Summary
Descriviamo un protocollo mediante diapositive da camera e media per immobilizzare cotiledoni di impianto per l'imaging confocale dell'epidermide più giorni di sviluppo, documentazione differenziazione stomatica. Proteine fluoroforo-tag possono essere monitorati in modo dinamico attraverso l'espressione e la localizzazione subcellulare, aumentare la comprensione dei ruoli possibili durante la divisione cellulare e la differenziazione delle cellule-tipo.
Abstract
Imaging nella dinamica in vivo del comportamento cellulare durante una sequenza di sviluppo può essere una potente tecnica per capire la meccanica del patterning tessuto. Durante lo sviluppo degli animali, la proliferazione cellulare e gli eventi chiave di patterning avvenire molto rapidamente. Per esempio, in Caenorhabditis elegans tutte le divisioni cellulari necessarie per il piano di corpo larvale vengono completate entro sei ore dopo la fecondazione, con sette cicli mitotici 1; le mitosi sedici o più di embriogenesi Drosophila si verificano in meno di 24 ore 2. In contrasto, le divisioni cellulari durante lo sviluppo della pianta sono lenti, tipicamente dell'ordine di un giorno 3,4,5. Questo impone una sfida unica e la necessità di lungo termine di imaging in tempo reale per documentare comportamenti dinamici di divisione cellulare e di eventi di differenziazione durante l'organogenesi pianta. Epidermide Arabidopsis è un sistema eccellente modello per la segnalazione inquirenti, il destino della cellula, e lo sviluppo delle piante. Nel cotiledone, questo tessuto è composto da aria e ad acqua cellule resistenti pavimentazione intervallati da stomi uniformemente distribuito, valvole che si aprono e chiudono per controllare lo scambio di gas e la perdita di acqua. Spaziatura corretta di questi stomi è fondamentale per la loro funzione, e il loro sviluppo segue una sequenza di divisione asimmetrica e gradini di differenziazione cellulare per produrre l'epidermide organizzata (Fig. 1).
Questo protocollo permette l'osservazione di cellule e proteine nell'epidermide più giorni di sviluppo. Questo lasso di tempo permette una precisa documentazione di cellule staminali divisioni e differenziazione delle cellule epidermiche, tra cui stomi e le cellule epidermiche pavimentazione. Proteine fluorescenti possono essere fusi a proteine di interesse per valutare la dinamica durante la divisione cellulare e processi di differenziazione. Questa tecnica permette di comprendere la localizzazione di una nuova proteina, POLAR 6, durante la fase di proliferazione di cellule di lignaggio stomatica-in the cotiledone epidermide Arabidopsis, in cui è espresso in cellule precedenti eventi divisione asimmetrica e si muove a una caratteristica zona della corteccia cella poco prima della divisione si verifica. Le immagini possono essere registrate e video razionalizzato facilmente realizzato utilizzando il software di pubblico dominio per visualizzare la localizzazione dinamica delle proteine e tipi di cellule che cambiano nel corso del tempo.
Protocol
1. Seed Sterilizzazione
- Preparare soluzione di sterilizzazione delle sementi: candeggina per uso domestico al 33%, 0.1% Triton X-100.
- Semi place trasportano desiderato costrutto fluorescente reporter (s) e genotipo (s) in 1.7 ml e applicare 1 ml di soluzione di sterilizzazione. Incubare il nutator per 15 min.
- In una cappa sterile, utilizzare una pipetta per rimuovere la soluzione di sterilizzazione da tubo, lasciando dietro di semi. Lavare con 1 ml di acqua sterile. Ripetere quattro volte.
- Incubare a 4 ° C per due o più giorni.
2. Preparazione di Slide media Camera
- Mescolare 20 ml di soluzione 0,5% di Agar Bacto (non puro agarosio) in acqua in un pallone da 200 ml, e microonde fino a dissoluzione. Prestare attenzione durante l 'ebollizione della soluzione.
- Raffreddare la soluzione a circa 60 ° C.
- Raccogliere 1 ml di soluzione di agar con una pipetta e lentamente si applicano al vetro di copertura all'interno della scatola di controllo (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Sistema vetrino tedesco). Soluzione which è troppo caldo o applicato troppo velocemente, potrebbe fondersi colla o vetro crack.
- Immediatamente aggiungere un secondo ml di soluzione di agar. Agar dovrebbe coprire completamente il fondo della camera di scorrimento. Questo supporto minimo è sufficiente a sostenere lo sviluppo di un impianto di cotiledone, che contiene sostanze nutritive immagazzinate, per quattro o cinque giorni, mantenendo l'umidità e permettendo la diffusione del gas.
- Diapositiva Cool di banco con camera coperto. Se il pallone è coperto ermeticamente, soluzione può essere salvata e riscaldato per un uso futuro.
3. Seed Dissection
- Rimuovere il tubo di sementi sterili da 4 ° C di stoccaggio.
- Mettere un fazzoletto di carta sul palco di un microscopio da dissezione e bagnare con acqua. Regolare tessuto per creare una superficie liscia. Tessuto viene utilizzato per stabilizzare semi per dissezione.
- Pipettare 20-30 semi dal tubo al tessuto, avendo cura di disporli in campo di applicazione dissezione di vista.
- Utilizzando pinze taglienti (Roboz, # 5 punta biologia), Rimuovere con cautela il cappotto di seme dall'interno piantina. Sia tegumenti esterni e interni devono essere rimossi.
- Quando l'imaging del cotiledone, è utile per rimuovere l'ipocotilo e radichetta. Cotiledoni contengono sostanze nutrienti sufficienti per sviluppare per diversi giorni ai sensi del presente protocollo. Se intatta, l'ipocotilo si raddrizzano e allungare notevolmente, spostando il cotiledone fuori del campo di vista time lapse. Utilizzare un bisturi per tagliare i cotiledoni liberi dell'ipocotilo.
- Tenere cotiledoni sezionati immersi in acqua, in un microtubo o simili.
- Ripetere 3,4-3,6 finché il numero desiderato di cotiledoni è raggiunto. 15-20 dissezioni di successo si raccomanda prima del montaggio.
4. Cotiledoni di montaggio nella diapositiva Camera
- Utilizzando un piccolo (18 mm 2) coprioggetto, tagliare i media agar e sollevare l'intero livello fino dalla base in vetro della diapositiva Camera.
- Pipettare sezionato cotiledoni con un minimo di acqua in possesso ditubo nella scatola di controllo, sotto lo strato di agar sollevato.
- Abbassare delicatamente l'agar sui cotiledoni. Se l'acqua in eccesso è presente, distaccandosi con un fazzoletto di carta, facendo attenzione a non disturbare i cotiledoni. I campioni non dovrebbero più muoversi facilmente quando montaggio è completo.
- Posizionare il coperchio sul vetrino della camera e slide passaggio alla fase microscopio.
5. Time Lapse Imaging
- Impostare invertito microscopio confocale per l'immagine del fluoroforo desiderata (s). LSM700 parametri utilizzati: per la GFP, eccitazione a 488 nm e la raccolta con un filtro passa-banda a 440-530 nm, per la richiesta di offerta, eccitazione a 555 nm e la raccolta con un filtro passa-banda a 570-610 nm.
- Controllare i campioni montati per danni. Programmare le posizioni dei intatte, montato correttamente cotiledoni nel software microscopio. Nello Zen 2009: Focus su un cotiledone con obiettivo 20x e spostare obiettivo al centro della scatola di controllo. In modalità di acquisizione, cambiare lo zoom a 0,5 e taglia </ Em> di 48x48 pixel. Seleziona la casella Posizioni e panoramica immagine Scan ... pulsante sotto Posizioni, quindi aumentare il numero di piastrelle orizzontale e verticale a 30-35. Quando la scansione è completata, fare clic sul pulsante Posizioni nella scheda Dimensioni e mirino posto in ogni cotiledone ad osservare.
- Impostare serie z che comprende l'epidermide cotiledone di tutti Zen samples.In 2009: Fare clic sulla casella di controllo Z-Stack. Selezionare ogni posizione sotto Lista Posizione e fare clic sul pulsante Sposta. Concentrarsi sul piano superiore dell'epidermide cotiledone e fare clic sul pulsante Prima Set in Z-Stack. Fuoco per la posizione più bassa in cui epidermide è utilmente visibile e fare clic sul pulsante Ultimo set. Fare clic sul pulsante accanto a ottimale, che mostra il miglior z-spessore di strato, per impostare. Controllare ogni cotiledone per confermare che le impostazioni comprendono tutti i campioni, i parametri z non può essere impostata per indivposizioni residuali in Zen 2009.
- Impostare serie temporali a risoluzione desiderata e la lunghezza. Intervalli di 15-30 minuti per tre giorni sono efficaci per la dinamica della proteina nella divisione delle cellule dell'epidermide. Questo intervallo può essere cambiata come necessario. Nello Zen 2009: Fare clic sulla casella di controllo di serie storica. In Time Series, impostare Cicli per il numero di immagini desiderate usando il cursore o digitando nel campo di testo. Imposta intervallo a 30 e utilizzare il menu a discesa per selezionare min.
- Inizia xyzt multi-posizione di scansione. Si noti che il numero di posizioni deve essere limitato dalle specifiche di scansione, se il tempo di scansione totale è maggiore dell'intervallo desiderato, i punti di tempo non sarà corretta. Un massimo di sei posizioni simultanee sono possibili quando l'imaging GFP e RFP a 59 z-fette in un intervallo di 30 minuti con il nostro sistema. Nello Zen 2009: Grandezza Passare alla risoluzione desiderata e fare clic su Avvia esperimento.
6. Video Editing
- Dal file confocale di dati, fare una intensità massima z-proiezione di ogni tempo / posizione di combinazione e di esportazione di file di immagine in un formato lossless come TIFF. I nomi dei file devono essere in una serie per la posizione (ad esempio, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, ecc, non POLAR-GFP_0001_pos1) per il software per combinarli in un film. Nello Zen 2009: Copia Usa: Sottoinsieme nella scheda di elaborazione per dividere le posizioni in file separati, quindi di proiezione massima intensità. Infine, l'esportazione in formato TIFF (File: Export, Full finestra immagine risoluzione - serie).
- Utilizzare FIJI 7,8 per allineare le immagini successive eseguendo la macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Registrazione: bUnwarpJ). Modifica della modalità di registrazione su Mono. Tutte le Opzioni avanzate è possibile utilizzare i valori predefiniti. Per le lunghe sequenze time lapse, scaricare e installare la macro "Affine + Coerentemente registrazione elastica Immagine 2D", che si applicherà bUnwarpJ ad una serie di immagini automaticamente, e aperto yi nostri dati utilizzando File: Import: Image Sequence di usarlo. Deselezionare MOPS estrazione punti di riferimento e di esecuzione.
- Utilizzare FIJI / ImageJ o Quicktime Pro per aprire la sequenza di immagini allineate e salvare nel formato video desiderato (AVI è una buona scelta).
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Representative Results
Una serie di punti temporali informativi raccolti con questo metodo è illustrato nella figura 3. Le membrane cellulari sono etichettati con RFP (pm-rb) e GFP è fusa alla proteina POLAR sotto il suo promotore nativo (POLAR :: POLAR-GFP) 6 A 30 minuti scala di tempo, vediamo divisioni cellulari con i cambiamenti nella localizzazione delle proteine precedute. Divisioni cellulari asimmetriche nella forma lignaggio degli stomi delle cellule staminali-come precursori chiamati stomi meristemoids, che mantengono la capacità di subire ulteriori divisioni asimmetriche, e le loro cellule sorelle, chiamati cellule stomatiche terra lineage (SLGCs). SLGCs non assumere un destino stomatica precursore, ma spesso transdifferenziarsi in cellule pavimentazione, ma può riprendere la capacità asimmetrica divisione per la produzione di un altro meristemoid distanziata dalla prima come la foglia si espande. Tutti questi destini si riflettono l'espressione e la localizzazione di POLAR :: POLAR-GFP (Fig. 3, Video 1).
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Figura 1. Schema di sviluppo stomatica. Cellule Protodermal inserire il lignaggio stomatica come cellule madri meristemoid (MMC) in una fase controllata dai fondamentali elica-ansa-elica fattori di trascrizione SPEECHLESS (SPCH), SCREAM (SCRM), e SCRM2. MMC divide asimmetricamente per produrre un meristemoid (M) e stomatico cella terra lineage (SLGC), questo passo può verificarsi più volte e fornisce un meccanismo mediante il quale stomi sono distanziate. La cellula-stato di transizione della meristemoid alla cellula madre guardia (GMC) identità è diretto specificamente dal bHLH MUTE nonché SCRM / 2. Una divisione finale simmetrica della GMC e la sua differenziazione in due cellule di guardia maturi (GC) richiede la FAMA bHLH con SCRM / 2 10.ig1large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. Schema di dissezione sementi e la procedura di montaggio. Semi vengono sterilizzati e mantenuti a 4 ° C, i tegumenti e ipocotili rimossi, ed i cotiledoni montato sotto agar in una camera di scorrimento per l'imaging su un microscopio invertito confocale.
Figura 3. Time-lapse imaging dimostra :: POLAR POLAR-GFP localizzazione distale che precede la divisione cellulare asimmetrica. Serie A: POLAR-GFP appare inizialmente distribuito uniformemente, quindi circa due ore prima di asimmetriedivisioni triche (punte di freccia) POLAR-GFP segrega di distanza dal sito del meristemoid incipiente. Serie B: Dopo l'iniziale divisione asimmetrica (punta di freccia), POLAR-GFP scompare in entrambe le cellule, il che implica una rapida transizione a guardia cellula madre (GMC) stato da parte del meristemoid. Il GMC (asterisco) divide simmetricamente e si differenzia per formare cellule di guardia degli stomi, mentre la cella sorella riacquista POLAR-GFP espressione, presumibilmente presagire una divisione asimmetrica tardi.
Video 1. Semplificata, il video registrato di POLAR :: POLAR-GFP localizzazione durante l'amplificazione e la spaziatura di una cellula precursore stomatica. Inizialmente, POLAR-GFP appare uniformemente nella cella; da 39 ore dopo la germinazione, polarizza fortemente, appena prima di una divisione (40.0h) mettere un meristemoid piccola all'estremità opposta della cella. La cella più a destra recupera anche identità stomatica lignaggio, e del 45 hr POLAR-GFP localizzazione muove adiacente al precursore stomatica. La divisione in 47 ore produce un nuovo meristemoid (destra) orientata dalla meristemoid esistente (sinistra) dalla prima. Il risultato finale è due stomi separati da una cella. (Le immagini mancanti dal video non sono stati raccolti e non rappresentano variazioni significative.) Clicca qui per visualizzare filmati .
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Discussion
Questo time-lapse tecnica confocale per studi longitudinali di espressione della proteina fluorescente tag e localizzazione in singole cellule dell'epidermide cotiledone Arabidopsis, che nel caso delle proteine che cambiano dinamicamente POLARI e gli altri è fondamentale per una corretta comprensione della loro funzione. Precedentemente, sostenuta immagini time lapse è stato utilizzato per esaminare infezione fungina Arabidopsis radice 11 e crescita meristema 5,12, ma aggiungendo l'epidermide cotiledone espande la versatilità di questa tecnica e permette il suo utilizzo per proteine addizionali, in particolare assistere il campo espansione dello sviluppo stomatica .
Il protocollo principale limitazione è che è attualmente limitato ad cotiledoni, che contengono le sostanze nutritive di cui hanno bisogno per lo sviluppo precoce. Inoltre, lo sviluppo cotiledone non è esattamente identica a quella subita in aria perché il mezzo gel limita lo scambio di gas. Scansione laesposizione ser e luci della stanza sono adeguate per fotomorfogenesi, inducendo l'espansione cotiledone e maturazione dei cloroplasti, ma stomi Talvolta si possono verificare a coppie adiacenti a causa della bassa concentrazione di CO 2. Questa tendenza può essere ridotto utilizzando solo un sottile strato di media e minima di acqua di montaggio come indicato in questo protocollo.
Selezione fluoroforo è importante anche per il successo con questa tecnica. Sia la GFP e RFP funzionano bene, e consentire doppia etichettatura per visualizzare la periferia cellulare o valutare la proteina co-localizzazione. I filtri personalizzati ridurre notevolmente autofluorescenza che consentono di individuare sensibile di tag proteine fluorescenti, anche quando la clorofilla è presente. Tuttavia, anche autofluorescenza CFP filtrato in cotiledoni germinazione è abbastanza forte da impedire la visibilità di quasi tutti i segnali utilizzando il LSM700. Per gli strumenti con una capacità unmixing spettrale, una più ampia selezione di fluorofori può essere fattibile.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Amanda Rychel per l'assistenza allo sviluppo del time lapse protocollo e Lynn Pillitteri per la costruzione :: POLAR POLAR-eGFP. Siamo anche grati a ABRC per la prestazione del pm-rb costruire. Questo protocollo è stato sviluppato attraverso un sostegno da parte del PRESTO premio da Giappone Scienza e Tecnologia Agenzia. La ricerca sulle POLAR è stata sostenuta anche dalla University of Washington Libera Research Fund (RRF-4098) e la National Science Foundation (MCB-0855659). KMP è un NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), ed è un KUT HHMI-GBMF investigatore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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