Summary
وصفنا باستخدام بروتوكول الشرائح غرفة وسائل الاعلام الى شل النبتات مصنع للتصوير مبائر للبشرة على مدى عدة أيام للتنمية وتوثيق التمايز الثغور. يمكن تتبع البروتينات Fluorophore الموسومة بشكل حيوي بواسطة التعبير وتوطين التحت خلوية، وزيادة فهم أدوارهم ممكن خلال انقسام الخلايا وتمايز الخلايا من نوع.
Abstract
يمكن التصوير في الجسم الحي من ديناميات السلوك الخلوية في جميع أنحاء سلسلة التنموية تكون تقنية قوية لفهم آليات الزخرفة الأنسجة. خلال التنمية الحيوانية، مفتاح تكاثر الخلايا والزخرفة الأحداث تحدث بسرعة كبيرة. على سبيل المثال، في ايليجانس Caenorhabditis يتم إكمال كافة الانقسامات الخلوية اللازمة لخطة الهيئة اليرقات في غضون ست ساعات بعد الإخصاب، مع دورات الإنقسامية سبعة 1، وmitoses ستة عشر أو أكثر من مرحلة التطور الجنيني ذبابة الفاكهة تحدث في أقل من 24 ساعة 2. في المقابل، الانقسامات الخلوية خلال تطوير مصنع بطيئة، وعادة بناء على أمر من يوم 3،4،5. هذا يفرض تحديا فريدا من نوعه، والحاجة لفترة طويلة الأجل التصوير الحي لتوثيق السلوكيات الحيوية من انقسام الخلايا والتمايز الأحداث خلال توالد الأعضاء النباتية. ل arabidopsis البشرة هو نظام نموذجا ممتازا لإشارات التحقيق، مصير الخلية، والتنمية في النباتات. في فلقة، هذا النسيج يتكون من الهواء وخلايا مقاومة للماء الرصيف تتخللها الثغور موزعة بالتساوي، والصمامات التي تفتح وتغلق للتحكم في تبادل الغازات وفقدان المياه. تباعد السليم لهذه الثغور أمر بالغ الأهمية لوظيفتها، وتنميتها يلي سلسلة من الخطوات غير المتماثلة وتقسيم تمايز الخلايا لإنتاج المنظمة البشرة (الشكل 1).
يسمح هذا البروتوكول مراقبة الخلايا والبروتينات في البشرة على مدى عدة أيام للتنمية. هذا الإطار الزمني الدقيق للتمكن الوثائق الخلايا الجذعية الانقسامات وتمايز خلايا البشرة، بما في ذلك خلايا الثغور والرصيف البشرة. يمكن تنصهر البروتينات الفلورية إلى البروتينات التي تهم تقييم ديناميتها خلال انقسام الخلايا والعمليات التمايز. هذه التقنية تتيح لنا أن نفهم توطين بروتين الرواية، POLAR 6، خلال المرحلة انتشار الثغور-نسب الخلايا في الالبشرة ه فلقة arabidopsis، وحيث يتم التعبير عن ذلك في الخلايا التي تسبق الأحداث تقسيم غير المتماثلة وينتقل إلى منطقة مميزة للقشرة الخلية قبل وقت قصير من شعبة يحدث. يمكن تسجيل الصور والفيديو بسهولة باستخدام تبسيط إنتاج البرامج العامة المجال لتصور دينامية توطين البروتين وأنواع الخلايا لأنها تتغير مع مرور الوقت.
Protocol
1. البذور التعقيم
- إعداد البذور حل التعقيم: 33٪ التبييض المنزلية، 0.1٪ تريتون X-100.
- بذور المكان المطلوب بناء تحمل مراسل الفلورسنت (ق) وراثى (ق) في أنبوب مل 1.7 و 1 مل من تطبيق الحل التعقيم. احتضان على nutator لمدة 15 دقيقة.
- في غطاء محرك السيارة العقيمة، استخدم pipettor حل لإزالة أنبوب التعقيم من، وترك البذور وراء. شطف مع الماء 1 مل العقيمة. كرر أربع مرات.
- احتضان في C ° 4 لمدة يومين أو أكثر.
2. إعداد غرفة الشرائح وسائل الإعلام
- خلط 20 مل من محلول 0.5٪ من أجار Bacto (الاغاروز يست نقية) في الماء في قارورة 200 مل، والميكروويف حتى يذوب. توخي الحذر عند الغليان الحل.
- تبريد ° C. حل لحوالي 60
- جمع 1 مل من محلول الآجار مع pipettor وتطبيق ببطء على الزجاج الغلاف الداخلي الشريحة غرفة (لاب تيك II تشامبيريد ساترة # 1.5 النظام الألماني). حل ثhich حار جدا أو تطبيقها بسرعة كبيرة جدا قد تذوب الغراء أو الزجاج الكراك.
- إضافة على الفور مل الثاني من الحل أجار. ينبغي على وسائل أجار الآن تغطي كامل الجزء السفلي من الغرفة الشريحة. هذه الوسائط هي الحد الأدنى كافية لدعم التنمية في فلقة المصنع الذي يحتوي على العناصر الغذائية المخزنة، لمدة أربعة إلى خمسة أيام من خلال الحفاظ على الرطوبة والسماح انتشار الغاز.
- الشريحة باردة على الفوق مع غرفة مغطاة. إذا تم تغطيتها بإحكام قارورة، قد يتم حفظ الحل وإعادة تسخينها لاستخدامها في المستقبل.
3. تشريح البذور
- إزالة أنبوب من البذور العقيمة من 4 ° C التخزين.
- وضع منديل ورقي على مسرح المجهر تشريح وبلل بالماء. ضبط الأنسجة لخلق سطح أملس. ويستخدم نسيج لتحقيق الاستقرار بذور تشريح.
- الماصة 20-30 البذور من الأنبوب إلى الأنسجة، والحرص على وضعها في مجال نطاق تشريح وجهة نظر.
- باستخدام ملقط حاد (Roboz، رقم 5 تلميح البيولوجيا)، وإزالة بعناية معطف البذور من الداخل الشتلات. يجب إزالة كل integuments الخارجي والداخلي.
- عندما تصوير فلقة، من المفيد لإزالة التحتفلقي والجذير الجنيني. النبتات تحتوي على مواد مغذية كافية لتطوير لعدة أيام بموجب هذا البروتوكول. إذا سليمة، فإن التحتفلقي تصويب وإطالة بشكل كبير، نقل فلقة من الوقت مضي مجال الرأي. استخدام مشرط لشريحة النبتات خالية من التحتفلقي.
- عقد النبتات تشريح مغمورة في الماء، في microtube أو ما شابه ذلك.
- تكرار 3،4-3،6 حتى يتم الوصول إلى العدد المرغوب فيه من النبتات. ويوصى 15-20 تشريح بنجاح قبل التركيب.
4. تصاعد النبتات في غرفة الشرائح
- زلة صغيرة باستخدام غطاء (18 ملم 2)، وقطع طريق وسائل الإعلام وأجار رفع طبقة بأكملها ارتفاعا من قاعدة الزجاج الشريحة الغرفة.
- الماصة تشريح النبتات مع حد أدنى من المياه من عقدأنبوب في الشريحة غرفة، تحت طبقة أجار رفع.
- خفض بلطف على أجار والنبتات. إذا كان الماء الزائد هو الحاضر، نقع بعيدا بمنديل، والحرص على عدم تعكير صفو النبتات. يجب أن العينات لم تعد تتحرك بسهولة عند جبل كاملة.
- وضع غطاء على الشريحة والشريحة غرفة الانتقال إلى مرحلة المجهر.
5. الفاصل الزمني التصوير
- انشاء المجهر مبائر مقلوب لصورة fluorophore المطلوب (ق). LSM700 المعلمات المستخدمة: لGFP، الإثارة في 488 نانومتر، وجمع مع تمريرة الفرقة مرشح في 440-530 نانومتر؛ لطلب تقديم العروض، الإثارة في 555 نانومتر، وجمع مع تمريرة الفرقة مرشح في 570-610 نانومتر.
- تفتيش العينات التي شنت عن الضرر. شنت صحيح برمجة مواقع سليمة، النبتات في صناعة البرمجيات المجهر. زن في 2009: التركيز على فلقة مع 20x الهدف والانتقال إلى مركز الهدف من الشريحة الغرفة. تحت وضع الاستحواذ وتغيير التكبير إلى 0.5 وحجم الإطار </ em> ل48x48 بيكسل. حدد مربع الاختيار مواقف والمسح الضوئي الصور ... نبذة زر تحت المواقف، ثم زيادة أعداد بلاط الأفقي والرأسي ل30-35. عندما اكتمال التفحص، انقر فوق الزر مواقف تحت علامة التبويب الأبعاد ومكان مرمى في كل فلقة لمراقبة.
- انشاء زد يشمل البشرة فلقة من جميع زن samples.In 2009: انقر على مربع الاختيار Z-المكدس. حدد كل موقف ضمن قائمة المركز وانقر فوق الانتقال إلى الزر. التركيز على الطائرة العلوي من البشرة فلقة وانقر على زر المجموعة الأولى تحت Z-المكدس. التركيز إلى أدنى الموضع الذي مرئيا البشرة مفيد وانقر فوق الزر تعيين آخر. انقر على زر التالي لالأمثل، مما يدل على أفضل شريحة سمك Z-، لتعيين. التحقق من كل فلقة للتأكد من أن هذه الإعدادات تشمل جميع العينات، ويمكن لا ض المعلمات يتم تعيين لفرديidual مناصب في عام 2009 زين.
- إعداد سلسلة زمنية في القرار المطلوب والطول. فترات من 15-30 دقيقة لمدة ثلاثة أيام هي فعالة للديناميات البروتين في انقسام الخلايا البشرة. يمكن تغيير هذا الفاصل الزمني عند الضرورة. زن في 2009: انقر فوق خانة الاختيار السلاسل الزمنية. تحت السلاسل الزمنية، على دورات لعدد من الصور المطلوبة باستخدام شريط التمرير أو الكتابة في حقل النص. تعيين الفاصل الزمني إلى 30 واستخدم القائمة المنسدلة لتحديد الحد الأدنى.
- تبدأ xyzt متعددة موقف الفحص. ملاحظة أنه يجب أن يقتصر عدد مواقف من المواصفات المسح، وإذا إجمالي وقت الفحص أكبر من الفاصل الزمني المطلوب، ونقطة الوقت لن يكون صحيحا. A أقصاها ستة مواقع في وقت واحد أمر ممكن عندما GFP التصوير وRFP في 59 Z-الشرائح في فاصل زمني دقيقة باستخدام 30-نظامنا. زن في 2009: تغيير حجم الإطار إلى الدقة المطلوبة وانقر فوق ابدأ التجربة.
6. تحرير الفيديو
- من ملف البيانات مبائر، وجعل الكثافة القصوى Z-إسقاط كل تركيبة الوقت / موقف وتصدير وملفات الصور في شكل ضياع مثل TIFF. يجب أن تكون أسماء الملفات في سلسلة واحدة في موقف (على سبيل المثال، POLAR-GFP_pos1_0001، POLAR-GFP_pos1_0002، وما إلى ذلك، وليس POLAR-GFP_0001_pos1) لبرنامج للجمع بينهما في فيلم. زن في 2009: نسخة الاستعمال: المجموعة الثانوية تحت علامة التبويب معالجة لتقسيم المناصب في ملفات منفصلة، ثم أقصى كثافة الإسقاط. وأخيرا، وتصدير TIFF (ملف: تصدير، صورة دقة كاملة نافذة - سلسلة).
- استخدام FIJI 7،8 إلى محاذاة الصور المتعاقبة عن طريق تشغيل الماكرو bUnwarpJ 9 (الإضافات: التسجيل: bUnwarpJ). تغيير وضع التسجيل لمونو. يمكن لجميع خيارات متقدمة استخدام القيم الافتراضية. لفترة طويلة متواليات الفاصل الزمني، قم بتحميل وتثبيت الماكرو "+ تمشيا أفيني مطاطا صورة التسجيل 2D"، والتي سيتم تطبيقها bUnwarpJ لسلسلة من الصور تلقائيا، و y المفتوحةباستخدام البيانات المتوفرة لدينا الملف: استيراد: تسلسل الصور لاستخدامها. إلغاء اجتماعات الأطراف معالم استخراج والتشغيل.
- استخدام FIJI / يماغيج أو كويك تايم برو لفتح سلسلة من الصور الانحياز وحفظ في تنسيق الفيديو المطلوب (AVI هو خيار جيد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر مجموعة من النقاط التي تم جمعها الوقت بالمعلومات مع هذا الأسلوب في الشكل 3. وصفت أغشية الخلايا مع RFP (الساعة RB) وتنصهر لGFP البروتين POLAR تحت المروج موطنه الأصلي (POLAR :: POLAR-GFP) 6 في النطاق الزمني 30-دقيقة، ونحن نرى انقسامات الخلية جنبا إلى جنب مع التغيرات في توطين البروتين سبقت لهم. الانقسامات الخلوية غير المتماثلة في شكل نسب الثغور الخلايا الجذعية مثل السلائف الثغور يسمى meristemoids، التي تحتفظ بالقدرة على الخضوع المزيد من الانقسامات غير المتماثلة، والخلايا أختهم، ودعا الخلايا الثغور الأرض النسب (SLGCs). SLGCs لا تفترض مصير السلائف الثغور، بل في كثير من الأحيان إلى خلايا transdifferentiate الرصيف، ولكن قد تستأنف غير المتماثلة القدرة على إنتاج تقسيم آخر meristemoid متباعدة بعيدا عن أول ورقة وتوسع. وترد كل هذه المصائر في التعبير وتوطين POLAR :: POLAR-GFP (الشكل 3، فيديو 1).
jove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الشكل 1. التخطيطي للتنمية الثغور. الخلايا Protodermal إدخال النسب الثغور والخلايا الأم meristemoid (MMC) في خطوة تسيطر عليها عوامل النسخ الأساسية الحلزون حلزون حلقة الكلام (SPCH)، SCREAM (SCRM)، وSCRM2. المركبه تقسيم غير متماثلة لإنتاج meristemoid (M) والثغور الخلية الأرض النسب (SLGC)؛ هذه الخطوة قد تحدث عدة مرات، ويوفر آلية واحدة من الثغور التي متباعدة عن بعضها البعض. الانتقال خلية حالة meristemoid للحرس الخلية الأم (GMC) موجه على وجه التحديد هوية bHLH MUTE وكذلك SCRM / 2. A قسم النهائية متماثل من GMC والتمييز بينه وإلى خليتين حارس الناضجة (GC) يتطلب FAMA bHLH مع SCRM / 2 10.ig1large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.
الشكل 2. التنظيمي للتشريح البذور والإجراءات المتزايدة. يتم تعقيم البذور وعقدت في 4 درجات مئوية، والمعاطف البذور وإزالة hypocotyls، والنبتات وشنت وسائل الإعلام تحت أجار في شريحة غرفة للتصوير وعلى المجهر مبائر مقلوب.
الشكل 3. الوقت الفاصل بين التصوير يوضح POLAR :: POLAR-GFP توطين البعيدة التي سبقت انقسام الخلايا غير المتماثلة. سلسلة A: POLAR-GFP يبدو في البداية موزعة بالتساوي، ثم ما يقرب من ساعتين قبل asymmetric الانقسامات (النصال) POLAR-GFP تفصل بعيدا عن موقع meristemoid بدايته. سلسلة B: بعد تقسيم غير المتماثلة الأولي (رأس السهم)، POLAR-GFP يختفي في كل من الخلايا، مما يعني الانتقال السريع لحراسة الخلية الأم (GMC) من قبل الدولة meristemoid. وGMC (النجمة) يقسم ويفرق بشكل متناظر لتشكيل خلايا الحرس الثغور، في حين أن الخلية الشقيقة يستعيد POLAR-GFP التعبير، ينذر يفترض تقسيم غير المتماثلة في وقت لاحق.
الفيديو 1. تبسيط والفيديو المسجل من POLAR توطين POLAR-GFP :: التضخيم والمباعدة بين الولادات خلال خلية واحدة من السلائف الثغور. في البداية، يبدو POLAR-GFP بشكل موحد في الخلية؛ بنسبة 39 ساعة بعد الإنبات، فإنه تستقطب بقوة، قبل تقسيم (40.0h) وضع أصغر meristemoid في الطرف المقابل للخلية. أكبر خلية في حق يستعيد أيضا الثغور هوية النسب، وبنسبة 45 ساعة POLAR-GFP توطين يتحرك بالقرب من السلائف الثغور. شعبة الموارد البشرية في 47 تنتج meristemoid الجديدة (يمين) موجهة بعيدا عن meristemoid القائمة (يسار) من الأولى. النتيجة النهائية هي سنتان الثغور مفصولة خلية واحدة. (لم تجمع صور المفقودين من الفيديو وهي لا تمثل تغييرات كبيرة.) أنقر هنا لمشاهدة الفيلم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه التقنية الوقت الفاصل بين مبائر يسمح الدراسات الطولية التعبير البروتين الموسومة fluorescently والترجمة في الخلايا الفردية في البشرة فلقة arabidopsis، والتي في حالة POLAR وغيرها من البروتينات بشكل حيوي تغيير أمر بالغ الأهمية لفهم صحيح وظيفتها. سابقا، وقد استخدم التصوير المستمر مرور الوقت لدراسة ل arabidopsis العدوى الفطرية الجذر النمو النسيج الإنشائي 11 و 5،12، لكنه اضاف ان البشرة فلقة يوسع براعة هذا الأسلوب ويسمح استخدامها في البروتينات إضافية، ولا سيما مجال مساعدة توسيع التنمية الثغور .
الحد البروتوكول الرئيسي هو أن يقتصر حاليا على النبتات، والتي تحتوي على العناصر الغذائية التي يحتاجون إليها من أجل التنمية في وقت مبكر. مزيد من فلقة التنمية ليست مطابقة تماما لأنه خضع في الهواء لأن جل المتوسطة يقيد تبادل الغازات. لا المسحالتعرض سر وأضواء الغرفة كافية لتخلق ضوئي، الأمر الذي أدى التوسع فلقة والنضج بلاستيدات الخضراء، ولكن قد تتطور في بعض الأحيان الثغور في أزواج المجاورة بسبب انخفاض تركيز CO 2. ويمكن تخفيض هذا الاتجاه باستخدام طبقة رقيقة فقط من وسائل الإعلام والحد الأدنى من المياه المتصاعدة وفقا لتوجيهات في هذا البروتوكول.
اختيار Fluorophore المهم أيضا للنجاح مع هذه التقنية. كلا GFP وRFP تعمل بشكل جيد، والسماح لتصور وضع العلامات مزدوجة هامش الخلية أو تقييم البروتين شارك في الترجمة. عوامل تصفية مخصصة يقلل كثيرا تألق ذاتي والسماح كشف حساسة من العلامات بروتين فلوري حتى عندما الكلوروفيل موجودا. ومع ذلك، حتى تمت تصفيتها في تألق ذاتي CFP النبتات الإنبات قوي بما فيه الكفاية لمنع الرؤية من إشارة كلها تقريبا باستخدام LSM700. بالنسبة للأدوات التي لديها قدرة unmixing الطيفية، قد اختيار أوسع من fluorophores يكون ممكنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر اماندا Rychel للمساعدة في تطوير والفاصل الزمني بروتوكول Pillitteri لين لبناء POLAR :: POLAR-EGFP. ونحن ممتنون أيضا للABRC لتوفير الساعة RB بناء. وقد تم تطوير هذا البروتوكول من خلال الدعم المقدم من جائزة PRESTO من تكنولوجيا العلوم اليابان والوكالة. وأيد أيضا البحث عن POLAR من جامعة واشنطن أبحاث صناديق الملوك (RRF-4098) والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB-0855659). تتمتع الشركة بميزة هو زميل أبحاث الدراسات العليا NSF (DGE-0718124)، والكوت هو محقق HHMI-GBMF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji (2008).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
