Summary
Utnytte luciferase og in vivo avbildning systemer (IVIS) som en roman betyr å identifisere sykdom endepunkter før kliniske utviklingen skjer. IVIS har tillatt oss å visualisere i sanntid invasjonen av betennelsesskade virus over flere dager, og gir en mer nøyaktig sykdom modell for fremtidig studie. Det har også tillatt oss å identifisere potensielle beskyttende funksjonene antivirale og vaksiner raskere enn i dag utnyttet dyremodeller. Muligheten til å utnytte enkelte dyr over flere tidspunkter sikrer reduserte dyrenes krav, kostnader og generelle sykelighet til dyrene brukt sikre en mer human og mer vitenskapelig måte av sykdom studien.
Abstract
Moderne fremskritt i bildeteknologi oppmuntre til videre utvikling og forbedring i måten viral forskning er skjedd. Utgangspunktet foreslått av Russel og Burch i Hume 3R (erstatning, reduksjon, raffinement), er utnyttelsen av dyremodeller i vitenskapelig forskning under konstant press for å identifisere nye metoder for å redusere dyr bruk samtidig forbedre vitenskapelig nøyaktighet og hastighet. En stor utfordring for Hume oppdragsgivere er imidlertid hvordan man skal sikre at studiene er statistisk nøyaktig samtidig redusere dyresykdom sykelighet og generelle tall. Vaksineeffekt studier øyeblikket krever et stort antall dyr for å bli ansett som statistisk signifikant og ofte resultere i høy sykelighet og dødelighet endepunkter for identifisering av immun beskyttelse. Vi utnyttet in vivo avbildning systemer (IVIS) i forbindelse med en ildflue Bioluminescent enzymet til progressivt spore invasjonen av sentralnervesystemet (CNS) av en hetphalitic virus i en murin modell. Vanligvis, utvikler sykdommen relativt langsomt, men virusreplikasjon er hurtig, spesielt innenfor CNS, og kan føre til en ofte, dødelige utfall. Etter intranasal infeksjon i mus med TC83-Luc, en svekket Venezuelan equine encefalitt virus stamme endret uttrykker et luciferase genet, vi er i stand til å visualisere virusreplikasjon i hjernen minst tre dager før utviklingen av klinisk sykdom symptomer. Utnytte CNS invasjon som en viktig betennelsesskade sykdomsutvikling endepunkt vi er i stand til å raskt identifisere terapeutisk og vaksine beskytter mot TC83-Luc infeksjon før kliniske symptomer. Med IVIS teknologi er vi i stand til å demonstrere en rask og nøyaktig testing av narkotika legemiddelselskap og vaksiner samtidig redusere dyrenummer og sykelighet.
Protocol
1. Animal Forberedelse
- Animal ankomst: Ved ankomst til dyret biosikkerhet nivå 2 (ABSL2) fasiliteter, tillater dyr minimum 2 dager å venne seg til sitt nye miljø. Etter dette hvileperiode, inspisere dyrene å vurdere deres helse og generelle utseende.
- Ved bruk av fluorescerende reportere er det viktig å plassere alle forsøksdyr på en alfalfa gratis diett for å begrense mengden av GI autofluorescens og bakgrunn signal.
- Shave dyr: For å forbedre bioluminescent signalet oppdaget fra skallen under avbildning, barbere hodene av alle dyrene. Anesthetize dyrene med en blanding av oksygengass og fordampes isofluran. Når dyrene er fullt bedøvet, bruker elektriske klippemaskiner å barbere hodet. Når ferdig ved barbering, returnere dyrene til burene og observere for fullstendig gjenoppretting fra virkningene av anestesi.
- Bio Medic dataSystemer (BMDS) transponder innsetting (å skje etter barbering av musene mens dyrene er fullt bedøvd): for en mindre invasiv måte å spore temperatur implantat et forhåndsprogrammert BMDS trådløs transponder subkutant i dorsal regionen av hver mus. Disse transpondere mulighet for trådløs identifikasjon og temperatur opptak. Etter implantering av transponder, gjelder en veterinær-grade vev lim på såret.
- Baseline samling: Før infeksjon, spille inn en baseline temperatur og vekt for alle dyr. Samle blod for plakk reduksjon nøytralisasjonstest (PRNT) analyse gjennom retro-orbital (RO) blø mens musene er under anestesi. Etter blod samling, gjelder veterinær antibiotika øyesalve for å redusere potensiell sekundær bakteriell infeksjon. Dette baseline samlingen skal suppleres med hensyn til antall ganger dyrene plassert under anestesi på grunn av stress på mus. Fremtidige RO samlinger should gjennomføres etter bildebehandling, mens musen er fortsatt under bedøvelse. Maksimal blod oppsamlet fra en RO bør være rundt 200 pl.
- Infeksjon: Plass mus under anestesi som beskrevet tidligere. Inokuler gjennom den intranasale rute ved hjelp av en dose på 5x10 6 til 5x10 7 PFU TC83-Luciferase i et totalvolum på 40 pl fortynnet ved fosfatbufret saltvann (PBS) ved intranasal infeksjon. Etter infeksjon, plasserer musene innenfor sine boliger bur og observere utvinning.
2. Animal Imaging
Ansvarsfraskrivelse: Hold mus innenfor sine boliger enhet, biosafety kabinett (BSC), eller XIC containment boksen til enhver tid. De vedtatte BSCs for denne protokollen er en klasse II, type B1 eller B2.
- Injiser alle dyr med 10 ul pr gram kroppsvekt av intraperitoneal (IP) luciferin i en konsentrasjon på 15 mg / ml.
- Mus som fikk Ampligen er å være injected IP i en dose på 12,5 mg / kg kroppsvekt ved -4 hr etter infeksjon eller 48 hr etter infeksjon basert på sin gruppe.
- Før injeksjon med luciferin, skiller musene i grupper på tre for å sikre en riktig passform i XIC-3 containment boksen.
- For alle bildebehandling, utnytte okulær salve / smøremiddel for å hindre tørking av hornhinnen gjennom hele prosedyren.
- Åpne LivingImage programvare og deretter Initialiser å forberede bildebehandling boksen, angi automatisk lagring, eksponering tid til auto (eksponeringstid på auto er en ny funksjon i LivingImage programvare 3.2 og nyere), vise-feltet til C, og filter for å åpne; feltet synet er basert på antall av mus er du bildebehandling, og filteret kan optimaliseres etter behov for andre imaging prosjekter.
- Bekrefter at luften kullfilter ikke har utløpt, er oksygen tank full, og isofluran reservoaret er fylt. Plasser små strimler av elektrisk tape i XIC-3 isolation boks som bistår med å redusere dyr bevegelse under bildebehandling.
- Injisere mus med luciferin IP som beskrevet i avsnitt 2.1 og plass innenfor den isofluran induksjon kammer (med lokk åpnet) for 3-5 min.
- Etter 5 min, lukke lokket av induksjon kammeret og starte strømmen av isofluran. Bedøvelsen drives ved ca 3-5% med oksygen strømningshastighet sett på omtrent 2,0 l / min. Gang fullt bevisstløs vente ytterligere 30 sek og overføre musene til XIC-3 isolasjon boksen. Sørg for at biosafety kabinettet blir utnyttet tillater sikker scavenging av isofluran som denne prosedyre vil innebære tap av isofluran fra induksjon kammeret (den IVIS enheten inneholder egne Passive Fair beholdere og XIC-3 containment boksen direkte kobles til inn / ut-kontakter å sikre inneholdt bedøvelse flow).
- Overfør musene basert på chip / gruppe nummer i XIC-3 isolasjon boksen med isofluran kontakten festet end åpne. Plasser musene slik at de blir lagt ut i sternal recumbency med hoder forsiktig hviler på tapestripe.
- Tørk XIC containment boksen med etanol, spray hender og bunnen av XIC-3 med cavicide, og overføre til IVIS bildebehandling kammeret. Koble til anestesi til containment boksen en gang inne på bildeenheten.
- Etter 10 min etter injeksjonen av luciferin, bilde musene gjennom levende bilde programvaren.
- Etter innledende bildebehandling med en åpen filter, sette i gang en DLIT 3-dimensjonal avbildning ved hjelp av sekvens analyse og bilde Wizard oppsett for bioluminescent firefly luciferase. Dette imaging prosessen vil ta 4-5 minutter og skal være ferdig i et synsfelt relevant for antall mus ønsket.
- Ex-vivo-analyse er mulig etter obduksjon og samling av hjernen. Plasser hjernen på et sterilt petriskål, drypp 50-100 ul på lager luciferin på toppen, og plass innenfor den imaging boksen.
- Ferdigstille en annen åpen filter bilde på 15-17 min etter infeksjon ved gjennomføring av DLIT bildebehandling. Sikre sekvensanalyse er av og synsfelt og filter tilbakestilles til tidligere innstillinger.
3. Retur Mus og dataanalyse
- Slå av isofluran vaporizer og overføre XIC containment boksen tilbake til biosikkerhet kabinettet.
- Plasser mus tilbake innen sitt boenhet, lukker toppen, spray utvendig med egnet desinfeksjonsmiddel og sted tilbake på huset rack.
- Sikre mus har fullt restituert fra anestesi.
- Gjenta fremgangsmåten ovenfor som forsøket krever inntil imaging har fullført.
- Desinfisere BSC, slå av utstyret, og overføre alle data til en ekstern laboratorium sted for videre analyse.
- Analysere dataene og generere 3-dimensjonale bilder basert på IVIS resultater utilizing den LivingImage programvare.
- Sørg for at bildet er riktig orientert og belysning / fargebalanse er innstilt. Innenfor Tool Palette alternativene inkluderer Bildejustering, Rettelser, Bildeinformasjon, og avkastning Tools.
- Utnytte ROI figurer for å identifisere spesifikke signalstyrker basert på plassering.
- Rekonstruere overflatetopografi å markere musen kroppen, initialisere 3D DLIT gjenoppbygging, og bruke lineær skikket til å sette orgelet kartet til topografisk gjenoppbygging.
- Ytterligere viralt titrering analyse kan bli fullført gjennom samling av blod og organer. Titrering i denne studien ble fullført gjennom homogenisering av hjernevev i modifisert Eagles medium (MEM). Homogenatet ble seriefortynnet og vi infisert en 6 brønners plate av Vero-celler i 1 time. Cellene ble dekket med et 1,5% agarose/2xMEM overlegg og inkubert i 2 dager ved 37 grader. Celler ble fiksert med 10% formalin i 30 minutter og farget medkrystallfiolett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med en genmodifisert virus, TC83-Luciferase, så vi en økning i bioluminescent signalstyrke som virusreplikasjon beveger seg fra nasal regionen til de sentrale CNS (figur 1). Grunn av den høye virusreplikasjon rente, forventer vi å se høye nivåer av bioluminescent signal (figur 2A) avhengige vektoren og dyret immunrespons til vektoren. Vi forventer dette signalet økningen for å fortsette til en topp, mellom dager 5-7 etter infeksjon, i kombinasjon med virusreplikasjon peak i SNS (figur 2B). Etter signalet og viral topp, forventer vi å se en nedgang i signal både på grunn av en nedgang i virusreplikasjon og på grunn av tap av av luciferase genet. Med disse signalverdiene forventer vi å kunne kvantifisere virusmengde basert på styrken av signalet, som gir en in vivo metode for å beregne nøyaktig progressivt økende virusmengde i ett enkelt dyr Spesifikk ic til TC83-Luciferase.
Utnytte denne modellen som et middel til å analysere vaksiner og antivirale behandlinger, forventer vi å kunne påvise en forskjell mellom efficacious behandlinger basert på en reduksjon i bioluminescent signal. I vårt tilfelle, mot TC83-Luciferase, kan vi bruke IP Ampligen (en Toll-lignende reseptor 3 agonist) eller vaksinasjon tre uker før infeksjon, for å betydelig redusere viral infeksjon og bioluminescent signalet gjennom studien (Figur 3). Denne reduksjonen kan være direkte korrelert til en nedgang i virusmengde innenfor CNS (data ikke vist). Som en måte å fullt utvikle og visualisere teknologi, er IVIS programvare LivingImage stand til å lage tre-dimensjonale bilder av bioluminescent signal (figur 4) som tillater oss å lett identifisere steder med høy virusreplikasjon basert på vev dybde og komposisjon.
/ 4429/4429fig1.jpg "alt =" Figur 1 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4429/4429fig1highres.jpg "/>
Figur 1. IVIS Imaging av TC83-luciferase Tre C57BL / 6 mus ble smittet gjennom intranasal utfordring med TC83-Luciferase og avbildes på 2, 4, 6 og 8 dager etter smitte (DPI). Bilder ble gjort etter IP luciferin injeksjon med en autoexposure lengde og open filter. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Begge stammer av mus hadde lignende bioluminescent signalstyrke etter IP injeksjon av luciferin med en forsinkelse på 10 minutter etter injeksjon før avbildning ble fullført (A). Virusmengde i hjernen (pfu / gram vev) viser en sterk sammenheng gjennom smitte til biolumiescent signalet (B).
Figur 3. Behandling Sammenligning Utnytte IVIS. Behandling comarison etter TC83-Luciferase infeksjon i C3H/HeN mus. Mus immunisert med subkutan TC83 23 dager før utfordring med TC83-Luciferase presentert med ingen bioluminescent signal (A). Mus som fikk IP Ampligen på -4 og 48 hr etter infeksjon (B) viste reduserte nivåer sammenlignet mus som fikk ingen behandling (C).
Figur 4. 3-dimensjonal rekonstruksjon imaging. Utnytte 3-dimensjonal rekonstruksjon vi visualiserte toppen plasseringen av TC83-Luciferase infeksjon utnytte LivingImage er DLIT rekonstruksjon verktøy. Vi er i stand til å lokalisere den dybde og plasseringen av den primære signalet innenfor CNS bruker dette Technique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens denne protokollen dekker tenkelig aspekter for in vivo analyse, er det viktig å anerkjenne bioluminescent vektor som en nøkkelfaktor for fremtidige studier. Vår utnyttelse av TC83, en svekket vaksinestamme av VEEV, som en vektor for ekspresjon av luciferase sikrer at store mengder av enzymet blir produsert på grunn av den høye frekvensen av replikering viruset i CNS som tidligere beskrevet 1-4. Mens tilsetning av en andre subgenome promotoren og luciferase genet resulterer i ytterligere dempning av det rekombinante virus sammenlignet med villtype TC83, denne demping ikke synes å endre det kliniske forløpet av sykdommen i løpet av de første 6 dager av infeksjon 5. Vi forventer for å se et tap av luciferase genet gjennom replikasjon av viruset over tid, men igjen er dette ikke sees før senere i utviklingen av sykdommen. Utvikling av andre sykdomsfremkallende vektorer, viral og bakteriell, bekrefter potensialet og effektivitetav IVIS og luciferase tvers av flere felt av patogen forskning 6-9.
Avbildingsprosessen selv har noen kritiske trinn som må fullføres før en hel studie kan gjennomføres. En første analyse av bioluminescent styrken av vektoren bør være ferdig i en pilotstudie inneholdende en minimal gruppe av dyr. Den forventede plassering in vivo av luciferase akkumulering bør være kjent på forhånd på grunn av vektoren benyttet men forventet signalstyrken bør bestemmes før oppstart en stor studie. Med den nye programvaren en eksponering lengde analyse er ikke så nødvendig på grunn av automatisk eksponering deteksjon funksjonen nå bygget inn i programvaren, men en tidsforsinkelse basert på injeksjon av luciferin vil fortsatt må være bestemt. Selv med alle disse signal beregninger kan bioluminescent deteksjon bli begrenset på grunn av vektor dybde og generelle dyr pigment og pels. Vi anbefaler på det sterkeste barbering av dyr before bildebehandling begynner å få det sterkeste signalet mulig.
Selv sto for vektor demping og enzym produksjon, tror vi at vi har utviklet en nøyaktig og mer effektiv modell utnytte luciferase da kunne bli generert med en standard fluorescerende molekyl system for in vivo-analyse. Bioluminescens er ikke begrenset av å ha en initierende lyskilde, som i utgangspunktet skal passere gjennom vev resulterer i et tap av signal. Det heller ikke har de høye bakgrunn auto fluorescerende problemene sett med mus på pelsen og selv fra kostholdet. Risikoen for toksisitet fra luciferin underlaget er lett kontrolleres gjennom riktig filtrering og dosering, noe som gjør bioluminescent like trygt for dyret. Både lysstoffrør og bioluminescent systemer kan drastisk redusere dyr bruk på grunn av in vivo-analyse som vil være viktig for fremtidig forskning på grunn av skiftende politiske holdning til dyreforsøk og videre tilslutning til Nynnee er 3R (erstatning, reduksjon, raffinement) mot dyr bruk 10.
For vår anvendelse av viral patogenese og antiviral effekt analyse, in vivo modellering er mer effektiv enn dagens systemer 11,12 for flere grunner. Vi er i stand til å oppdage spesifikke viktige skritt for sykdomsutvikling, CNS invasjon 1 i tilfelle av TC83, før noen klinisk sykdom utvikler seg. Fra første invasjonen deteksjon, er vi i stand til å gjentatte ganger visualisere i en enkelt dyr spredning og replikering av viruset som gir en mer nøyaktig måte å studere sykdomsprogresjon 5. Modellen vi har utviklet er også tryggere for forskere på grunn av redusert kravet offer og orgel samling, evnen til å gjenkjenne viktige sykdomsprogresjon poeng før klinisk sykdom kan føre til dyr irritabilitet, og spesielt for vårt system, kan vi fullføre disse studiene i en svekket virusvektor i ABSL2 istedenfor ABSL3utnytte en utvalgt agent.
Fremtidig sykdom studier vil i økende grad benytte bioluminescent IVIS modellering. Fremskritt i moderne molekylærbiologiske teknikker og kloning tillate innsetting av en luciferase genet raskt og billig i begge viral og bakteriell vektorer. Evnen til å utvikle transgene mus uttrykker en promoter avhengig luciferase genet tilveiebringer også et annet system for bioluminescent studie. Endelig reagerer nyutviklede bioluminiserende sonder som Calipers RediJect Betennelse probe med myeloperoksidase muliggjør in vivo visualisering av phagocyte betennelse reaksjon. Disse nye teknologiene kombinert med økt effektivisering av kameraene og programvare gjør bioluminescent IVIS et levedyktig system for fremtidig forskning på mange ulike fagfelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Institutt for Translasjonell Sciences UTMB-NIH stipend 1UL1RR029876-01 og Alisha Prather for hennes assistanse med videoredigering for dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
