Summary
Vi beskriver ett protokoll med kammare diabilder och media för att immobilisera växt hjärtblad för konfokal avbildning av epidermis under flera dagar av utveckling, dokumentera stomata differentiering. Fluorofor-märkta proteiner kan spåras dynamiskt genom uttryck och subcellulär lokalisering, öka förståelsen för deras möjliga roller under celldelning och cell-typ differentiering.
Abstract
Imaging in vivo dynamik cellulär beteende under en utvecklings sekvens kan vara en kraftfull teknik för att förstå mekaniken i vävnad mönstring. Under djur utveckling, nyckel cellproliferation och evenemang mönstring sker mycket snabbt. Till exempel i Caenorhabditis elegans alla celldelningar som krävs för larver kroppen planen slutförs inom sex timmar efter befruktningen, med sju mitotiska cykler 1, de sexton eller mer mitoser av Drosophila embryogenes förekommer hos färre än 24 tim 2. Däremot celldelningar under anläggningens utveckling är långsam, typiskt i storleksordningen av en dag 3,4,5. Detta innebär en unik utmaning och behov av långsiktig realtidsundersökningen för att dokumentera dynamiska beteenden celldelning och evenemang differentiering under växt organogenesen. Arabidopsis epidermis är ett utmärkt modellsystem för att utreda signalering, cell öde och utveckling hos växter. I grobladen består denna vävnad av luft-och vatten-resistenta trottoar celler varvat med jämnt fördelad klyvöppningar, ventiler som öppnar och stänger för att kontrollera gasutbyte och vatten förlust. Korrekt avstånd av dessa klyvöppningar är avgörande för deras funktion och deras utveckling följer en sekvens av asymmetrisk delning och celler steg differentiering för att producera den organiserade epidermis (bild 1).
Detta protokoll tillåter observation av celler och proteiner i epidermis under flera dagar av utveckling. Denna tidsram möjliggör exakt dokumentation av stamceller divisioner och differentiering av epidermala celler, inklusive klyvöppningar och epidermalceller trottoar. Fluorescerande proteiner kan fusioneras till proteiner av intresse för att bedöma deras dynamik under celldelning och differentieringsprocesser. Denna teknik gör det möjligt för oss att förstå lokalisering av ett nytt protein, POLAR 6, under spridningen skede av stomatal-härstamning cellerna i the Arabidopsis kotyledon epidermis, där det uttrycks i celler som föregår asymmetriska division händelser och flyttar till en karakteristisk del av cellens cortex strax före division inträffar. Bilder kan registreras och strömlinjeformad video enkelt produceras med allmänt tillgänglig programvara för att visualisera dynamiska protein lokalisering och celltyper som de förändras över tiden.
Protocol
1. Seed Sterilisering
- Bered sterilisering utsäde: 33% hushållsblekmedel, 0,1% Triton X-100.
- Placera frön bär önskad fluorescerande reporter konstrukt (er) och genotyp (er) i 1,7 ml rör och tillämpa 1 ml sterilisering lösning. Inkubera på nutator under 15 min.
- I en steril huva, använd en pipett för att ta bort sterilisering lösning från tuben och lämnar frön bakom. Skölj med 1 ml sterilt vatten. Upprepa fyra gånger.
- Inkubera vid 4 ° C under två dagar eller mer.
2. Beredning av avdelningen Slide Media
- Blanda 20 ml av 0,5% lösning av Bacto Agar (ej ren agaros) i vatten i en 200 ml kolv, och mikrovågsugn till upplösning. Var försiktig när du kokar lösningen.
- Kyl lösningen till ca 60 ° C.
- Samla 1 ml agar lösning med en pipett och långsamt gälla täckglaset i kammaren bilden (Lab-Tek II Chambered # 1,5 tyska täckglas System). Lösning which är för varm eller appliceras för snabbt kan smälta lim eller spricka glas.
- Omedelbart lägga till en andra ml agar-lösning. Agarmedier bör nu helt täcker botten av sliden kammaren. Denna minimala media är tillräckligt för att stödja utvecklingen i en anläggning kotyledon, som innehåller lagrade näringsämnen, för 4-5 dagar genom att upprätthålla fukt och tillåter gasdiffusion.
- Cool bild på bänkskiva med kammare täckt. Om kolven är täckt tätt kan lösningen sparas och värmas för framtida bruk.
3. Seed Dissektion
- Avlägsna rör av sterilt utsäde från 4 ° C lagring.
- Placera en pappersnäsduk på scenen av ett dissektionsmikroskop och fukta med vatten. Justera vävnad för att skapa en slät yta. Vävnad används för att stabilisera frön för dissekering.
- Pipettera 20-30 frön från röret till vävnaden, var noga med att placera dem i dissekera omfattning synfält.
- Använda vassa pincett (Roboz, # 5 biologi spets)Försiktigt bort fröskalet från plantan inuti. Både yttre och inre integuments måste avlägsnas.
- När avbildning av kotyledonet, är det fördelaktigt att avlägsna hypokotyl och rotanlaget. Hjärtbladen innehåller tillräckligt med näringsämnen för att utveckla i flera dagar enligt detta protokoll. Om intakt kommer hypokotyl räta och förlänga dramatiskt, flyttar hjärtbladsnod ur tidsförloppet synfält. Använd en skalpell för att skära hjärtbladen fria från hypokotyl.
- Håll dissekerade kotyledoner nedsänkta i vatten, i ett mikrorör eller liknande.
- Upprepa 3,4-3,6 tills önskat antal hjärtbladen uppnås. 15-20 framgångsrika dissektioner rekommenderas före montering.
4. Montering kotyledoner i kammaren Slide
- Använd en liten (18 mm 2) täckglas, skär genom agarmedier och lyft hela lagret upp från kammaren bilden är glas bas.
- Pipettera dissekerade kotyledoner med ett minimum av vatten från att hållaröret i kammaren bilden, under upplyft agarlagret.
- Försiktigt sänka ägarn på hjärtbladen. Om överflödigt vatten är närvarande, blöta bort med en servett, försiktigt så att inte störa hjärtbladen. Prover skall inte längre gå lätt när fästet är klar.
- Placera locket på kammaren bild och flytta bilden till mikroskop skede.
5. Time Lapse Imaging
- Ställ in inverterat konfokalmikroskop till bild önskat fluoroforen (er). LSM700 använda parametrar: för GFP, excitation vid 488 nm och insamling med ett bandpassfilter vid 440-530 nm, för RFP, excitation vid 555 nm och insamling med ett bandpassfilter vid 570-610 nm.
- Kontrollera monterade prover för skador. Programmera de platser intakt, korrekt monterad hjärtbladen i mikroskop programvara. I Zen 2009: Fokus på ett kotyledon med 20x objektiv och flytta målet till mitten av kammarens bild. Enligt Förvärv läge, ändra Zooma till 0,5 och byggstorlek </ Em> till 48x48 pixlar. Markera Positioner kryssrutan och Scan översikt bild ... knappen under positioner, sedan öka Horisontella och vertikala kakel nummer till 30-35. När skanningen är klar klickar du på positioner knappen under fliken Dimensioner och hårkors plats vid varje kotyledon att observera.
- Ställ in Z-serien som omfattar hjärtbladsnod epidermis av alla samples.In Zen 2009: Klicka på Z-Stack kryssrutan. Välj varje position i Position och klicka på Flytta till knappen. Fokus på det översta plan kotyledon epidermis och klicka på Set Första knappen under Z-Stack. Fokus på den lägsta positionen där epidermis är användbart synlig och klicka på Ställ in sista knappen. Klicka på knappen bredvid Optimal, som visar den bästa z-snittjocklek, att ställa in. Kontrollera varje kotyledon att bekräfta att inställningarna omfattar alla prover, z parametrar kan inte ställas in för INDIVidual positioner i Zen 2009.
- Ställ in tidsserier på önskad upplösning och längd. Intervall 15-30 minuter i tre dagar är effektiva för protein dynamik i epidermal celldelning. Detta intervall kan ändras vid behov. I Zen 2009: Markera kryssrutan tidsserier. Enligt Time Series, ställ Cykler för antalet bilder som önskas med hjälp av skjutreglaget eller skriva i textfältet. Inställt intervall till 30 och använd rullgardinsmenyn för att välja min.
- Börja xyzt flera positioner scan. Observera att antalet positioner skall begränsas av de specifikationer för skanning, om den totala söktiden är större än den önskade intervall kommer tidpunkter inte vara korrekt. Maximalt sex samtidiga positioner är möjliga när avbildning GFP och RFP vid 59 z-skivor i en 30-minuters intervall med vårt system. I Zen 2009: ändringar Storlek till önskad upplösning och klicka på Start Experiment.
6. Videoredigering
- Från konfokala datafilen, göra en maximal intensitet z-projektion av varje gång / läge kombination och export som bildfiler i ett förlustfritt format som TIFF. Filens namn ska vara med en serie per position (t.ex. POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002 etc, inte POLAR-GFP_0001_pos1) för programvara för att kombinera dem till en film. I Zen 2009: Använd Copy: Delmängd under fliken Bearbetning att dela positioner i separata filer, sedan maximal intensitet projektion. Slutligen, exportera som TIFF (Arkiv: Export, Högupplöst bild fönster - serien).
- Använd FIJI 7,8 anpassa successiva bilder genom att köra bUnwarpJ makro 9 (Plugins: Registrering: bUnwarpJ). Ändra Registrering läge till Mono. Alla Avancerade alternativ kan använda standardvärden. För långa sekvenser tid förfaller, hämta och installera makrot "Affine + Konsekvent Elastisk 2D-bild Registrering", som kommer att gälla bUnwarpJ till en serie bilder automatiskt och öppet yvåra data med hjälp av File: Import: Bildsekvens att använda den. Avmarkera MOPS landmärken utvinning och springa.
- Använd FIJI / ImageJ eller Quicktime Pro för att öppna sekvensen av inriktade bilder och spara i önskat videoformat (AVI är ett bra val).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En uppsättning informativa tidpunkter samlas med denna metod visas i figur 3. Cellmembran är märkta med RFP (pm-rb) och GFP är smält till POLAR proteinet under dess naturliga promotor (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Vid 30-min tidsskala ser vi celldelningar tillsammans med förändringar i protein lokalisering föregår dem. Asymmetriska celldelningar i stomata härstamning formuläret stamceller-liknande stomatal prekursorer kallas meristemoids, som bibehåller förmågan att genomgå ytterligare asymmetriska divisioner och deras celler syster, som kallas stomatal celler härstamning marken (SLGCs). SLGCs Förutsätt inte en stomata föregångare öde, de ofta transdifferentiate in trottoar celler, men kan återupptas asymmetrisk delning förmåga att producera en annan meristemoid avstånd från den första som bladet expanderar. Alla dessa öden återspeglas i uttrycket och lokalisering av POLAR :: POLAR-GFP (fig. 3, Video 1).
jove_content "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 1. Schematisk av stomata utveckling. Protodermal celler in i stomata härstamning som meristemoid mamma celler (MMC) i ett steg som styrs av de grundläggande helix-loop-helix transkriptionsfaktorer SPEECHLESS (SPCH), Scream (SCRM) och SCRM2. MMC dela asymmetriskt för att producera en meristemoid (M) och stomata härstamning jord-cell (SLGC), detta steg kan inträffa flera gånger och ger en mekanism genom vilken klyvöppningar är åtskilda. Cellen-state övergång meristemoid till vakten modercellen (GMC) identitet riktas specifikt av bHLH MUTE liksom SCRM / 2. En slutlig symmetrisk uppdelning av GMC och differentiering till två mogna vaktceller (GC) kräver bHLH FAMA med SCRM / 2 10.ig1large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.
Figur 2. Diagram över utsäde dissektion och monteringsproceduren. Frön steriliseras och hålls vid 4 ° C, monterade fröskalen och avlägsnade hypokotyler, samt kotyledonerna enligt agarmedium i en kammare bild för avbildning på ett inverterat konfokalt mikroskop.
Figur 3. Time-lapse avbildning visar POLAR :: POLAR-GFP distala lokalisering före asymmetrisk celldelning. Serie A: POLAR-GFP visas initialt jämnt fördelade, så ungefär två timmar innan asymmeTRIC divisioner (pilspetsar) POLAR-GFP avskiljer bort från platsen för den begynnande meristemoid. Serie B: Efter den inledande asymmetriska divisionen (pilspets), försvinner POLAR-GFP i båda cellerna, vilket innebär snabb övergång till vakta modercellen (GMC) tillstånd av meristemoid. GMC (asterisk) delar symmetriskt och differentierar till att bilda stomatal vakt celler, medan syster cellen återfår POLAR-GFP uttryck, förmodligen bådande en senare asymmetrisk delning.
Video 1. Strömlinjeformad, registrerade video POLAR :: POLAR-GFP lokalisering vid förstärkning och avstånd en stomata prekursorcell. Initialt verkar POLAR-GFP likformigt i cellen, med 39 h efter groning, det polariserar starkt, precis innan en division (40.0h) placera en mindre meristemoid vid den motsatta änden av cellen. Den större cell till höger återfår också stomatal härstamning identitet och med 45 timmar POLAR-GFP lokalisering flyttar intill stomata föregångare. Indelningen i 47 timmar ger en ny meristemoid (höger) orienterad bort från den befintliga meristemoid (till vänster) från den första. Slutresultatet är två klyvöppningar åtskilda av en cell. (Bilder saknas från videon inte samlades och representerar inte betydande förändringar.) Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna gång-lapse konfokal teknik gör longitudinella studier av fluorescerande taggade proteinuttryck och lokalisering i enskilda celler i Arabidopsis kotyledon epidermis, vilket i fallet med polär och andra dynamiskt föränderliga proteiner är avgörande för en riktig förståelse av deras funktion. Tidigare har ihållande tid lapse avbildning använts för att undersöka Arabidopsis rot svampinfektion 11 och meristem tillväxt 5,12, men lägga till hjärtbladsnod epidermis expanderar mångsidigheten av denna teknik och tillåter dess användning för ytterligare proteiner, särskilt bistå växande området stomata utveckling .
Protokollet främsta begränsning är att det för närvarande är begränsad till hjärtblad, som innehåller de näringsämnen de behöver för tidig utveckling. Vidare är hjärtbladsnod utveckling inte exakt identisk med den som genomgått i luft eftersom gelmediet begränsar gasutbyte. Scanning laSer exponering och ljus rum är tillräckliga för photomorphogenesis, förmå hjärtblad expansion och kloroplast mognad, men klyvöppningar kan ibland utvecklas i intilliggande par på grund av låg CO 2-koncentration. Denna tendens kan minskas genom att använda endast ett tunt lager av media och minimal montering vatten enligt anvisningarna i detta protokoll.
Fluorofor val är också viktigt för att lyckas med denna teknik. Både GFP och RFP fungerar bra, och låt dubbla märkning att visualisera celler periferi eller bedöma protein samlokalisering. Anpassade filter kraftigt minska autofluorescens och tillåta känslig detektion av fluorescerande protein taggar även när klorofyll är närvarande. Men även filtrerade GFP autofluorescens i groende hjärtbladen stark nog att hindra synlighet nästan alla signaler med hjälp av LSM700. För instrument med en spektral unmixing kapacitet kan ett bredare urval av fluoroforer vara möjligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Amanda Rychel för hjälp att utveckla den tid som förflutit protokollet och Lynn Pillitteri för att konstruera POLAR :: POLAR-EGFP. Vi är också tacksamma för ABRC för att tillhandahålla pm-rb konstruktion. Detta protokoll har utvecklats genom ett stöd från PRESTO utmärkelsen från Japan Science Technology och byrån. Forskning om POLAR stöddes också av University of Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) och National Science Foundation (MCB-0.855.659). KMP är ett NSF Graduate Research Fellow (DGE-0.718.124), och KUT är en HHMI-GBMF utredare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji (2008).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
