.
- Centrifugare la provetta conica con le cellule per 5 min a 450 xg a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante.
4. Blocco di Fc endogena
- Opzionale: cellule Count per determinare il volume appropriato per le fasi successive.
- Risospendere le cellule in 1-3 ml di FACS buffer di I (a seconda on numero di cellule, e la quantità di anticorpi che si desidera utilizzare).
- Aggiungi FcBlock (anti-mouse CD16/CD32) per raggiungere diluizione 1:50 (10 pg / ml), e incubare su ghiaccio per 10-20 '.
Non c'è bisogno di lavare FcBlock.
5. Colorazione
- Estrarre aliquote di 100 pl per provette Eppendorf da utilizzare come un non-tinto controllo e comandi a singolo colore (a seconda del numero di anticorpi fluorescenti utilizzate).
- Per fibroblasti etichetta: aggiungere anti-PDGFRα (direttamente coniugato fluoroforo) ad una diluizione di 1:50 (10 pg / ml).
- Per etichettare popolazioni cellulari (es. cellule immunitarie, macrofagi, cellule endoteliali ecc): aggiungere appropriati anticorpi fluorescenti coniugati a marcatori di superficie, ad una diluizione 1:50.
Nota: sebbene PDGFRα è un marcatore robusto per fibroblasti, si raccomanda di includere anticorpi per cellule immunitarie e cellule epiteliali in modo da escludere qualsiasi positivo doppiapopolazioni e quindi aumentare la purezza dei fibroblasti isolati.
- Aggiungere 2 microlitri di ciascun anticorpo a ciascuno dei singoli tubi eppendorf colore controllo.
- Incubare le cellule con anticorpi per 1 ora su ghiaccio al buio.
- Per lavare: riempire i tubi con tampone FACS I e girare per 5 min a 450 xg a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in tampone FACS I a una concentrazione di circa 2 x 10 6 cellule / ml, o qualsiasi concentrazione più appropriato per l'ordinamento con il sorter disponibili FACS.
Opzionale: Le cellule possono essere risospese in tampone FACS II per la durata di smistamento. Questo può migliorare la vitalità cellulare. Tuttavia, l'esposizione a fattori nel siero possono avere un effetto espressione genica, che deve essere testato, e prese in considerazione.
- Trasferire cellule marcate in tubi FACS con filtro migliori: celle filtranti nei tubi per evitare grumi di cellule.
- Per escludere cellule morte, aggiungere 7AAD (0,5 mcg / ml) o Propidium Ioduro (PI) ai campioni (tranne che per il non-macchiato di controllo).
Nota: Per evitare di sprecare le celle, è possibile aggiungere 7AAD/PI al non-tinto campione dopo la registrazione nel FACS, e usare di nuovo come 7AAD-solo il controllo.
- Conservare i campioni in ghiaccio durante l'analisi.
6. Isolamento delle cellule da FACS
(Nota: questa parte del protocollo richiede conoscenza nella gestione di un selezionatore FACS, ad esempio BD FACS AriaII, o l'assistenza di un tecnico specializzato).
- Utilizzando il software di FACS sorter (BD FACSDiva), preparare grafici di analisi adeguati per l'analisi forward scatter (FSC), dispersione laterale (SSC), 7AAD, FITC, PE e qualsiasi altro fluoroforo utilizzato per etichettare le cellule (Figura 2).
- Prima di caricare ogni campione al cell sorter, vortice brevemente per risospendere le cellule.
- Inizia analizzando il campione non colorato per impostare il gating della popolazione cellulare totale, per escludere il celL detriti, e per determinare autofluorescenza o colorazione di fondo.
- Analizzare campione senza macchia + 7AAD per determinare e porta la popolazione di cellule vive della popolazione cellulare totale.
- Analizzare ogni singolo controllo del colore per determinare e calibrare i parametri quali la compensazione.
- Analizzare il campione colorato per definire la posizione di porte per l'ordinamento.
- Una volta che i parametri e le porte per le popolazioni cellulari desiderati sono stati impostati, iniziare l'ordinamento dei popolazioni di cellule etichettate in provette Eppendorf o provette da 15 ml coniche contenenti terreno di coltura o tampone di lisi RNA (come RLT tampone o Trizol).
Nota: Se l'ordinamento di un gran numero di cellule, non è consigliabile per ordinare direttamente nel tampone di lisi RNA, come il volume di liquido guaina accompagna le cellule diluire il tampone di lisi e ridurre la resa.
- Spin celle in basso subito dopo la cernita è finito, e il trasferimento in terreno fresco o tampone di lisi RNA, dein attesa dello scopo dell'esperimento.
- Se l'ordinamento, al fine di isolate cellule di coltura, eseguire sorta sterile. Per migliore recupero delle cellule, utilizzare rosso fenolo libero DMEM + 5% FCS anziché FACS tampone II e raccogliere cellule in mezzo di coltura con 20% FCS.
- Se la coltura ordinati fibroblasti, alwaysplate su piastre rivestite di collagene e mai direttamente sulla plastica come questo si traduce in attivazione dei fibroblasti che portano a cambiamenti nella loro espressione genica.
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Representative Results
Utilizzando PDGFRα come marker risultati fibroblasti in isolamento delle popolazioni altamente arricchito di fibroblasti tissutali. Il livello di purezza dopo la cernita era del 99%, come quantificato mediante analisi post-liste (Figura 2A). Valutare la percentuale di contaminanti non fibroblasti cellule mediante l'espressione relativa di cellula-specifici geni di controllo (Figura 2B) mostra tipicamente 0,1-0,6% contaminazione. Questo livello di purezza permette di alta profilazione trascrittoma qualità dei fibroblasti isolati 9.
In ghiandole mammarie, la percentuale di fibroblasti nel tessuto varia tra 5-20% in normale tessuto mammario, e 1-5% in MMTV-PyMT tumori. La percentuale relativa di fibroblasti nel tessuto tumorale è inferiore in tessuto pre-neoplastiche, nonostante l'aumento del numero totale di fibroblasti, a causa della massiccia espansione del compartimento epiteliale. L'% ridotta fibroblasti isolati da tessuto tumorale è anche il risultato dil'aggiunta difficoltà tecnica e diminuita efficienza di separazione delle cellule da un tessuto altamente necrotico.
Fibroblasti isolati possono essere coltivate direttamente dopo l'ordinamento, ma può richiedere un paio di giorni per recuperare (Figura 2D). È indispensabile effettuare tutte ulteriori esperimenti con cellule passaggio basso, come fibroblasti primari subiscono senescenza durante la propagazione in coltura.
Figura 1. Purificazione di fibroblasti da nuove ghiandole mammarie. A-FVB / n / PyMT mouse. B-Exposed ghiandole mammarie. Ghiandole mammarie C-freschi sono stati sezionati da FVB / n / topi PyMT e digerito con collagenasi ad una sospensione singola cella. Le cellule sono state marcate con immuno-anticorpi per marcatore di superficie dei fibroblasti (PDGFRα) e masuperficie crophages marcatore (F4/80) seguita dalla separazione da FACS. Fibroblasti ordine erano o coltivate o lisati per la purificazione dell'RNA. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Profiling dei fibroblasti ordinati. A-singole sospensioni di cellule di ghiandole mammarie di topo sono state colorate con PDGFRαand F4/80 anticorpi. Ordinamento FACS trama è mostrato (pannello di sinistra). P2 è la porta fibroblasti (cellule PDGFRα +) e P4 è il cancello macrofagi (cellule F4/80 +). Un'analisi sorta messaggio è stato eseguito per determinare la purezza di fibroblasti filtrate e macrofagi (pannelli centrali e destra). B-Analisi di purezza ordinamento per RT-PCR su cellula-specifici geni di controllo per fibroblast (PDGFRα, Col-1α), le cellule immunitarie (CD45, CSF-1R) e cellule epiteliali (E-caderina). I risultati sono stati normalizzati a casa di due geni in custodia (GAPDH e MGUS). Di espressione rispetto al GAPDH è mostrato. C-Quantificazione di espressione PDGFRα nel totale della popolazione non selezionata di fibroblasti mammari. Tessuto D-cultura di fibroblasti ordinati. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Mentre esperimenti condotti in coltura tissutale può essere informativo e suggerire principi funzionali che possono essere verificati in vivo, è noto che si verificano grandi cambiamenti nell'espressione genica di cellule in coltura 11,12. Per evitare un passo coltura tissutale a profilare espressione genica in fibroblasti, abbiamo sviluppato un protocollo che permette di isolare normali, così come cancro-associate fibroblasti di topo freschi o tessuti umani. Questo protocollo è stato applicato con successo con i tessuti della pelle, pancreas e della mammella da topo e da umano 9. Isolamento di fibroblasti di smistamento FACS richiede un marcatore di superficie che fibroblasti etichette. Abbiamo stabilito che PDGFRα è un marcatore di superficie robusta che permette l'isolamento di popolazioni altamente arricchito di fibroblasti 9. Inoltre, PDGFRα è espressa su entrambi i fibroblasti del tessuto normale e il CAF, consentendo in tal modo l'isolamento imparziale e profilazione dei fibroblasti del tessuto piuttosto che focusing su una sottopopolazione specifica.
I fibroblasti sono una popolazione cellulare eterogenea per quanto riguarda l'espressione di molecole marker così come nella loro origine e proprietà di segnalazione 8,10,18. Mentre PDGFRα è un marcatore di superficie solida di fibroblasti, non etichetta 100% di fibroblasti in tutti i tessuti risultanti in una sottopopolazione di cellule senza etichetta, a seconda del tipo di tessuto. In pelle, circa il 90% dei fibroblasti sono PDGFRα + (non mostrato), mentre nelle ghiandole mammarie di circa 85% del totale dei fibroblasti tissutali sono PDGFRα + (Figura 2C). La percentuale di PDGFRα fibroblasti esprimenti possono variare in altri tipi di tessuto, e deve essere definito per ciascun tessuto. Tuttavia, in pelle e in ghiandole mammarie, utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie cellulare si tradurrà in popolazioni altamente arricchito della maggioranza dei fibroblasti tissutali, consentendo profilo di espressione o coltura di cellule filtrate.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Yitzchak Oschry e il Dr. Orit Sagi-Asif per il loro aiuto con la selezione FACS. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni a NE del programma europeo per il Settimo programma quadro dell'Unione (FP7/2007-2013) nell'ambito della convenzione di sovvenzione n ° [276890], da Israele Cancer Association (# 20110078), e da Israele Cancer Research Fund (Ricerca Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 Forthcoming.
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
