Summary
Bir roman olarak lusiferaz ve in vivo görüntüleme sistemleri (IVIS) olarak kullanılması klinik gelişmeler ortaya çıkmadan hastalığın bitiş noktaları tespit etmek anlamına gelir. IVIS bizim gelecekteki çalışma için daha doğru bir hastalık modeli sağlayan, gerçek zamanlı olarak birden fazla gün içinde encephalitic virüs istilasına görselleştirmek için izin verdi. Bu da bize daha hızlı şu anda kullanılan hayvan modellerinde daha antiviral ve aşıların potansiyel koruyucu özellikleri tanımlamak için izin verdi. Çoklu zaman puan üzerinden bireysel hayvanların kullanmak için yeteneği azalmış hayvan gereklilikleri, masraflar ve hastalık çalışmanın daha insancıl ve bilimsel yöntemlerle sağlanması yararlanılan hayvanlar genel morbidite sağlar.
Abstract
Görüntüleme teknolojisi Modern gelişmeler viral araştırmalar gerçekleştirilir şekilde daha da geliştirilmesi ve arıtma teşvik. Başlangıçta Hume'un 3R'si yılında Russel ve Burch tarafından önerilen (değiştirilmesi, azaltılması, arıtma), bilimsel araştırma hayvan modellerinin kullanımı bilimsel doğruluk ve hız artırırken hayvan kullanımını azaltmak için yeni yöntemler belirlemek için sürekli baskı altındadır. Hume'un sorumlularına büyük bir meydan okuma Ancak, hayvan hastalıklarının morbidite ve genel numaraları azaltırken çalışmalar istatistiksel olarak doğru olduğundan emin olmak için nasıl. Aşı etkinlik çalışmaları şu anda istatistiksel olarak anlamlı kabul edilebilmesi için çok büyük bir hayvan sayısı gereklidir ve sıklıkla immün koruma tanımlanması için yüksek morbidite ve mortalite uç ile sonuçlanabilir. Biz giderek bir ence ile merkezi sinir sistemi (MSS) işgali izlemek için bir ateş böceği bioluminescent enzim ile birlikte in vivo görüntüleme sistemleri (IVIS) kullanılmıştırbir fare modelinde phalitic virüs. Tipik olarak, hastalık yavaş ilerler, bununla birlikte virüs replikasyonu, özellikle merkezi sinir sistemi içinde, hızlı ve sık sık, ölümcül sonuçlara yol açabilir. TC83-Luc ile farelerin intranazal enfeksiyonu takiben, zayıflatılmış bir Venezüella ensefaliti virüsü suşu bir lusiferaz gen ifade değiştirilmiş, biz en az üç gün klinik hastalık belirtilerinin gelişiminden önce beynin içindeki virüs replikasyonu görselleştirmek edebiliyoruz. Biz klinik semptomlar ortaya çıkmadan önce hızlı TC83-Luc enfeksiyona karşı tedavi ve aşı koruması tespit edebiliyoruz bir anahtar encephalitic hastalık gelişimi nokta olarak MSS işgali kullanılması. IVIS teknolojisi ile hayvan sayıları ve morbiditeyi azaltırken uyuşturucu tedavi ve aşıların hızlı ve doğru test göstermek edebiliyoruz.
Protocol
1. Hayvan Hazırlama
- Hayvan Varış: Hayvan biyogüvenlik seviye 2 (ABSL2) tesislerine girişte, hayvanlar da yeni ortama gelmesini 2 gün en az izin. Bu dinlenme döneminin ardından, onların sağlık ve genel fiziksel görünümünü değerlendirmek için hayvanlar inceleyin.
- Floresan gazetecilere kullanarak zaman GI otofloresans ve arka sinyal miktarını sınırlamak için bir yonca ücretsiz diyet tüm hayvansal konularda yerleştirmek önemlidir.
- Hayvanlar Tıraş: görüntüleme sırasında kranial bölgeden tespit bioluminescent sinyal artırmak için; tüm hayvanların kafaları traş ediyorum. Oksijen gaz karışımı ile anestetize hayvanlar izofluran ve buharlaştırılır. Hayvanlar tamamen uyuşturulduktan olunca, başlarını traş elektrikli makasları kullanın. Bir kez tıraş ile bitmiş, kendi kafesleri hayvanların dönmek ve anestezi etkisinden tam iyileşme için gözlemlemek.
- Bio Medic VeriSistemleri (KMY) transponder ekleme (hayvanlar tamamen uyuşturulduktan ise farelerin tıraş ardından gerçekleşmek üzere): daha az invazif yöntemlerin için önceden programlanmış BMDS kablosuz transponder her fare dorsal bölgede subkütan sıcaklığı implant izlemek için. Bunlar, transponder kablosuz kimlik ve sıcaklık kayıt için izin verir. Transponder, implantasyonu takiben yara bir veteriner dereceli doku yapıştırıcısı uygulayın.
- Temel toplama: Enfeksiyon önce, tüm hayvanlar için bir temel sıcaklık ve ağırlık kaydedin. Fareler anestezi altında iken retro-orbital (RO) sızdırma yoluyla plak redüksiyon nötralizasyon testi (PRNT) analizi için kan toplayın. Kan toplama takiben, potansiyel sekonder bakteriyel enfeksiyon azaltmak için veteriner antibiyotikli göz merhemi uygulanır. Bu, temel toplama hayvanlar fareler üzerinde meydana gelen gerilme ile anestezi altına yerleştirilir sayısını dikkate alınarak, tamamlanması gerekmektedir. Gelecek RO koleksiyonları sfare anestezi altında iken hould, görüntüleme sonra tamamlanacak. Bir RO elde edilen maksimum kan 200 ul civarında olmalıdır.
- Enfeksiyon: Daha önce tarif edildiği gibi anestezi altında yer fareler. Fosfat ile sulandırılmış 40 ul toplam hacim içinde-Lusiferaz TC83 5x10 6 ila 5x10 pfu 7 arasında bir doz kullanılarak burun içi yolu üzerinden inoküle intranazal enfeksiyon ile (PBS) Tamponlu Tuzlu. HIV bulaştıktan sonra, kendi konut kafes içinde fareler yerleştirin ve kurtarma gözlemlemek.
2. Hayvan Görüntüleme
Yasal Uyarı: Onların konut ünitesi, biyogüvenlik kabini (BSC), veya her zaman XIC çevreleme kutu içinde fare tutun. Bu protokol için onaylanmış BSC'ler Sınıf II Tip B1 veya B2 vardır.
- 15 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda, intraperitoneal (ip), luciferase ve vücut ağırlığının gramı başına 10 ul ile tüm hayvanlar enjekte edilir.
- Fareler injecte Ampligen kabul edilmelidirkendi grup dayalı -4 saat sonrası enfeksiyon veya +48 saat sonrası enfeksiyona 12.5 mg / kg vücut ağırlığı dozunda d IP.
- Önceki luciferase ile enjeksiyon, XIC-3 çevreleme kutusu içinde uygun bir uyum sağlamak için üç gruba fareler ayırın.
- Tüm görüntüleme için prosedür boyunca korneanın kurumasını önlemek için göz merhemi / yağlayıcı kullanmaktadır.
- LivingImage yazılım ve basın görüntüleme kutusu hazırlamak için Initialize açın; seti otomatik kaydetme, otomatik maruz kalma süresinin (otomatik LivingImage yazılım 3.2 ve daha yeni yeni bir özellik üzerinde pozlama süresi), C alanını görüntülemek ve açmak için filtre; alanı bakış Eğer görüntüleme vardır farelerin sayısı üzerine dayanır ve diğer görüntüleme projeleri için gerekli olduğu gibi filtre optimize edilebilir.
- Hava, kömür filtrelerde dolmamış olması onaylayın, oksijen deposu dolu ve izofluran rezervuar doldurulur. XIC-3 i elektrik bandı küçük şeritler yerleştirinHangi solation kutusunu görüntüleme sırasında hayvan hareketlerini azaltarak yardımcı olmaktadır.
- 3-5 dakika İzofluran indüksiyon odasında (kapak açık değilken) içindeki bölüm 2.1 ve yerde açıklandığı gibi luciferase IP ile fareler enjekte.
- 5 dakika sonra, indüksiyon odasının kapağını kapatın ve İzofluran akışı başlar. Anestezik yaklaşık 2.0 L / dk oksijen akış hızı set ile yaklaşık% 3-5 işletilmektedir. Bir kez tam olarak bilinçsiz bir ek 30 saniye bekleyin ve XIC-3 izolasyon kutusuna fare aktarın. Bu prosedür indüksiyon odasında (IVIS birim kendi Pasif Fuarı kutu ve XIC-3 çevreleme kutusuna doğrudan içinde / soketleri üzerinden bağlanır içeren gelen izofluran kaybı içerecektir olarak kullanılmaktadır biyogüvenlik kabini izofluran atma güvenli olanak sağlayın ) içerdiği anestezik akışını sağlamak için.
- Bir bağlı izofluran konektör ile XIC-3 izolasyon kutusu içine çip / grup sayısı dayalı fareler aktarınd açın. Onlar yavaşça bant şeritlerini üzerine oturtulmuş başkanları ile sternum yatabilme ortaya koyulur böylece fareler yerleştirin.
- Cavicide ile etanol, sprey eller ve XIC-3 alt ile XIC muhafaza kutusundan silin ve IVIS görüntüleme odasına aktarın. Bir kez görüntüleme ünitesi içindeki çevreleme kutusuna anestezi bağlayın.
- Sonra luciferase ve enjeksiyonu takiben 10 dk, canlı görüntü yazılımı ile görüntü fareler.
- Açık bir filtre ile ilk görüntüleme takiben, Dizi analizi ve bioluminescent ateşböceği lusiferaz için Resim Sihirbazı kurulumu kullanarak bir DLIT 3-Boyutlu görüntüleme başlatmak. Bu görüntüleme işlemi 4-5 dk sürer ve istenen farelerin sayısı için ilgili bir görüş alanı az tamamlanması gerekmektedir.
- Ex-vivo analiz beyin nekropsi sonra mümkündür ve koleksiyonudur. Steril bir Petri kabı beyin yerleştirin, ima içinde 50-100 üstüne stok luciferase ul ve yerine damlakutusu ging.
- DLIT görüntüleme tamamlandıktan sonra 15-17 dk sonrası enfeksiyon ikinci bir açık filtre görüntüyü Finalize. Dizi analizi kapalı olduğundan emin olun ve görünümü ve filtre ayarları alanında önceki ayarlarına geri döner.
3. Dönüş Fareler ve Veri Analizi
- Izofluran buharlaştırıcı kapatın ve biyogüvenlik kabini geri XIC çevreleme kutusu aktarın.
- Kendi konut ünitesi içinde geri fareler yerleştirin, geri gövde rafına uygun dezenfekte edici ve yer ile dış sprey, üst kısmını kapatın.
- Olun fareler tamamen anestezi kurtarıldı.
- Görüntüleme tamamlanıncaya kadar deneme gerektirir yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
- , BSC dezenfekte ekipmanı kapatın ve daha fazla analiz için bir dış laboratuar konuma tüm veri aktarmak.
- Veri Analizi ve IVIS sonuçları uti dayalı 3 boyutlu görüntüler oluşturmakLivingImage yazılımı lizing.
- Görüntü düzgün odaklı ve ışıklandırma / renk dengesi ayarlanmış olduğundan emin olun. Aracı Palet içinde seçenekleri Görüntü, ayarlayın Düzeltmeler, Görüntü Bilgi ve YG Araçları içerir.
- Konuma dayalı spesifik sinyal gücünü belirlemek için ROI şekiller yararlanın.
- , Fare vücut vurgulamak için yüzey topografyası Yeniden İnşa 3D DLIT yeniden başlatmak ve topografik rekonstrüksiyonuna organı haritayı ayarlamak için lineer uygun kullanın.
- Ayrıca viral titrasyon ölçümü, kan ve organlarının toplanması yoluyla tamamlanabilir. Bu çalışmada Titrasyon modifiye kartal orta (MEM) beyin dokusunun homojenizasyon ile tamamlanmıştır. Homojenat, seri olarak seyreltildi ve 1 saat boyunca Vero hücreleri 6 plaka enfekte edildi. Hücreler,% 1.5 agarose/2xMEM kaplaması ile kaplanmış ve 37 derece az 2 gün için inkübe edilmiştir. Hücreler 30 dakika için% 10 formalin ile sabitlenmiş ve lekelikristal viyole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virüs çoğaltma merkezi sinir sistemi (Şekil 1) içine nazal bölgesinden hareket ederken bir genetiği değiştirilmiş virüs ile, TC83-Lusiferaz, biz bioluminescent sinyal gücü bir artış gördüm. Yüksek viral replikasyon hızı nedeniyle, vektör ve vektör hayvan bağışıklık yanıtı bağlı bioluminescent sinyal düzeyi yüksek (Şekil 2A) görmek için bekliyoruz. Biz CNS içindeki viral replikasyon pik (Şekil 2B) ile birlikte, günde 5-7 sonrası enfeksiyon arasındaki, bu sinyal artışı zirve devam etmesini bekliyoruz. Sinyal ve viral zirve sonrasında, viral replikasyon azalma nedeniyle ve lusiferaz gen kaybı nedeniyle iki sinyalinde azalma görmek için bekliyoruz. Bu sinyal değerleri ile biz doğru tek bir hayvan Şartname giderek artan viral yükü hesaplamak için in vivo yöntemi bir sağlayarak, sinyal gücü dayalı viral yük ölçmek mümkün bekleyebilirsiniz TC83-Lusiferaz için ic.
Aşılar ve antiviral tedavileri analiz etmek için bir araç olarak bu modeli kullanarak, biz bioluminescent sinyal azalma dayalı etkili tedaviler arasında bir fark tespit edebilmek için bekliyoruz. TC83-Lusiferaz karşı durumda, önemli ölçüde çalışma boyunca viral enfeksiyon ve bioluminescent sinyal (Şekil 3) azaltmak için, enfeksiyondan önce IP Ampligen (Toll-benzeri reseptör 3 agonisti) veya aşılama üç hafta kullanabilir. Bu azalma doğrudan MSS (veriler gösterilmemiştir) içinde viral yükte azalma ile korele edilebilir. Tamamen teknoloji geliştirmek ve görselleştirmek için bir yol olarak, IVIS yazılım LivingImage bize kolayca doku derinliği ve kompozisyon dayalı yüksek viral replikasyon konumlarını belirlemek için izin verir bioluminescent sinyal (Şekil 4) 3-boyutlu görüntüler yapma yeteneğine sahiptir.
/ 4429/4429fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4429/4429fig1highres.jpg "/>
Şekil 1. TC83-Lusiferaz Üç C57BL / 6 farelerin IVIS Görüntüleme intranazal 2'de TC83-Lusiferaz ve görüntülü ile meydan, 4, 6 ve 8 gün sonrası enfeksiyon (DPI) ile enfekte edildi. Görüntüler otomatik diyafram uzunluğu ve açık filtre ile IP luciferase enjeksiyonu takiben yapılmıştır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Görüntüleme (A) tamamlanmadan önce Şekil 2. Farelerin iki suşları 10 dakika sonrası enjeksiyon bir gecikme ile luciferase IP enjeksiyonu takiben benzer bioluminescent sinyal gücü vardı. Beyin viral yük (pfu / gram doku) biolumiescent sinyali enfeksiyon boyunca kuvvetli bir korelasyon göstermektedir (B).
Şekil 3,. Tedavi Karşılaştırılması IVIS kullanılması. Tedavi comarison C3H/HeN farelerde TC83-Lusiferaz enfeksiyonunu takiben. Fare hiçbir bioluminescent sinyal (A) ile başvurdu TC83-Lusiferaz ile meydan 23 gün önce subkutan TC83 ile immünize. -4 Ile +48 saat sonrası enfeksiyona IP Ampligen alma Fare (B) tedavisi (C) alan farelere kıyasla düşük seviyelerde gösterdi.
Şekil 4. 3-Boyutlu rekonstrüksiyon görüntüleme. 3-Boyutlu yeniden kullanmak biz LivingImage en DLIT rekonstrüksiyon aracı kullanan TC83-Lusiferaz enfeksiyon pik konumu görüntülendi. Biz bu te kullanan CNS içindeki derinliği ve birincil sinyal yerini lokalize edebiliyoruzchnique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol vivo analizi için görüntüleme yönlerini kapsar iken, gelecekteki çalışmalar için önemli bir faktör olarak bioluminescent vektör tanımak önemlidir. Lusiferaz ifadesi için bir vektör olarak TC83 oluşan kullanımı, VEEV zayıflatılmış bir aşı suşu, enzim büyük miktarlarda 1-4 daha önce tarif edildiği gibi merkezi sinir sistemi içinde, virüsün yüksek çoğaltma oranına bağlı üretilmektedir sağlar. Rekombinant virüsün daha fazla zayıflatılması, ikinci bir alt genomik promotör ve lusiferaz gen sonuç ilave vahşi tip TC83 ile karşılaştırıldığında, ancak bu azalma enfeksiyon 5 ilk 6 gün içinde hastalığın klinik seyri değiştirmek için görünmez. Bu beklemek Zaman içinde, virüs replikasyonu ile lusiferaz geninin bir zarar görmeye fakat yine bu hastalığın gelişme kadar daha sonra görülmemektedir. Viral ve bakteriyel diğer patojen vektörler, geliştirilmesi potansiyeli ve verimliliği teyitpatojen araştırma 6-9 çoklu tarlalardan IVIS ve lusiferaz arasında.
Görüntüleme işlemi kendisi bir tam çalışma uygulanmadan önce tamamlanması gereken birkaç kritik adımlar vardır. Vektörün bioluminescent güç bir ön analizi hayvanlar en az bir grup içeren bir pilot çalışma içinde tamamlanmalıdır. Lusiferaz birikim in vivo olarak beklenen yer geniş bir çalışma başlamadan önce tespit edilir önceden kullanılan vektör ancak beklenen sinyal gücü nedeniyle bilinmelidir. Yeni yazılım ile bir pozlama süresini analiz yazılımı şimdi ama luciferase arasında enjeksiyon dayalı bir zaman gecikmesi yerleşik otomatik pozlama algılama özelliği nedeniyle gerekli değildir hala tespit edilmesi gerekir. Hatta bu sinyal hesaplamaların tüm biyolüminesens algılama hala vektör derinliği ve genel hayvan pigment ve kürk nedeniyle sınırlı olabilir. Önemle hayvanların befor tıraş tavsiyeE görüntüleme mümkün olan en güçlü sinyali kazanmaya başlar.
Hatta vektör zayıflama ve enzim üretimi için muhasebe, biz lusiferaz sonra in vivo analizi için standart bir floresan molekül sistemi ile oluşturulmuş olabilir yararlanarak doğru ve daha verimli modeli tasarlanmıştır inanıyorum. Bio-ışıldama, başlangıçta sinyal kaybı ile sonuçlanan doku içinden geçmesi gereken bir başlatıcı ışık kaynağına sahip olan bir ile sınırlı değildir. Aynı zamanda onların kürk ve hatta kendi diyet farelerde görülen yüksek arka plan otomatik floresan problem yok. Luciferase substrattan toksisitesi riski kolaylıkla hayvan gibi güvenli biyolüminesens yapma, uygun filtrasyon ve doz ile kontrol edilir. Floresan ve bioluminescent sistemlerinin her ikisi de büyük ölçüde nedeniyle değişen siyasi tavrı hayvan araştırma ve Hum daha fazla bağlılık yönelik gelecekteki araştırmalar için önemli olacaktır vivo analizi nedeniyle hayvan kullanımını azaltabilirsinizhayvan kullanımını 10 doğru e'nin 3R (değiştirilmesi, azaltılması, arıtma).
Viral patogenez ve antiviral etkinliği analizi bizim uygulama için, in vivo modelleme birden nedenlerle mevcut sistemler 11,12 daha verimlidir. Herhangi bir klinik hastalığın gelişme önce hastalık gelişimi, TC83 durumunda CNS istila 1 için spesifik bir anahtar adımlar tespit etmek mümkün bulunmaktadır. İlk işgali algılama, biz tekrar tekrar tek bir hayvan virüsün yayılmasını ve replikasyon hastalığın ilerlemesi 5 okuyan daha doğru bir araç sağlayan görselleştirmek edebiliyoruz. Biz tasarladık modeli aynı zamanda fedakarlık ve organ toplama, klinik hastalık hayvan sinirlilik neden olabilir önce anahtar hastalığın ilerlemesi noktalarını tespit yeteneği ve bizim sisteme özgü azalma gereksinimi nedeniyle araştırmacılar için daha güvenli olduğu için, bu çalışmalar tamamlayabilirsiniz yerine ABSL3 arasında ABSL2 olarak zayıflatılmış bir viral vektör olarakseçkin bir ajan kullanarak.
Gelecekteki hastalığı çalışmalar giderek bioluminescent IVIS modelleme kullanacak. Modern moleküler biyoloji teknikleri ve klonlama gelişmeler viral ve bakteriyel vektörlerin hem içine hızlı ve ucuza bir lusiferaz gen ekleme sağlar. Bir promotör bağımlı lusiferaz gen eksprese eden transjenik farelerin geliştirme olanağı da biyolüminesans çalışma için başka bir sistem sağlar. Sonunda, öyle Kumpaslar RediJect iltihap prob olarak yeni geliştirilen bioluminescent probları miyeloperoksidaz fagosit iltihabı reaksiyon vivo görselleştirme için izin ile reaksiyona girer. Kameralar ve yazılımın artan verimliliği ile birlikte bu yeni teknolojiler bioluminescent IVIS çalışmanın birçok farklı alanda gelecekteki araştırmalar için uygun bir sistem yapar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu makale için video düzenleme ile ona yardım için Translasyonel Bilimleri UTMB-NIH hibe 1UL1RR029876-01 ve Alisha Prather Enstitüsü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
