Summary
Wir beschreiben ein Protokoll mit Kammer-Objektträgern und Medien zu pflanzen Keimblätter für die konfokale Bildgebung der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung immobilisieren, zu dokumentieren stomatal Differenzierung. Fluorophor-markierte Proteine können dynamisch durch Expression und subzelluläre Lokalisation verfolgt werden, das Verständnis ihrer möglichen Rollen bei der Zellteilung und Zelltyp-Differenzierung.
Abstract
Imaging in vivo Dynamik zellulärer Verhalten während einer Entwicklungsstörung Sequenz kann eine leistungsstarke Technik für das Verständnis der Mechanik des Gewebes Strukturierung sein. Während tierischen Entwicklung treten Schlüssel Zellproliferation und Strukturierung Ereignisse sehr schnell. Zum Beispiel, in Caenorhabditis elegans alle Zellteilungen für die Larven Bauplan erforderlich sind innerhalb von sechs Stunden nach der Befruchtung abgeschlossen, mit sieben mitotische Zyklen 1, die sechzehn oder mehr Mitosen von Drosophila Embryogenese treten in weniger als 24 Stunden 2. Im Gegensatz dazu sind Zellteilungen der Pflanzenentwicklung langsam, typischerweise in der Größenordnung von einem Tag 3,4,5. Dies stellt eine einzigartige Herausforderung und eine Notwendigkeit für die langfristige Echtzeit-Bildgebung für die Dokumentation dynamische Verhalten der Zellteilung und Differenzierung Ereignisse während Pflanzen Organogenese. Arabidopsis Epidermis ist ein hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung Signalisierung, das Schicksal der Zelle, und die Entwicklung der Pflanzen. In der cotyledon besteht dieses Gewebe von Luft-und Wasser-resistente Pflaster Zellen mit gleichmäßig verteilten Spaltöffnungen, Ventile sich öffnen und schließen, um den Gasaustausch und Wasserverlust zu kontrollieren. Richtigen Abstand dieser Spaltöffnungen ist entscheidend für ihre Funktion und ihre Entwicklung folgt eine Sequenz von asymmetrischen Teilung und Zelldifferenzierung Schritte, um die organisierte Epidermis (Abb. 1) zu produzieren.
Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung der Zellen und Proteine in der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung. Dieser Zeitrahmen ermöglicht eine präzise Dokumentation der Stammzell-Divisionen und Differenzierung von epidermalen Zellen, einschließlich Spaltöffnungen und epidermalen Pflaster Zellen. Fluoreszierende Proteine können zu interessierenden Proteine fusioniert werden, um ihre Dynamik während der Zellteilung und Differenzierung Prozesse zu beurteilen. Diese Technik ermöglicht es uns, die Lokalisierung eines neuen Proteins, POLAR 6 zu verstehen, während der Proliferation Stadium der Stomata-lineage Zellen in the Arabidopsis Cotyledone Epidermis, wo sie in Zellen asymmetrischen Teilung vorhergehenden Ereignisse und bewegt sich zu einem charakteristischen Bereich des Zellcortex kurz vor Teilung erfolgt exprimiert wird. Bilder können registriert und gestrafft werden Video leicht unter Verwendung Public Domain Software, um dynamische Protein-Lokalisierung und Zelltypen zu visualisieren, wie sie im Laufe der Zeit ändern.
Protocol
Ein. Seed Sterilisation
- Bereiten seed Sterilisationslösung: 33% Bleiche, 0,1% Triton X-100.
- Ort Samen tragenden gewünschten fluoreszierenden Reporter-Konstrukt (en) und Genotyp (en) in 1,7 ml Röhrchen und anwendbar 1 ml Sterilisationslösung. Inkubieren auf Kolbenpendel für 15 min.
- In einer sterilen Haube, verwenden Sie eine Pipette, um eine Sterilisation Lösung von Rohr zu entfernen, so dass Samen hinter sich. Spülen mit 1 ml sterilem Wasser. Wiederholen Sie viermal.
- Inkubieren bei 4 ° C für zwei Tage oder länger.
2. Vorbereitung der Chamber Slide Medien
- Mix 20 ml 0,5% ige Lösung von Bacto Agar (nicht reine Agarose) in Wasser in einem 200 ml Kolben, und einer Mikrowelle bis gelöst. Seien Sie vorsichtig, wenn Kochen der Lösung.
- Abkühlen der Lösung auf etwa 60 ° C
- Sammeln Sie 1 ml Agar-Lösung mit einer Pipette und langsam auf dem Deckglas in der Kammer Schieber (Lab-Tek II Chambered # 1.5 deutschen Deckglas System) anzuwenden. Lösung which ist zu heiß oder zu schnell kann Leim oder Riss Glasschmelze angewendet.
- Unmittelbar fügen Sie eine zweite ml Agar-Lösung. Agarmedien sollte nun vollständig bedeckt den Boden des Schlittens Kammer. Dies Minimalmedien ausreicht, um die Entwicklung in einer Pflanze Cotyledone, die gespeicherten Nährstoffe für vier bis fünf Tage durch Aufrechterhalten Feuchtigkeit und Ermöglichen Gasdiffusionselektrode enthält unterstützen.
- Cool Slide auf dem Labortisch mit Kammer abgedeckt. Wenn Kolben fest verschlossen wird, kann Lösung gespeichert und erneut erhitzt für zukünftige Verwendung.
3. Seed Dissection
- Entfernen Rohr steriles Saatgut von 4 ° C Lagerung.
- Legen Sie ein Papiertuch auf der Bühne einem Binokular und befeuchten mit Wasser. Gewebe einzustellen, um eine glatte Oberfläche zu erzeugen. Tissue wird verwendet, um Samen für die Präparation zu stabilisieren.
- Pipet 20-30 Samen aus der Tube auf das Gewebe, wobei darauf geachtet, sie in der Binokular Sichtfeld des platzieren.
- Mit scharfen Pinzette (Roboz, # 5 Biologie Spitze), Entfernen Sie vorsichtig die Samenschale vom Setzling innen. Beide äußeren und inneren Integumenten müssen entfernt werden.
- Beim Abbilden das Keimblatt, ist es vorteilhaft, das Hypokotyl und Würzelchen zu entfernen. Keimblätter enthalten ausreichend Nährstoffe für mehrere Tage unter dieses Protokoll zu entwickeln. Wenn intakten, wird das Hypocotyl begradigen und drastisch verlängern, Bewegen der Cotyledone aus dem Zeitablauf Sichtfeld. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Keimblätter frei von der Hypokotyl schneiden.
- Halten seziert Kotyledonen in Wasser getaucht, in ein Mikroröhrchen oder ähnliches.
- Wiederholen 3,4-3,6 bis die gewünschte Anzahl von Cotyledonen erreicht ist. 15-20 erfolgreiche Dissektionen sind vor der Montage empfohlen.
4. Montage Keimblätter in der Chamber Slide
- Mit einem kleinen (18 mm 2) Deckglas, schneiden durch die Agar-Medien und heben Sie die gesamte Schicht aus der Kammer slide ist durch den Glasboden.
- Pipette seziert Cotyledonen mit einem Minimum an Wasser aus anhältRohr in der Kammer gleiten, unter das angehobene Agarschicht.
- Senken Sie die Agar auf die Keimblätter. Wenn überschüssiges Wasser vorhanden ist, legen Sie ihn weg mit einem Gewebe, darauf achtend, nicht die Keimblätter stören. Die Proben sollten nicht mehr so leicht zu bewegen, wenn Mount abgeschlossen ist.
- Zeigen Abdeckung auf Kammerobjektträgers und bewegen Folie Mikroskoptisch.
5. Time Lapse Imaging
- Richten invertierten konfokalen Mikroskop zur Abbildung der gewünschten Fluorophor (s). LSM700 Parameter verwendet: für GFP, Anregung bei 488 nm und Sammlung mit einem Bandpassfilter bei 440-530 nm; für RFP, Anregung bei 555 nm und Sammlung mit einem Bandpassfilter bei 570-610 nm aufweist.
- Kontrollieren eingebettete Proben für Schäden. Programmieren Sie die Standorte der intakten, ordnungsgemäß montiert Keimblätter in Mikroskop-Software. Im Zen 2009: Fokus auf einer cotyledon mit 20x-Objektiv und bewegen Ziel Nutzraummitte Folie. Unter Acquisition Mode, ändern Zoom bis 0,5 und Baugröße </ Em> 48x48 Pixel. Wählen Positionen Checkbox und Scan Übersicht Bild ... Button unter Positionen, dann erhöhen Horizontal und Vertikal tile Nummern 30-35. Wenn der Scan abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Positionen Knopf unter der Registerkarte Dimensionen und Ort Fadenkreuz an jedem cotyledon zu beobachten.
- Richten Sie z-Serie umfasst die cotyledon Epidermis aller samples.In Zen 2009: Klicken Sie auf die Z-Stack aktivieren. Wählen Sie jede Position unter Position Liste und klicken Sie auf Move to-Taste. Konzentrieren Sie sich auf der obersten Ebene des cotyledon Epidermis und klicken Sie auf die Set Erste Schaltfläche unter Z-Stack. Konzentrieren Sie sich auf die niedrigste Position, an der Epidermis ist sinnvoll sichtbar und klicken Sie auf die zuletzt eingestellte Taste. Klicken Sie auf die Schaltfläche neben Optimale, was zeigt, die besten z-Schichtdicke, zu setzen. Überprüfen Sie jede cotyledon zu bestätigen, dass diese Einstellungen alle Proben umfassen, die z-Parameter kann nicht für indiv. eingestellt werdenidual Positionen in Zen 2009.
- Richten Sie Zeitreihen auf die gewünschte Auflösung und Länge. Abständen von 15-30 min für drei Tage gelten für Dynamik von Proteinen in epidermalen Zellteilung. Dieses Intervall kann je nach Bedarf geändert werden. Im Zen 2009: Klicken Sie auf die Time Series Kontrollkästchen. Unter Time Series, eingestellt Cycles für die Anzahl der Bilder, die gewünschte mit dem Schieberegler oder Eingabe in das Textfeld ein. Set Interval bis 30 und das Pull-Down-Menü min wählen.
- Beginnen xyzt Multi-Positions-Scan. Beachten Sie, dass die Anzahl von Positionen, die die Scan-Daten begrenzt werden muß, wenn Gesamtabtastzeit größer ist als das gewünschte Intervall, die Zeitpunkte nicht korrekt sein. Es können maximal sechs gleichzeitige Positionen sind möglich, wenn Bildgebung GFP und RFP bei 59 z-Scheiben in einem 30-Minuten-Intervall mit unserem System. Im Zen 2009: Change Frame Size die gewünschte Auflösung und klicken Sie auf Start Experiment.
6. Video Editing
- Von der konfokalen Datendatei, machen eine maximale Intensität z-Projektion jedes Mal / Position Kombination und Export als Bild-Dateien in einem verlustfreien Format wie TIFF. Dateinamen sollten in eine Reihe pro Position (zB POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc., nicht POLAR-GFP_0001_pos1) für die Software, um sie in einem Film zu kombinieren. Im Zen 2009: Verwenden Sie Copy: Subset unter der Registerkarte Verarbeitung Positionen in separate Dateien, dann Maximum Intensity Projection aufgeteilt. Schließlich, als TIFF exportieren (Datei: Export, in höherer Auflösung Bildfenster - Serie).
- Verwenden FIJI 7,8 aufeinanderfolgenden Bildern, indem Sie das bUnwarpJ macro 9 (Plugins: Registrierung: bUnwarpJ) auszurichten. Ändern Registration Mode auf Mono. Alle Erweiterte Optionen können Standardwerte. Für lange Zeitspanne, laden und installieren Sie das Makro "Affine + Konsequente Elastic 2D Image Registration", das wird bUnwarpJ zu einer Reihe von Bildern automatisch anzuwenden, und öffnen Sie yunsere Daten über Datei: Import: Image Sequence, es zu benutzen. Deaktivieren MOPS Sehenswürdigkeiten Extraktion und Lauf.
- Verwenden FIJI / ImageJ oder Quicktime Pro, um die Reihenfolge der ausgerichteten Bilder öffnen und speichern in das gewünschte Videoformat (AVI ist eine gute Wahl).
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Representative Results
Ein Satz von informativen Zeitpunkten mit diesem Verfahren gesammelt wird in 3 gezeigt. Zellmembranen mit RFP (pm-rb) und GFP ist POLAR Protein unter seinem nativen Promotor fusioniert (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Auf der 30-Minuten-Zeitskala markiert sind, sehen wir Zellteilungen zusammen mit den Veränderungen in der Protein-Lokalisierung vor ihnen. Asymmetrische Zellteilungen in der Stomata Abstammungslinie Form Stammzell-Vorstufen wie Stomata genannt meristemoids, die die Fähigkeit zur weiteren asymmetrischen Bereiche durchlaufen zu behalten, und die Schwester Zellen, genannt Stomata Abstammungslinie Boden Zellen (SLGCs). SLGCs nehmen keine Stomata Vorstufe Schicksal, sie häufig in Zellen transdifferenzieren Pflaster, sondern kann asymmetrischen Teilung Fähigkeit wieder eine andere meristemoid weg von der ersten beabstandet, wie das Blatt expandiert erzeugen. All diese Schicksale sind in der Expression und Lokalisation von POLAR :: POLAR-GFP (Abb. 3, Video 1) wider.
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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Stomata Entwicklung. Protodermal Zellen geben Sie die Stomata Linie als meristemoid Mutter-Zellen (MMC) in einem Schritt von den basischen Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktoren SPEECHLESS (SPCH), SCREAM (SCRM) und SCRM2 gesteuert. MMCs unterteilen asymmetrisch um eine meristemoid (M) und Boden Stomata Abstammungslinie Zelle (SLGC) zu erzeugen; dieser Schritt kann mehrfach auftreten und stellt ein Mechanismus, durch den Spaltöffnungen voneinander beabstandet sind. Das Zell-Zustandsübergang des meristemoid der Wache Mutterzelle (GMC) Identität wird speziell von der bHLH MUTE sowie SCRM / 2 gerichtet. Eine endgültige symmetrischen Teilung der GMC und ihre Differenzierung in zwei reife Schließzellen (GC) erfordert die bHLH FAMA mit SCRM / 2 10.ig1large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Diagramm von Saatgut Dissektion und Montageverfahren. Samen werden sterilisiert und bei 4 ° C gehalten, montiert die Samenschalen und Hypokotyle entfernt, und die Keimblätter unter Agar-Medien in einer Kammer Schieber zum Abbilden auf einem invertierten Konfokalmikroskop.
Abbildung 3. Zeitraffer-Bildgebung zeigt POLAR :: POLAR-GFP distalen Lokalisation vor asymmetrische Zellteilung. Serie A: POLAR-GFP erscheint zunächst gleichmäßig verteilt, dann etwa zwei Stunden vor asymmetric Divisionen (Pfeilspitzen) POLAR-GFP trennt sich von der Website des beginnenden meristemoid. Serie B: Nach der ersten asymmetrischen Teilung (Pfeilspitze), verschwindet POLAR-GFP in beiden Zellen, was bedeutet, raschen Übergang zur Mutterzelle (GMC), der durch die meristemoid bewachen. Die GMC (Sternchen) teilt symmetrisch und differenziert, um Stomata Schließzellen bilden, während die Schwester Zelle gewinnt POLAR-GFP-Expression, vermutlich Vorboten einer späteren asymmetrische Teilung.
Video 1. Schlanke, registrierte Video von POLAR :: POLAR-GFP Lokalisation während der Amplifikation und den Abstand ein stomatal Vorläuferzelle. Zunächst erscheint POLAR-GFP gleichmäßig in der Zelle; um 39 h nach der Keimung, es polarisiert stark, kurz vor einer Aufteilung (40.0h) Platzieren einer kleineren meristemoid am entgegengesetzten Ende der Zelle. Die größere Zelle rechts auch gewinnt stomatal Linie Identität und um 45 hr POLAR-GFP Lokalisierung bewegt neben der Stomata Vorstufe. Die Aufteilung auf 47 h entsteht eine neue meristemoid (rechts) abgewandten bestehenden meristemoid (links) von der ersten. Das Endergebnis ist, zwei Spaltöffnungen um eine Zelle getrennt. (Bilder fehlen aus dem Video wurden nicht erhoben und stellen keine wesentlichen Änderungen.) Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
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Discussion
Diese Zeitraffer-konfokalen Technik erlaubt Längsschnittstudien von fluoreszierend markierte Protein Expression und Lokalisierung in einzelnen Zellen der Arabidopsis Cotyledone Epidermis, die im Fall von polaren und andere dynamisch ändernden Proteinen ist entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion. Zuvor hat anhaltende Zeitspanne Bildgebung verwendet worden, um Arabidopsis root Pilzinfektion 11 und Meristem Wachstum 5,12 untersuchen, sondern indem die cotyledon Epidermis erweitert die Vielseitigkeit dieser Technik und ermöglicht den Einsatz für zusätzliche Proteine, insbesondere die Unterstützung der wachsenden Bereich der Stomata Entwicklung .
Das Protokoll der wichtigste Einschränkung ist, dass es derzeit auf Keimblätter, die die Nährstoffe, die sie benötigen für die frühe Entwicklung enthalten beschränkt. Ferner ist Cotyledone Entwicklung nicht unbedingt identisch mit dem in Luft unterzogen, da die Gelmedium einschränkt Gasaustausch. Scanning laser Belichtung und Raumbeleuchtung für Photomorphogenese angemessen, induzieren cotyledon Expansion und Chloroplasten Reifung, aber Spaltöffnungen können gelegentlich in benachbarten Paaren aufgrund niedriger CO 2-Konzentration zu entwickeln. Diese Tendenz kann durch Verwendung nur eine dünne Schicht von Medien und minimale Montagezeit Wasser wie in diesem Protokoll gerichteten reduziert werden.
Fluorophor Auswahl ist auch für den Erfolg dieser Technik wichtig. Beide GFP und RFP Arbeit gut, und ermöglichen doppelte Kennzeichnung der Zellperipherie visualisieren oder zu beurteilen Protein Co-Lokalisierung. Benutzerdefinierte Filter erheblich reduziert Autofluoreszenz und ermöglichen empfindliche Detektion von fluoreszierenden Protein-Tags, auch wenn Chlorophyll vorhanden ist. Allerdings ist auch gefiltert CFP Autofluoreszenz in keimenden Keimblätter stark genug, um die Sichtbarkeit von fast allen Signal mit dem LSM700 auszuschließen. Bei Geräten mit einer Entmischung Fähigkeit kann eine breitere Auswahl von Fluorophoren machbar sein.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Amanda Rychel für die Unterstützung bei der Entwicklung der Zeitraffer-Protokoll und Lynn Pillitteri für den Bau von POLAR :: POLAR-eGFP. Wir sind auch dankbar ABRC für die Bereitstellung der pm-rb konstruieren. Dieses Protokoll wurde durch eine Unterstützung aus dem PRESTO Auszeichnung von Japan Science Technology and Agency entwickelt. Forschung POLAR wurde auch von der University of Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) und der National Science Foundation (MCB-0855659) unterstützt. KMP ist ein NSF Graduate Research Fellow (DGE-0.718.124) und KUT ist ein HHMI-GBMF Ermittler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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