Summary
Anvendelse af luciferase og in vivo billeddannelse systemer (IVIS) som et hidtil ukendt middel til at identificere sygdomme endpoints før kliniske udvikling forekommer. IVIS har tilladt os at visualisere i realtid invasionen af encephalitiske vira over flere dage, hvilket giver en mere præcis sygdom model for fremtidige undersøgelser. Det har også givet os mulighed for at identificere de potentielle beskyttende egenskaber af antivirale lægemidler og vacciner hurtigere end aktuelt anvendte dyremodeller. Evnen til at udnytte de enkelte dyr over flere tidspunkter sikrer reducerede dyrenes behov, omkostninger og samlet sygelighed til dyrene udnyttede sikre en mere human og mere videnskabelig hjælp af sygdom undersøgelse.
Abstract
Moderne fremskridt i imaging-teknologi tilskynde til yderligere udvikling og finjustering i den måde viral forskning opnås. Oprindelig blev foreslået af Russel og Burch i Humes 3R (erstatning, begrænsning, forfining), udnyttelse af dyremodeller inden for videnskabelig forskning er under konstant pres for at finde nye metoder til at mindske dyrs forbrug og samtidig forbedre den videnskabelige nøjagtighed og hastighed. En stor udfordring for Humes skoleledere er imidlertid, hvordan man kan sikre undersøgelserne er statistisk præcis samtidig reducere dyresygdom sygelighed og samlede tal. Vaccineeffektivitet undersøgelser øjeblikket kræver et stort antal dyr for at blive betragtet som statistisk signifikant, og resulterer ofte i høj sygelighed og dødelighed endpoints til identifikation af immunbeskyttelse. Vi udnyttet in vivo imaging system (IVIS) i forbindelse med en ildflue bioluminescerende enzym til gradvis spore invasionen af centralnervesystemet (CNS) af en ningphalitic virus i en murin model. Typisk, som sygdommen skrider relativt langsomt, men virusreplikation er hurtig, især i CNS, og kan føre til en ofte dødelig udgang. Efter intranasal infektion af mus med TC83-Luc, modificeret en svækket venezuelansk hesteencefalitis-virus-stamme til udtrykker et luciferasegenet, er vi i stand til at visualisere virusreplikation i hjernen mindst tre dage før udviklingen af kliniske sygdomssymptomer. Udnytte CNS invasion som en central encephalitiske udvikling af sygdom endpoint er vi i stand til hurtigt at identificere terapeutiske og vaccine beskyttelse mod TC83-Luc infektion, før de kliniske symptomer. Med IVIS teknologi er vi i stand til at demonstrere en hurtig og præcis test af narkotika lægemidler og vacciner og samtidig reducere antallet af dyr og sygelighed.
Protocol
1. Animal Forberedelse
- Animal ankomst: Ved ankomsten til dyret biosikkerhed niveau 2 (ABSL2) faciliteter, dyr tillade minimum 2 dage til at akklimatisere sig til deres nye omgivelser. Efter denne hvileperiode, dyrene inspicere at vurdere deres helbred og generelle fysiske udseende.
- Når der anvendes fluorescerende reportere, er det vigtigt at placere alle animalske emner på en lucerne fri kost til at begrænse mængden af GI autofluorescens og baggrund signal.
- Shave dyr: At forbedre bioluminescerende signal detekteres fra den skallepartiet under billeddannelse, barbere hovedet på alle dyrene. Bedøve dyrene med en blanding af oxygengas og fordampes isofluran. Når dyrene er fuldt bedøvet, skal du bruge elektriske klippere til at barbere deres hoveder. Når du er færdig med barbering, tilbagesende dyrene til deres bure og observere for fuldstændig helbredelse fra virkningerne af anæstesi.
- Bio Medic dataSystemer (Berlingske) transponder insertion (finde sted efter barbering af musene, mens dyrene er fuldstændigt bedøvet): For et mindre invasive middel til at spore temperatur implantat et forprogrammeret Berlingske trådløs transponder subkutant i rygregionen på hver mus. Disse transpondere etablere trådløs identifikation og temperaturmåling. Efter implantation af transponderen, en veterinær-grade vævsklæbemiddel anvendelse til såret.
- Baseline samling: Før infektion, en baseline temperatur og vægt for alle dyr optage. Indsamle blod for plakreduktion neutralisationstest (PRNT) analyse ved retroorbital (RO) bløder medens musene er under anæstesi. Efter blodtapning, veterinær antibiotisk øjensalve gælder at reducere potentiel sekundær bakteriel infektion. Denne baseline samling skal udfyldes under hensyntagen til det antal gange, dyrene anbragt under anæstesi som følge af stress på musene. Fremtidige RO samlinger should afsluttes efter billeddannelse, mens musen er stadig under bedøvelse. Den maksimale blod opsamlet fra et RO bør være omkring 200 pi.
- Infektion: Place mus under anæstesi som beskrevet tidligere. Inokulere via den intranasale vej med en dosis på 5x10 6 til 5x10 7 pfu TC83-luciferase i et samlet volumen på 40 ul fortyndet med phosphatpufret saltopløsning (PBS) ved intranasal infektion. Efter infektion, musene sted inden for deres bolig bur og observere opsving.
2. Animal Imaging
Disclaimer: Hold mus i deres stald, om biosikkerhed kabinet (BSC), eller den XIC Opbevaringsæske på alle tidspunkter. De godkendte BSC'er for denne protokol er en klasse II Type B1 eller B2.
- Injicere alle dyr med 10 pi per gram legemsvægt af intraperitoneal (IP) luciferin i en koncentration på 15 mg / ml.
- Mus, der modtog Ampligen skal være injected IP ved en dosis på 12,5 mg / kg legemsvægt ved -4 timer efter infektion eller 48 timer efter infektion på basis af deres gruppe.
- Forud for injektion med luciferin, adskilles musene i grupper på tre for at sikre en korrekt pasning inden i XIC-3 Opbevaringsæske.
- For alle billeddannelse, anvender okulær salve / smøremiddel til at forhindre tørring af hornhinden under hele proceduren.
- Åbn LivingImage software og trykke Initialiser at forberede imaging boksen, sæt auto besparelse, eksponeringstid til auto (eksponeringstid på auto er en ny funktion i LivingImage software 3,2 og nyere), se felt til C og filter til at åbne; felt opfattelse er baseret på antallet af mus De er billeddannelse, og filter kan optimeres efter behov for andre billeddannende projekter.
- Bekræft, at luften kulfiltre ikke er udløbet, ilt tanken er fuld, og det isofluran reservoir er fyldt. Placer små strimler af isolerbånd i XIC-3 isolation boks, som hjælper med at reducere flytning af dyr under billedbehandling.
- Injicer mus med luciferin IP som beskrevet i afsnit 2,1 og sted inden for Isofluran induktion kammer (med åbent låg) i 3-5 min.
- Efter 5 minutter lukker låget af induktionskammer og starte strømmen af isofluran. Bedøvelsesmidlet drives ved omkring 3-5% med oxygen strømningshastighed indstilles til ca 2,0 L / min. Når fuldt bevidstløs vente yderligere 30 sek og overføre mus til XIC-3 isolation boks. Sørg for biosikkerhed kabinet udnyttes muliggør sikker latrintømning af isofluran som denne procedure vil indebære tab af isofluran fra induktion kammer (IVIS enhed indeholder sine egne Passive Fair dunke og den XIC-3 Opbevaringsæske direkte oprettes forbindelse til in / out stikkene at sikre indeholdt bedøvelsesmiddel flow).
- Overfør mus baseret på chip / gruppe nummeret i XIC-3 isolation boks med isofluran stik vedlagt end åbne. Placer mus, så de er fastlagt i brystleje med hoveder blidt hvilende på tapestrimler.
- Tør XIC Opbevaringsæske med ethanol, spray hænder og bunden af XIC-3 med cavicide, og overføre til IVIS imaging kammeret. Slut anæstesi til Opbevaringsæske gang inde i trykbilledenheden.
- Efter 10 minutter efter injektion af luciferin, image musene gennem den levende image software.
- Efter indledende billeddannelse med en åben filter, et DLIT 3-dimensionelle billeder ved hjælp af Sekvensanalyse og Image Wizard setup for bioluminescerende ildflueluciferase indlede. Denne billeddannende proces tager 4-5 min, og bør være afsluttet et synsfelt relevant for antallet af ønskede mus.
- Ex-vivo-analyse er mulig efter obduktion og opsamling af hjernen. Placer hjernen på en steril petriskål, dryp 50-100 ul lager luciferin på toppen, og sted inden for imaging box.
- Færdiggøre en anden åben filter billede ved 15-17 min efter infektion efter afslutningen af DLIT billeddannelse. Sørg sekvensanalyse er slukket, og synsfeltet og filter indstillingerne vender tilbage til tidligere indstillinger.
3. Retur Mus og Dataanalyse
- Sluk for isofluran fordamper og overføre XIC Opbevaringsæske tilbage til biosikkerhed kabinet.
- Placer mus tilbage i deres stald, lukke toppen, spray udvendigt med passende desinfektionsmiddel og sted tilbage på huset rack.
- Sørg for mus er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi.
- Gentag ovenstående procedure som kræver eksperimentet indtil billedbehandling er fuldført.
- Desinficér BSC, lukke udstyret, og overføre alle data til en ekstern laboratorium placering til yderligere analyse.
- Analysere dataene og generere 3-dimensionelle billeder på grundlag IVIS resultater utilizing af LivingImage software.
- Sørg for, at billedet er korrekt orienteret og belysning / farvebalance er indstillet. Inden for værktøjspalet indstillingerne omfatter Tilpas billede, Rettelser, Image Information, og ROI Tools.
- Udnyt ROI figurer til at identificere specifikke signalstyrker baseret på placering.
- Rekonstruere overfladetopografien at fremhæve musens krop, initialisere 3D DLIT rekonstruktion, og bruge lineær tilpasning til at indstille orgel kort til den topografiske genopbygning.
- Yderligere viral titrering analyse kan gennemføres gennem indsamling af blod og organer. Titrering i denne undersøgelse blev gennemført ved homogenisering af hjernevævet i Modified Eagles Medium (MEM). Homogenatet blev serielt fortyndet og vi inficeres en 6 brønds plade af Vero-celler i 1 time. Cellerne blev dækket med en 1,5% agarose/2xMEM overlay og inkuberet i 2 dage ved 37 grader. Celler blev fikseret med 10% formalin i 30 minutter og farvet medkrystalviolet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med et genetisk modificeret virus,, TC83-luciferase så vi en stigning i bioluminescerende signalstyrke som virusreplikation bevæger sig fra den nasale region i de centrale CNS (figur 1). På grund af den høje virusreplikation hastighed, forventer vi at se høje niveauer af bioluminescerende signal (figur 2A) er afhængige af vektoren og dyret immunrespons på vektoren. Vi forventer dette signal stigning til fortsat at en top, mellem dagene 5-7 efter infektion, i kombination med virusreplikation peak i CNS (figur 2B). Efter signalet og viral peak, forventer vi at se et fald i signal både på grund af et fald i viral replikation og skyldes et tab af den af luciferasegenet. Med disse signalværdier vi forventer at kunne kvantificere virusbelastningen baseret på styrken af signalet, hvilket giver en in vivo fremgangsmåde til nøjagtigt at beregne progressivt stigende virusbelastning i et enkelt dyr SPECIFIKT ic til TC83-Luciferase.
Anvendelse af denne model som et middel til at analysere vacciner og antivirale behandlinger, forventer vi at kunne påvise en forskel mellem effektive behandlinger baseret på en reduktion i bioluminescerende signal. I vores tilfælde, mod TC83-luciferase, kan vi anvende IP Ampligen (a Toll-like receptor 3 agonist) eller vaccination tre uger før infektion for at reducere viral infektion og bioluminescerende signal gennem hele forsøget (figur 3). Dette fald kan være direkte korreleret til et fald i virusmængden i CNS (data ikke vist). Som en måde at modne og visualisere teknologi er IVIS software LivingImage stand til at gøre 3-dimensionelle billeder af det bioluminescerende signal (figur 4), der giver os mulighed for nemt at identificere steder med høj virusreplikation baseret på vævsdybde og sammensætning.
/ 4429/4429fig1.jpg "alt =" Figur 1 "fo: indhold-bredde =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4429/4429fig1highres.jpg "/>
Figur 1. IVIS Imaging af TC83-luciferase Tre C57BL / 6 mus blev smittet ved intranasal udfordring med TC83-luciferase og afbildes ved 2, 4, 6 og 8 dage efter infektionen (dpi). Billeder blev foretaget efter IP luciferin injektion med en AE længde og åben filter. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Begge musestammer havde lignende bioluminescerende signalstyrke efter IP-injektion af luciferin med en forsinkelse på 10 minutter efter injektion, før billeddannelse blev afsluttet (A). Viral belastning i hjernen (pfu / gram væv) er tæt korreleret hele infektionen til biolumiescent signal (B).
Figur 3. Behandling Sammenligning Ved anvendelse IVIS. Behandling comarison efter TC83-Luciferase infektion i C3H/HeN mus. Mus immuniseret med subkutan TC83 23 dage før challenge med TC83-Luciferase præsenteres uden bioluminescerende signal (A). Mus, der modtog IP Ampligen ved -4 og 48 timer efter infektion (B) viste reducerede niveauer sammenlignet med mus, der modtog ingen behandling (C).
Figur 4. 3-dimensional rekonstruktion billeddannelse. Anvendelse af 3-dimensionel rekonstruktion vi visualiseret peak placering af TC83-Luciferase infektion udnytte LivingImage s DLIT genopbygning værktøj. Vi er i stand til at lokalisere dybden og placeringen af det primære signal i CNS under anvendelse af denne technique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om denne protokol dækker de billeddannende aspekter til in vivo analyse, er det vigtigt at erkende bioluminescerende vektor som en nøglefaktor for fremtidige undersøgelser. Vores anvendelse af TC83, en svækket vaccinestamme af VEEV, som en vektor til ekspression af luciferase sikrer, at store mængder af enzymet bliver produceret grund af den høje replikationshastighed af virusset i CNS som tidligere beskrevet 1-4. Mens tilsætning af en anden subgenomisk promotor og luciferasegenet resulterer i yderligere dæmpning af det rekombinante virus sammenlignet med vildtype TC83, går denne dæmpning ikke at ændre det kliniske forløb af sygdommen indenfor de første 6 dage af infektion 5. Vi forventer at se et tab af luciferasegenet ved replikation af viruset med tiden, men igen er dette ikke ses indtil senere i udviklingen af sygdommen. Udvikling af andre patogene vektorer, virale og bakterielle, bekræfter det store potentiale og effektivitetaf IVIS og luciferase tværs af flere områder af patogen forskning 6-9.
Den billeddannende proces selv har et par kritiske trin, der skal fuldføres, før en fuldstændig undersøgelse kan gennemføres. En første analyse af det bioluminescerende styrken af vektoren bør være afsluttet i en pilotundersøgelse med en minimal gruppe dyr. Den forventede placering in vivo af luciferase akkumulation skal være kendt på forhånd på grund af den anvendte vektor, men den forventede signalstyrke, bør bestemmes før indledning af en stor undersøgelse. Med den nye software en eksponering længde analyse er ikke så nødvendigt på grund af den automatiske eksponering afsløring funktion nu er indbygget i softwaren, men en tidsforsinkelse baseret på indsprøjtning af luciferin vil stadig nødvendigt at fastlægge. Selv med alle disse signal beregninger kan bioluminescerende detektion stadig begrænset på grund af vektor dybde og overordnet dyr pigment og pels. Vi anbefaler kraftigt at barbering af dyr before billeddannelse begynder at vinde det stærkeste signal muligt.
Selv tegner sig for vektor dæmpning og enzym produktion, vi tror, vi har udviklet en præcis og mere effektiv model udnytte luciferase så kunne genereres med en standard fluorescerende molekyle system for in vivo analyse. Bioluminescens er ikke begrænset ved at have en initierende lyskilde, som til at begynde skal passere gennem væv, hvilket resulterer i et tab af signal. Det kan heller ikke have de høje baggrund auto fluorescerende problemer set med mus på deres pels og endda fra deres kost. Risikoen for forgiftning af den luciferin underlaget er let kontrolleres gennem ordentlig filtrering og dosering, hvilket gør bioluminescerende lige så sikkert for dyret. Både fluorescerende og bioluminescerende systemer kan drastisk reducere dyreforsøg inden pga. in vivo analyse, som vil være vigtigt for den fremtidige forskning på grund af den ændrede politiske holdning til dyr forskning og yderligere tilslutning til Hume s 3R (erstatning, begrænsning, forfining) mod dyreforsøg 10.
For vores anvendelse af viral patogenese og antiviral effektanalyse, er in vivo modellering mere effektive end de nuværende systemer 11,12 for flere grunde. Vi er i stand til at påvise specifikke vigtigste trin i udvikling af sygdom, CNS invasion 1 i tilfælde af TC83, før nogen klinisk sygdom udvikler sig. Fra den indledende invasion detektion, er vi i stand til gentagne gange visualisere i et enkelt dyr spredning og replikation af virus, som en mere præcis studere sygdomsprogression 5. Den model, vi har designet er også sikrere for forskere på grund af nedsat kravet om opofrelse og orgel indsamling, muligheden for at opdage de vigtigste sygdomme progression point før klinisk sygdom kan føre til dyre irritabilitet, og særligt til vores system, kan vi færdiggøre disse undersøgelser i en attenueret virusvektor i ABSL2 stedet for ABSL3anvendelse af et udvalgt middel.
Fremtidige sygdom undersøgelser vil i stigende grad benytte bioluminescerende IVIS modellering. Fremskridt inden for moderne molekylærbiologiske teknikker og kloning tillade indsættelsen af en luciferasegenet hurtigt og billigt i både virale og bakterielle vektorer. Evnen til at udvikle transgene mus, der udtrykker en promotor afhængig luciferasegenet tilvejebringer også et andet system til bioluminescerende undersøgelse. Endelig nyudviklede bioluminescerende prober såsom skydelærer RediJect Inflammation probe reagerer med myeloperoxidase giver mulighed for in vivo-visualisering af fagocyt inflammation reaktion. Disse nye teknologier kombineret med den øgede effektivitet af de kameraer og software gør bioluminescerende IVIS et levedygtigt system for fremtidig forskning i mange forskellige fagområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Institut for Translationel Sciences UTMB-NIH tilskud 1UL1RR029876-01 og Alisha Prather for hendes hjælp med videoredigering for dette håndskrift.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
